המטרה של פרוטוקול זה נועד להקל על המחקר של קולטני NMDA (NMDAR) בקנה מידה גדול יותר, לאפשר הבחינה של תופעות modulatory של מולקולות קטנות ושימושיהם טיפולית.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
וזמינותו תפוקה גבוהה סידן השטף ללמוד קולטני NMDA עם רגישות גליצין/D-סרין, גלוטמט
במאמר זה
סיכום
תקציר
N-מתיל-D-אספרטט (NMDA) קולטנים (NMDAR) מסווגים רצפטורים גלוטמט ionotropic ויש תפקידים חיוניים בלמידה ובזיכרון. תקלה NMDAR, מבוטא כמו גם נגמר - או תחת - activity נגרמת על ידי מוטציות, ביטוי שונה, סחר או לוקליזציה, יכול לתרום מחלות רבות, במיוחד במערכת העצבים המרכזית. לכן, הבנה ביולוגיה של הקולטן וכן הקלת הגילוי של תרכובות מולקולות קטנות הוא מכריע המאמצים המתמשכים כדי להתמודד עם מחלות נוירולוגיות. לגישות ללמוד את הקולטן יש מגבלות כולל תפוקה נמוכה, עלות גבוהה של חוסר היכולת ללמוד יכולותיו פונקציונלי בשל נוכחותם הכרחי של חוסמי ערוצים כדי למנוע excitotoxicity בתיווך NMDAR. בנוסף, המערכות assay קיימים רגישים לגירוי על ידי גלוטמט בלבד, חסרי רגישות גירוי על-ידי גליצין, ליגנד שיתוף אחרים של NMDAR. כאן, אנו מציגים וזמינותו הראשון המבוסס על צלחת עם תפוקה גבוהה כוח ללמוד על קולטן NMDA עם רגישות ליגנדים שיתוף, גלוטמט, D-סרין/גליצין. גישה זו מאפשרת לימוד יצירות שונות של יחידת משנה NMDAR ומאפשר לימודי פונקציונלי של הקולטן במצבי גליצין - ו/או רגישים גלוטמט. בנוסף, השיטה אינה דורשת הנוכחות של מעכבי במהלך המדידות. ניתן להבחין את השפעות חיוביות ושליליות מאפננים allosteric עם זה וזמינותו, פרמקולוגיה הידוע של NMDAR כוכבנו במערכת שלנו. טכניקה זו גוברת על המגבלות של שיטות קיימות והיא חסכונית. אנו מאמינים טכניקה חדשנית זו. נאיץ את הגילוי של טיפולים בתיווך NMDAR פתולוגיות.
מבוא
עם ההתקדמות הנוכחית ברפואה, אמנם תוחלת החיים עלתה באופן משמעותי; עם זאת, אז יש השכיחות של מחלות הקשורות לגיל. מחלות של מערכת העצבים המרכזית (CNS) כגון סכיזופרניה, נוירודגנרטיביות (ALS), מחלת אלצהיימר, מחלת פרקינסון, בין היתר, ללא יוצא מן הכלל, ההקרנות להגדיל מעל הבא העשור1, 2 , 3. לתפקודו של רצפטורים גלוטמט ionotropic המכונה קולטנים N-מתיל-D-אספרטט (NMDAR) נקשר מחלת אלצהיימר סכיזופרניה, פגיעה מוחית טראומטית, שבץ מוחי, סוכרת, גלאוקומה בין היתר, אשר מצדיק צריך ללמוד את הביולוגיה שלהם לפיתוח טיפולים יעילים, מחלות שינוי4,5
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכנת תאים
הערה: פרוטוקול זה, לרבות נתונים הדור, משתמשת HEK293 תאים transduced עם baculovirus קידוד תאים NR1 ו- NR2A.
- זרע מספר מתאים של תאים HEK293 ולהוסיף את הוירוס NR1 ו/או NR2A בריכוזים הסופית המתאימה (1.00 µL כל אחד). צלחת 384-ובכן, לשימוש 10,000 תאים/טוב באמצעי אחסון הסופי של 30 µL.
