הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

Luminophore-צורה הייצורים החיים השונים של אלבומין שור על-ידי איגוד של Gold(III)

6.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/58141

⸱

31 באוגוסט 2018

 , 
1Department of Physics and Optical Science, Center for Biomedical Engineering & Science, University of North Carolina

במאמר זה

סיכום

הפרוטוקולים ללמוד את הכריכה של קטיונים זהב (Au(III)) כדי הייצורים החיים השונים של אלבומין שור (BSA), כמו גם אפיון הסתגלותי התלויים את ייחודי BSA-Au פלורסצנטיות מוצגים.

תקציר

המטרה של הפרוטוקולים הציג היא ללמוד את התהליך של Au(III) מחייב BSA, מניב פלואורסצנטי אדום הנוצרות על-ידי שינוי קונפורמציה (λem = 640 ננומטר) של מתחמי BSA-Au(III). השיטה מתאימה את ה-pH להראות כי הופעתה של פלואורסצנטי אדום הוא מתואם עם מעברים pH-induced שיווי משקל של הצורות BSA. קומפלקסים BSA-Au(III) ניאון אדום יכול להיווצר רק עם התאמה של pH או שמעליו 9.7, המתאים קונפורמציה "-טופס" BSA. פרוטוקול כדי להתאים את BSA ליחס טוחנת Au וכדי לפקח הקורס-הזמן של התהליך של איגוד Au(III) מתואר. המספר המינימלי של Au(III) לכל BSA, כדי לייצר את פלואורסצנטי אדום, הוא פחות מ 7. אנו מתארים את הפרוטוקול בשלבים כדי להמחיש את הנוכחות של מספר אתרי קישור Au(III) ב- BSA. הראשון, על-ידי הוספת נחושת (Cu(II)) או ניקל (קטיונים Ni(II)) ואחריו Au(III), שיטה זו מגלה אתר איגוד עבור Au(III) זה לא fluorophore אדום. שנית, על ידי שינוי BSA מאת תיול מיצוי סוכנים, מתגלה אתר איגוד Au(III) להיוות nonfluorophore אחר. שלישית, שינוי קונפורמציה של BSA על ידי ביקוע וכיסוי מכבלי דיסולפידי, מומחשים את האתר של איגוד Au(III) אפשרי. הפרוטוקול המתואר, כדי לשלוט BSA הייצורים החיים מחייב Au(III), ניתן להחיל כלל ללמוד את האינטראקציות של האחר חלבונים ו קטיונים מתכת.

מבוא

תרכובת BSA-Au בתערוכה של אולטרה סגול (UV)-טמפרמנט פלואורסצנטי אדום, עם יוצא מן הכלל סטוקס shift, יש להיות מסונתז במקור מאת Xie ואח. 1. פלואורסצנטי אדום ייחודי ויציבה יכול למצוא יישומים שונים בתחומים כגון חישה2,3,4,5,6,7הדמיה או ננו-רפואה8 ,9,10,11,12,13. תרכובת זו נחקרה בהרחבה על ידי חוקרים רבים בתחום של ננו-מדע בשנים האחרונות14,15,16. המתחם BSA-Au פירשו Au25 nanoclusters. מטרת השיטה הציג היא לבחון את תרכובת זו בפירוט וכדי להבין ממה פלואורסצנטי אדום. לפי הגישה שהוצגו, הנוכחות של אתרים מרובים Au מחייבת, ומקור פלורסצנטיות, תחליף התגרענות יחיד-האתר של Au25 nanoclusters, ניתן לתיאור. אותה גישה יכול להיות מועסק כדי ללמוד איך אחרים חלבונים17,18,19 ומורכבת עם Au(III) יכול לשנות את המאפיינים פלורסנט פנימי שלהם.

