מאמר שיטה
Efferocytosis, הסרת phagocytic בתאים אפופטוטיים להיפגע, הוא נדרש כדי לשמור על הומאוסטזיס, בהנחייתם של רצפטורים, איתות המסלולים המאפשרים זיהוי, היבלעות של הפנמה של מוות תאים. במסמך זה, אנו מציגים מיקרוסקופ פלורסצנטיות פרוטוקול עבור כימות של efferocytosis וכן את פעילותם של efferocytic איתות המסלולים.
לומד ברגולציה של efferocytosis דורש שיטות שבהן ניתן לכמת במדויק את ספיגת בתאים אפופטוטיים להיפגע וכדי לחקור את התהליכים איתות וסלולריות השולטים efferocytosis. כימות זה יכול להיות קשה לביצוע כמו מוות תאים הם לעתים קרובות efferocytosed תקנה, ובכך המחייב שיטות אשר יכול ניסחו באופן מדויק בין החלק efferocytosed של מטרה אפופטוטיים להיפגע לעומת שיורית סלולרי unengulfed שברי. הגישה המתוארים במסמך זה מנצל כפול-תיוג גישות לכמת במדויק את הדינמיקה של קיבולת efferocytosis ו- efferocytic של efferocytes כגון מקרופאגים. ציטוזול התא מוות מסומן עם צבע התא-מעקב כדי לאפשר פיקוח על כל מוות נגזר תא החומרים, בעוד biotinylation פני השטח של התא אפופטוטיים להיפגע מאפשר בידול בין למביטה והפנמתי הלא מוות תא שברים. יכולת efferocytic של efferocytes נקבע על-ידי לקיחת תמונות פלורסנט של תאים חיים או קבוע לכימות כמות מאוגד נגד מטרות למביטה, כפי מובחנת על ידי צביעת streptavidin. גישה זו מציעה מספר יתרונות על פני שיטות כגון cytometry זרימה, כלומר את התיחום מדויק של הלא-efferocytosed לעומת efferocytosed מוות תא שברים, היכולת למדוד דינמיקה efferocytic על ידי מיקרוסקופ לחיות תאים, ו היכולת לבצע מחקרים של איתות בתאים המבטאים שכותרתו fluorescently transgenes. משולב, השיטות המתוארות ב פרוטוקול זה תשמש כבסיס לגישה ניסויית גמיש יכול לשמש כדי לכמת במדויק את פעילות efferocytic ולחקור הסלולר איתות המסלולים פעיל במהלך efferocytosis.
אפופטוזיס, או מוות תאים מתוכנת, היא תהליך פיזיולוגי מאוד מווסתות מתרחשת אצל רוב אורגניזמים רב תאיים, הוא קריטי עבור שלהם ופיתוח הומאוסטזיס1. בנוסף להיות מעורב תחלופת תאים נורמליים ופיתוח עובריים, אפופטוזיס מאפשר חיסול של תאים נגועים או פגומים של רקמות, יכולה להיות מופעלת בתגובה זיהום, דלקת, סרטן, וגם על ידי התערבויות רפואיות כגון הקרנות או סטרואידים1. מוות תאים לחשוף "לאכול-לי" אותות על פני השטח של התא, אשר מוכרים על ידי רצפטורים על מגוון של phagocytes מקצועי, בלתי מקצועיים, המכונות במקובץ "efferocytes". האירוסין של רצפטורים אלו המניע את ספיגת והשפלה של התא אפופטוטיים להיפגע על ידי efferocyte באמצעות תהליך המכונה efferoc....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
אוסף של דם מתנדבים בריאים אושרה על ידי הלוח אתיקה של אוניברסיטת מערב אונטריו מחקר מדעי בריאות. Venipuncture בוצעה בהתאם לקווים המנחים של הצהרת מדיניות Tri-המועצה על מחקר אנושי.