- לחלופין, זרע HEK293-NR1-NR2A תאים תאים מתאים המספר, נפח (עבור צלחת 384-ובכן, שימוש 10,000 תאים/באר נפח סופי של 30 µL). להוסיף טטרציקלין בכל ריכוז של µg/mL 2 כדי לגרום NR2A ביטוי ולהוסיף את ההגנה המורכב (100 מיקרומטר MDL105, 519 או 5 מיקרומטר CGP07066724).
- הערה: baculovirus קידוד NR1 ו NR2 צריך כייל נוג....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
לפני בחינת השפעת מולקולות קטנות, אחד חייב לקבוע את רמות ביטוי אופטימלית של NMDARs, כמו גם ריכוז אופטימלי ליגנד. כפי שתואר, HEK293 התאים היו נזרע ב 10,000 תאים לכל טוב בצלחת 384-ובכן, בנוכחות 5 מיקרומטר CGP060667, ואז transduced עם כמויות משתנות של NR1 ו- NR2A וירוסים. לאחר דגירה לילה, הנוצרות על-ידי ליגנד סידן נמדדה השטף (איור 1). התוצאות של ניסויים אלה חושפים את כמות הטוב ביותר ואת יחס של וירוס לשימוש עבור כל יחידה משנית (איור 1.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הצלחת assay זו תלויה במידה רבה על בריאות התאים HEK בשימוש. תאים שעברו הצמיחה המעריכית, עם מספר נמוך המעבר אמור לשמש. Assay הזה כרוך העברות רבות, תוספות של פתרונות, זאת באמצעות התראה יבטיחו דיוק גבוה יותר בתוצאות שלה. ריכוזים של תרכובות וחומרים כל אחרים צריך להיות גם הצלבת למזער שגיאות. בעת החלפת המדיה הנייד עם המאגר assay וזמינותו השטף סידן, הלוח צריך להיות מוטה בעדינות כך התאים אל תנתק כעת. בסופו של דבר, השימוש של פולי-D-ליזין צלחות מצופה ב פרוטוקול זה מגדילה את קובץ מצורף של התאים לצלחת.
יית.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים ולא לחשוף.
תודות
המחברים רוצה להודות סניף בגרות מלומדים תוכנית ומכונים נוברטיס למחקר ביורפואי בכללותה למימון מחקר זה.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| HEK-293 | ATCC | CRL-1573 | |
| קולטן NMDA (NR1/NR2A) קולטן קו תאים | ChanTest Corporation | CT6120 | |
| pFastBac וקטור ביטוי כפול | ThermoFisher Scientific | 10712-024 | |
| קורנינג 384 באר שקוף שטוח תחתון מיקרופלייט | קורנינג מדעי החיים | 3844 | |
| FLIPR סידן 6-QF ערכת בדיקה | מולקולרית מכשירים | R8192 | |
| גליצין | סיגמא-אולדריץ' | G7126 | |
| גלוטמט | סיגמא-אולדריץ' | 49621 | |
| D-סרין | סיגמא-אולדריץ' | S4250 | |
| L701,324 | טוקריס | 907 | |
| HEPES מאגר | בוסטון ביו מוצר | BB-103 | |
| תמיסת מגנזיום כלוריד | סיגמא-אולדריץ' | 63069 | |
| סידן כלורי | VWR | E506 | |
| HBSS | ThermoFisher Scientific | 14025-092 | |
| Probenecid | ThermoFisher Scientific | P36400 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX מדיה | ThermoFisher Scientific | 10565018 | |
| MDL105,519 | NIBR | מסונתז בבית | |
| NVP-AAM077 | NIBR | מסונתז בבית | |
| CGP070667 | NIBR | מסונתז בבית |
מקורות
- Farrall, A. J., Wardlaw, J. M. Blood-brain barrier: ageing and microvascular disease--systematic review and meta-analysis. Neurobiology of Aging. 30 (3), 337-352 (2009).
- Walhovd, K. B., Fjell, A. M., Espeseth, T.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