הסינתזה של המתחם BSA-Au אדום-פלורסנט מחייבת פקד הצרים של היחסים טוחנת של BSA כדי Au (BSA:Au) על מנת למקסם את עוצמת קרינה פלואורסצנטית ואת המיקום של הפסגות עירור פליטה מפה (EEM)20. ניתן להראות כי מספר אתרי קישור קיים עבור Au(III) לאגד, כולל קטע אספרגין (או Asp שבר, שאריות חומצה אמינית ארבע הראשונות ב- N-הסופית של BSA)21,22. חומצת אמינוth 34 ביותר של BSA (Cys-34) מוצג גם לתאם Au(III), להיות מעורב המנגנון של ה fluorescence([Cys34-capped-BSA]-Au(III)) אדום20. על ביקוע כל Cys-Cys קשרי דיסולפידי וכיסוי כל זריחה תיולים, אדום אינו מיוצר ([all-thiol-capped-BSA]-Au(III)). אפשרות זו מציינת בצורך של Cys-Cys דיסולפידי חוב כמו האתר של איגוד Au(III) כדי לייצר את פלואורסצנטי אדום.

טכניקות הכימיה חלבון לא היה בשימוש נרחב כדי ללמוד את מתחמי BSA-Au(III) בקהילה ננו-מדע. עם זאת, זה יהיה יקר להעסיק את הטכניקות הללו כדי להבין היבטים מסוימים של אלה מתחמי, כמו גם כדי להשיג הבנה מפורט של האתרים מחייב Au(III) BSA. מאמר זה נועד להראות כמה טכניקות אלה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. סינתזה של קומפלקס BSA-Au(III)

  1. להמיס 25 מ ג של BSA ב 1 מ"ל מים כיתה ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC) בקבוקון התגובה מ.
    הערה: הפתרון אמור להופיע ברורים.
  2. להמיס זהב (III) כלוריד trihydrate (חומצה chloroauric) כדי ריכוז של 5 מ מ ב- hplc, קורס כיתה מים.
    הערה: הפתרון אמור להופיע צהוב. Chloroauric תמיסה חומצית מוכן בריכוז זה יגרום BSA Au יחס של 1:13.
    1. לחלופין, להכין פתרון של חומצה chloroauric עם ריכוז של מקום בין 0.38 מ מ (BSA:Au = 1:1) כדי 20 מ מ (BSA:Au = 1:50) ב- hplc, קורס כיתה מים.
      הערה: יחסים שונים של BSA לזהב תגרום דפוסים שונים באופן קיצוני פלואורסצנטי אדום של המפה עירור פליטה.
  3. הכנס את המבחנה התגובה של BSA באמבט מים 37 ° C ומערבבים נמרצות-750 סל ד באמצעות של פגים.
  4. מיד לאחר ערבוב מתחילה, להוסיף 1 מ"ל של חומצה chloroauric הפתרון. הצבע של הפתרון צריך לשנות מן ברור לצהוב.
  5. מערבבים את התערובת למשך 2 דקות 37 ° C ובבית 750 סל ד באמצעות של פגים.
  6. לתוך המבחנה התגובה, להוסיף 100 μL של 1 M NaOH הפתרון להביא את ה-pH ל-12.
    הערה: מיד לאחר הוספת NaOH, הפתרון צריך דארקן מעט כדי צהוב-חום ולאחר מכן הפעל חזרה לצהוב.
  7. להמשיך לבחוש ב- 750 סל ד עבור 2 h וב -37 מעלות צלזיוס. הפתרון צריך לשנות לאט מצהוב לצבע צהוב/חום כהה. שינוי צבע זה מציין היווצרות של BSA-Au(III) ואזוריט אדום מורכבות.
  8. לאפשר את הדגימה לשבת בטמפרטורת החדר במשך יומיים, הפתרון ימשיך דארקן לחום אמבר, יגביר עוצמת קרינה פלואורסצנטית.
    1. לחלופין, תן את הדגימה להמשיך לבחוש ב 37 ° C 12 h יותר הצבע של הפתרון מתפתח ענבר חום.