1. תרבות והכנה של הקו הסלולרי מונוציט THP-1
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
לילה של תאים Jurkat עם תוצאות staurosporine 1 מיקרומטר אפופטוזיס של תרבות > 95% של תאים, אשר יכולים להיות מאושרות עם Annexin V מכתים (איור 1). סוגי תאים אחרים יכול לשמש לניסויים אלה, למרות הריכוז של staurosporine, משך הטיפול staurosporine יצטרכו להיות ממוטבים עבור כל קו תא. זיהוי אמין, כימות של efferocytosis, > 80% של תאים צריך להיות אפופטוטיים להיפגע לפני הוספתן ל efferocytes. אחרים inducers של אפופטוזיס (למשל חום-הלם, etoposide, UV-אור) יכול .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
השיטות המתוארות ב פרוטוקול זה לאפשר הדמיה כימות של תהליך דינמי efferocytic, שימוש בגישות תא קבוע והן תאים חיים. גישות אלה מציעים כמה יתרונות על פני23,שיטות מבוססות cytometry זרימה הנפוצות24. השימוש מבפנים ומבחוץ מכתים עם דגימות קבוע מספק של כימות מדויק ועמיד יותר של קצב וההיקף של efferocytosis – אכן, שיטות מבוססות cytometry זרימה רבות פשוט תווית מוות תאים ו מקרופאגים עם fluorophores שונים, ו ציון efferocytosis כמו השבר של מקרופאגים מכתים שיתוף עם הסמן תא אפופטוטי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
המחברים מצהירים ללא ניגוד אינטרסים.
מחקר זה מומן על ידי קנדי מוסדות הבריאות מחקר (CIHR) הפועלים גרנט מגב-123419, מדעי הטבע, הנדסה מחקר המועצה של קנדה גילוי גרנט 418194, ואת משרד אונטריו של המחקר, פרס החדשנות מחקר מוקדם BH. DGW תרמו את חלקם של התמונות שהוצגו, אופטימיזציה של הפרוטוקולים, הכתיבה של כתב היד; הוא מומן על ידי מענק משאבת-לקרקע מן האוניברסיטה של ליברפול. CY ממומן על-ידי מלגה לתואר שני וניהר CIHR MD/PhD Studentship. סוכנויות מימון היה אין תפקיד תכנון המחקר, איסוף נתונים, ניתוח, ההחלטה לפרסם או אופן ההכנה של כתב היד.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| RPMI 1640 מדיה | Wisent | 3500-000-EL | |
| DMEM מדיה | Wisent | 319-005-CL | |
| סרום בקר עוברי (FBS) | Wisent | 080-150 | |
| PBS | Wisent | 311-010-CL | |
| 18 מ"מ כיסויי זכוכית עגולים #1.5 עובי | אלקטרונים מדעי מיקרוסקופיה | 72290-08 | גודל וצורת הכיסוי אינם קריטיים, אך 18 מ"מ מתאימים לבארות של צלחת סטנדרטית של 12 בארות המפשטת את תרבית התאים |
| Staurosporine | Cayman Chemical | 81590 | מתמוססים ב-DMSO ב-1 מ"מ (תמיסת מלאי פי 1,000)Annexin |
| V-Alexa 488 | ThermoFisher | R37174 | |
| EZ-Link NHS-Biotin | ThermoFisher | 20217 | חנות במייבש. אל תכינו תמיסת מלאי. |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| CellTrace FarRed | ThermoFisher | C34572 | |
| CellTrace כתום | ThermoFisher | C34851 | |
| Hoescht 33342 | ThermoFisher | 62249 | |
| FITC-Streptavadin | ThermoFisher | SA1001 | |
| מדיום הפרדת תאי לימפוליט-פולי | Cedarlane Labs | CL5071 | |
| רקומביננטי אנושי M-CSF | Peprotech | 200-04 | |
| רקומביננטי אנושי IL-4 | פפרוטק | 300-25 | |
| J774.2 קו תא מקרופאגים | סיגמא-אולדריץ' | 85011428-1VL | |
| THP-1 קו תא מונוציטים אנושי | ATCC | TIB-202 | |
| קו תא T ג'ורקט | ATCC TIB-152 |
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה
בקש הרשאה