2. סינתזה של BSA-Cu(II)-Au(III)

  1. להמיס 25 מ ג של BSA ב 1 מ"ל של מים כיתה HPLC. הפתרון אמור להופיע ברורים.
  2. להמיס וגופרית והרכבו כלוריד (II) נחושת במים כיתה HPLC כדי ריכוז של 5 מ מ. הפתרון אמור להופיע אור כחול.
  3. להוסיף 1 מ"ל של התמיסה המימית BSA בקבוקון תגובה 5 מ"ל, מניחים באמבט מים בטמפרטורה 37 º c מערבבים את התערובת במהירות של 750 סל ד.
  4. מיד מוסיפים 0.5 מ"ל של הפתרון וגופרית והרכבו כלוריד הנחושת (II) למבחנה התגובה ומערבבים למשך 2 דקות. הפתרון יישאר אור כחול.
  5. הוסף μL 75 של NaOH M 1 כדי להביא את ה-pH 12 ולאפשר לערבב כבר שעתיים. הפתרון יהיה סגול.
  6. להמיס חומצה chloroauric במים כיתה HPLC כדי ריכוז של 5 מ מ.
  7. להוסיף 0.5 מ ל חומצה chloroauric מימית המבחנה התגובה ולהתאים את רמת החומציות בחזרה ל- 12 באמצעות 1 M NaOH.
  8. מערבבים את תערובת התגובה כבר שעתיים.
    הערה: הפתרון צריך להתפתח לצבע חום.

3. סינתזה של BSA-Ni(II)-Au(III)

  1. להמיס 25 מ ג של BSA ב 1 מ"ל של מים כיתה HPLC. הפתרון אמור להופיע ברורים.
  2. להמיס ניקל (II) כלוריד hexahydrate במים כיתה HPLC כדי ריכוז של 5 מ מ. הפתרון אמור להופיע אור ירוק.
  3. להוסיף 1 מ"ל של התמיסה המימית BSA בקבוקון התגובה מ ל, במקום באמבט מים בגיל 37 oC. מערבבים את התערובת במהירות של 750 סל ד.
  4. מיד להוסיף 0.5 מ"ל של הפתרון hexahydrate כלוריד ניקל (II) התגובה המבחנה, מערבבים למשך 2 דקות.
    הערה: הפתרון יישאר אור ירוק.
  5. הוסף μL 75 של NaOH M 1 כדי להביא את ה-pH 12 ולאפשר לערבב כבר שעתיים.
    הערה: הפתרון יהיה בצבע צהוב כהה.
  6. להמיס חומצה chloroauric במים כיתה HPLC כדי ריכוז של 5 מ מ.
  7. להוסיף 0.5 מ של החומצה chloroauric מימית המבחנה התגובה ולהתאים את רמת החומציות בחזרה ל- 12.
  8. מערבבים את תערובת התגובה כבר שעתיים.
    הערה: הפתרון צריך להתפתח לצבע חום.

4. סינתזה של [Cys34-capped-BSA]-Au(III)

  1. לפזר 2 מ ג של N-ethylmaleimide (NEM) ב 1 מ"ל תמיסת פוספט buffered (PBS, pH 7.4).
  2. לפזר 2 מ ג של BSA ב 1 מ"ל של PBS-NEM פתרון.
  3. להעביר את הפתרון בקבוקון תגובה 5 מ"ל ומערבבים ב- 20 ° C-500 סל ד לשעה.
  4. Dialyze הפתרון באמצעות צינורות דיאליזה kDa 12 ב- 500 מ ל- PBS, זע ב-50 סל ד עם פגים בן לילה כדי להסיר unreacted NEM.
  5. להמיס חומצה chloroauric ב- PBS כדי ריכוז של 0.4 מ מ.
    הערה: הפתרון יהיה צהוב להתעלף.
  6. להעביר את המבחנה התגובה באמבט מים בטמפרטורה 37 º c מערבבים במהירות של 750 סל ד.
  7. מיד להוסיף 1 מ ל תמיסה חומצית chloroauric המבחנה התגובה ולאפשר לערבב למשך 2 דקות.
  8. להוסיף μL 75 של 1 M NaOH המבחנה התגובה כדי להביא את ה-pH 12 ולאפשר לערבב כבר שעתיים.

5. סינתזה של [all-thiol-capped-BSA]-Au(III)

  1. להכין פתרון של 2 מ' אוריאה ו-50 מ"מ אמוניום ביקרבונט (NH4HCO3, pH 8.0) במים HPLC כיתה.
  2. להמיס 3.3 מ ג של BSA ב 1 מ"ל של פתרון, העברת בקבוקון התגובה מ ל לעיל.
  3. להפוך את פתרון מניות של 0.25 M tris(2-carboxyethyl) פוספין (TCEP) על ידי המסת 62.5 מ"ג של TCEP ב 1 מ"ל של מים HPLC.
  4. להוסיף הפתרון מניות של TCEP המבחנה התגובה עד הריכוז הסופי של TCEP 8 מ מ.
  5. דגירה הפתרון באמבט מים עבור h 1 ב 50 º C. מערבבים במהירות של 500 סל ד באמצעות של פגים.
  6. אפשר לתמיסה להתקרר לגמרי לטמפרטורת החדר.
  7. להכין פתרון מניות של 100 מ מ NEM על ידי המסת 12.5 מ"ג NEM ב 1 מ"ל של מים כיתה HPLC.
  8. הוסף הפתרון מניות של NEM למבחנה התגובה עד הריכוז הסופי של NEM הוא 16 מ מ.
  9. לאפשר את הפתרון לשלב עבור 2 h ב- 20 ° C. מערבבים במהירות של 500 סל ד.
  10. Dialyze הפתרון באמצעות אבובים דיאליזה 12 kDa, תוך ערבוב את הפתרון ב-50 סל ד עם פגים לילה ב- 500 מ"ל של 50 מ מ NH4HCO3 כדי להסיר עודפי TCEP NEM, אוריאה.
  11. לעבור את המבחנה התגובה באמבט מים בטמפרטורה 37 ° C ומערבבים במהירות של 750 סל ד.
  12. להמיס חומצה chloroauric במים כיתה HPLC כדי ריכוז של 0.66 מ מ.
  13. מיד להוסיף 1 מ ל תמיסה חומצית chloroauric המבחנה התגובה ולאפשר לערבב למשך 2 דקות.
  14. הוסף 1 M NaOH עד ה-pH של התמיסה הוא 12 ולאפשר את הפתרון להמשיך לערבב כבר שעתיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

מ זריחה של המתחם BSA-Au(III), זה נצפתה זה ההמרה של קרינה פלואורסצנטית כחול מהותי של BSA (λem = 400 ננומטר) כדי פלואורסצנטי אדום (λem = 640 ננומטר) מתרחשת על pH 9.7 דרך איזון המעבר (איור 1). EEM של BSA-Au(III)-BSA שונים כדי יחסי טוחנת Au מוצגת באיור2, ומציג נתונים אלה איך לשנות את יחס טוחנת התשואות באותם אורכי גל פליטה באורכי גל שונים עירור. Cu(II), Ni(II) ו- Au(III) והשמה לאגד לאתר הידוע (ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

תרכובות BSA-Au(III) מוכן ב- pH 12 מפגינים פלואורסצנטי אדום-גל פליטה של λem= 640 nm כשהוא מתרגש עם אולטרה סגול (UV) λ אורex= 365 nm (איור 1 א'). הופעתה של פלואורסצנטי אדום הוא תהליך איטי ואת ייקח כמה ימים בטמפרטורת החדר, כדי להגדיל את העוצמה המקסימלית. מפעיל את התגובה ב 37 מעלות צלזיוס תניב את התוצאות האופטימלי, למרות הטמפרטורה גבוהה יכול לשמש כדי לייצר פלואורסצנטי אדום את מהר יותר. השפלה בלתי הפיך של החלבון יכול להתרחש בטמפרטורות מעל 45 מעלות צלזיוס

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

S.E. מאשר התמיכה של הדוכס ביקורים יוזמה מיוחדת, וולס פארגו קרן, קרן חברת פארמה, כמו גם קרנות הפעלה מ מאוניברסיטת צפון קרוליינה, שרלוט.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אלבומין בסרום בקר (BSA), 96%סיגמא-אולדריץ'A5611
זהב (III) כלוריד טריהידרט, 99.9%סיגמא-אולדריץ'520918
נחושת (II) כלוריד דיהידרט, 99.999%סיגמא-אולדריץ'459097
ניקל (II) כלוריד הקסהידרט, 99.9%סיגמא-אולדריץ'
(NEM), >99.0%Sigma-Aldrich4259
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP), >98.0%Sigma-AldrichC4706
נתרן הידרוקסיד, >98.0%Sigma-AldrichS8045
אוריאה, 99.5%Chem-Implex Int'l30142
Phospate Buffered מלח (PBS)קורנינגMT21040CV
אמוניום ביקרבונט, 99.5%סיגמא-אולדריץ'9830
654507-N-אתילמלימיד

מקורות

  1. Xie, J., Zheng, Y., Ying, J. Y. Protein-Directed Synthesis of Highly Fluorescent Gold Nanoparticles. Journal of the American Chemical Society. 131, 888-889 (2009).
  2. Saha, K., Agasti, S. S., Kim, C., Li, X., Rotello, V. M. Gold Nanoparticles in Chemical and Biological Sensing. Chemical Reviews. 112, 2739-2779 (2012).
  3. Zhang, Y., et al. New Gold Nanostructures for Sensor Applications: A Review. Materials. 7, 5169-5201 (2014).
  4. Chen, L. -Y., Wang, C. -W., Yuan, Z., Chang, H. -T. Fluorescent Gold Nanoclusters: Recent Advances in Sensing and Imaging. Analytical Chemistry. 87 (1), 216-229 (2015).
  5. Cai, W., Gao, T., Hong, H., Sun, J. Applications of Gold Nanoparticles in Cancer Nanotechnology. Nanotechnology, Science and Applications. 1, 17-32 (2008).
  6. Nune, S. K., et al. Nanoparticles for Biomedical Imaging. Expert Opinion on Drug Delivery. 6, 1175-1194 (2009).
  7. Dorsey, J. F., et al. Gold Nanoparticles in Radiation Research: Potential Applications for Imaging and Radiosensitization. Translational Cancer Research. 2, 280-291 (2013).
  8. Daniel, M. -C., Astruc, D. Gold Nanoparticles: Assembly, Supramolecular Chemistry, Quantum-Size-Related Properties, and Applications toward Biology, Catalysis, and Nanotechnology. Chemical Reviews. 104 (1), 293-346 (2004).
  9. Ferrari, M. Cancer Nanotechnology: Opportunities and Challenges. Nature Reviews Cancer. 5, 161-171 (2005).
  10. Huang, X., Jain, P. K., El-Sayed, I. H., El-Sayed, M. A. Gold Nanoparticles: Interesting Optical Properties and Recent Applications in Cancer Diagnostics and Therapy. Nanomedicine. 2, 681(2007).
  11. Arvizo, R., Bhattacharya, R., Mukherjee, P. Gold Nanoparticles: Opportunities and Challenges in Nanomedicine. Expert Opinion on Drug Delivery. 7, 753-763 (2010).
  12. Doane, T. L., Burda, C. The Unique Role of Nanoparticles in Nanomedicine: Imaging, Drug Delivery and Therapy. Chemical Society Reviews. 41, 2885(2012).
  13. Egusa, S., Ebrahem, Q., Mahfouz, R. Z., Saunthararajah, Y. Ligand Exchange on Gold Nanoparticles for Drug Delivery and Enhanced Therapeutic Index Evaluated in Acute Myeloid Leukemia Models. Experimental Biology and Medicine. 239, 853(2014).
  14. Qu, X., et al. Fluorescent Gold Nanoclusters: Synthesis and Recent Biological Application. Journal of Nanomaterials. (784097), (2015).
  15. Chakraborty, I., Pradeep, T. Atomically Precise Clusters of Noble Metals: Emerging Link between Atoms and Nanoparticles. Chemical Reviews. 117, 8208-8271 (2017).
  16. Raut, S., et al. Evidence of energy transfer from tryptophan to BSA/HSA protected gold nanoclusters. Methods and Applications in Fluorescence. 2, (2014).
  17. Le Guével, X., Daum, N., Schneider, M. Synthesis and Characterization of Human Transferrin-Stabilized Gold Nanoclusters. Nanotechnology. 22 (27), (2011).
  18. Kawasaki, H., Yoshimura, K., Hamaguchi, K., Arakawa, R. Trypsin-Stabilized Fluorescent Gold Nanocluster for Sensitive and Selective Hg2+ Detection. Analytical Sciences. 27 (6), 591(2011).
  19. Lu, D., et al. Lysozyme-Stabilized Gold Nanoclusters as a Novel Fluorescence Probe for Cyanide Recognition. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 121, 77-80 (2014).
  20. Dixon, J. M., Egusa, S. Conformational Change-Induced Fluorescence of Bovine Serum Albumin-Gold Complexes. Journal of the American Chemical Society. 140, 2265-2271 (2018).
  21. Peters, T. Jr All About Albumin. , (1996).
  22. Masuoka, J., Saltman, P. Zinc(II) and Copper(II) Binding to Serum Albumin. A Comparative Study of Dog, Bovine, and Human Albumin. Journal of Biological Chemistry. 269, 25557-25561 (1994).
  23. Takeda, K., Wada, A., Yamamoto, K., Moriyama, Y., Aoki, K. Conformational Change of Bovine Serum Albumin by Heat Treatment. Journal of Protein Chemistry. 8 (5), 653-659 (1989).
  24. Klotz, I. M., Curme, H. G. The Thermodynamics of Metallo-protein Combinations. Copper with Bovine Serum Albumin. Journal of the American Chemical Society. 70, 939-943 (1948).
  25. Fiess, H. A., Klotz, I. M. The Thermodynamics of Metallo-Protein Combinations. Comparison of Copper Complexes with Natural Proteins. J. Am. Chem. Soc. 74, 887-891 (1952).
  26. Rao, M. S. N. A Study of the Interaction of Nickel(II) with Bovine Serum Albumin. Journal of the American Chemical Society. 84, 1788-1790 (1962).
  27. Peters, T. Jr, Blumenstock, F. A. Copper-Binding Properties of Bovine Serum Albumin and Its Amino-terminal Peptide Fragment. Journal of Biological Chemistry. 242, 1574-1578 (1967).
  28. Xue, Y., Li, X., Li, H., Zhang, W. Quantifying Thiol-Gold Interactions towards the Efficient Strength Control. Nature Communications. 5, 4348(2014).
  29. Xu, Y., et al. The Role of Protein Characteristics in the Formation and Fluorescence of Au Nanoclusters. Nanoscale. 6 (3), 1515-1524 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

קישור לזהב(III)יצירת פלואורסצנציהכיוונון pHשינוי קונפורמציוניאתרי קישור למתכותכיסוי תיולפירוק קשרי דיסולפידטיפול באוריאהרדוקציה באמצעות TCEP
Luminophore-צורה הייצורים החיים השונים של אלבומין שור על-ידי איגוד של Gold(III)
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.