הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

נויטרופילים מלכודות חוץ-תאי שנוצר על ידי נויטרופילים בצפיפות נמוכה המתקבל נוזל שטיפת הצפק התחלקות התא הגידול וקובץ מצורף

8.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/58201

⸱

3 באוגוסט 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Gastrointestinal Surgery, Jichi Medical University

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים שיטה שבה נויטרופילים אנושיים בצפיפות נמוכה (-כעבור שנה-), התאוששה נוזל שטיפת הצפק לאחר הניתוח, לייצר מסיבית מלכודות חוץ-תאית נויטרופילים (רשתות), השמנה ביעילות תאים סרטניים חינם לאחר מכן לגדול.

תקציר

הפעלת נויטרופילים שחרור נויטרופילים חוץ-תאית מלכודות (רשתות), אשר יכולים ללכוד ולהשמיד חיידקים. מחקרים שנעשו לאחרונה מראים כי רשתות מעורבים בתהליכי מחלה שונים, כגון גרורות המחלה פקקת, הגידול אוטואימוניות. כאן, אנו מראים טכניקה מפורט במבחנה לזיהוי פעילות נטו במהלך לכידה של תאים סרטניים חינם, אשר גדלים לאחר חיבור רשתות. ראשית, אספנו בצפיפות נמוכה נויטרופילים (-כעבור שנה.-) של נוזל שטיפת הצפק לאחר הניתוח בחולים שעברו laparotomies. Culturing לטווח קצר של-כעבור שנה-הביא שמצביעה נטו מסיבית היה מדמיין עם גרעיני ירוק פלורסנט, כרומוזום counterstain. לאחר דגירה שיתוף של שורות תאים סרטן קיבה אנושית MKN45, OCUM-1 ו- NUGC-4 עם הרשתות, תאים סרטניים רבים נלכדו על ידי הרשתות. כתוצאה מכך, הקובץ המצורף היה יושב לחלוטין על ידי ההשפלה של רשתות עם Time-lapse אני DNase הסרטונים גילה כי תאים סרטניים, שנלכד על ידי הרשתות לא מת, אבל במקום גדל נמרצות בתרבות רציפה. שיטות אלה ניתן להחיל את הגילוי של דבק אינטראקציות בין רשתות סוגים שונים של תאים וחומרים.

מבוא

פולימורף נויטרופילים גרעיני במחזור הדם מופרדים בדרך כלל תאי תאי דרך שיטת הכנה הדרגתיות צפיפות. עם זאת, כמה נויטרופילים הידוע בשם נויטרופילים בצפיפות נמוכה (-כעבור שנה-), עם פנוטיפים CD11b(+), CD15(+), CD16(+), CD14(-), הם מטוהרים במשותף עם תאי תאי. המספר היחסי של-כעבור שנה-מגדיל באופן משמעותי בתנאים פתולוגיים שונים, כולל מחלות אוטואימוניות1,2, אלח דם3ו-4,סרטן5. מחקרים קודמים הראו כי-כעבור שנה-מחלקה phenotypically והן מבחינה תפקודית ברורים של נויטרופילים6. יצוין, כי-כעבור שנה-במחזור הדם הם נוטים יותר לייצר מלכודות חוץ-תאית נויטרופילים (רשתות) מצפיפות נורמלי נויטרופילים2,7. הרשתות הן מבנים דמויי-אינטרנט המורכב של חומצות גרעין, שינויים היסטוניים, פרוטאזות, חלבונים פרטנית ו cytosolic, הם ביעילות במלכודת, להרוס פתוגנים8.

לאחרונה, רשתות הוכחו ללכוד לא רק חיידקים, אבל גם טסיות דם ופיזור תאים סרטניים, אשר יכולים לסייע כגון היווצרות9 וגידול גרורות10,11. עם זאת, המנגנונים המולקולריים מאחורי האינטראקציות דבק בין רשתות, טסיות דם או תאים סרטניים נמצאים עדיין לא ברור. לאחרונה, assay אדהזיה במבחנה גילה כי תאים לוקמיה מיאלואידית (K56212) ותאים קרצינומה של הריאות (A54913) לצרף רשתות באמצעות אינטגרינים β1 וβ3. המחברים השתמשו נטו מניות מבודד נויטרופילים ומופעל על ידי phorbol 12-פעילים 13-אצטט (PMA) המצע אדהזיה14. למרות assay זה מאפשר זיהוי של אינטראקציות אמיתי עם רכיבים נטו בהיעדרו של נויטרופילים, זה לנתיחה אם "התא ללא מניות נטו" מבודדת על ידי צנטריפוגה במהירות גבוהה משמרת את המבנה המולקולרי זהה רשתות המיוצר ב ויוו. לאחרונה, מצאנו את נוזל שטיפת הצפק לאחר ניתוח בבטן הכיל הרבה בוגרים-כעבור שנה-, אשר נוצר רשתות מסיבי המוצמדות לתאים הגידול גורם גרורות הצפק15. במחקר זה, בדקנו בהצלחה את הידבקות תאים סרטניים רשתות שלמות ללא כל פעולה פיזית. כאן, אנו מראים פרטים של טכניקה לגילוי דבק אינטראקציות בין רשתות תאים סרטניים חינם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

-כעבור שנה-התקבלו מחולים שהשתתפו במחקר זה ואושרו על-ידי מוסדיים סקירה לוח של jichi ב רפואה באוניברסיטה.

1. בידוד של-כעבור שנה-של חלל הבטן Lavages וזיהוי נטו

  1. רכישת המדגם
    1. להשרות 1000 מ"ל של תמיסת סטרילית ישירות לתוך חלל הבטן לפני סגירת הפצע בחולים שעברו ניתוח בטן בשל ממאירות במערכת העיכול.
      הערה: דגימות התקבלו מהמטופלים שעברו ניתוח קיבה, קיצור קיבה, או esophagectomy ללא הטיה על בסיס גיל או מין. תמיסת מלח היה הועבר לתוך מיכל והוא נשפך לתוך הבטן כל. דקה אחת. זה מתבצע באופן שגרתי כמו שטיפת הצפק לאחר הניתוח ללא השפעות משמעותיות על חולים.
    2. שטיפת חלל הבטן בהרחבה לפחות 1 דקות.
      הערה: מומלץ כי הנוזל מוחדר אט-אט מנוער בידיים של המנתח כך הדגימות אחיד.
    3. לשחזר 200 מ של נוזל שטיפה עם 4 מזרקים 50 מ.
      הערה: לפעמים גומי מחבר משמש כדי לקחת את הנוזלים.
  2. לבצע טיהור של הצפק-כעבור שנה-באמצעות גרנולוציט mAb ספציפי, CD66b16.
    הערה: כיוון שכבת ביניים לאחר צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות מכיל תאי תאי רבים, הבחירה חיובית של נויטרופילים פולימורף באמצעות CD66b mAb בוצעה.
    1. העברת נוזל שטיפת הצפק שפופרת 50 מ.
      הערה: בשלב זה, את הנוזלים עוברים דרך מסנן ניילון 100 מיקרומטר להסיר זיהומים.
    2. Centrifuge את הנוזל הצפק ב g x 270 במשך 7 דקות ב- RT.
    3. Resuspend כדורי ב 5 מ של PBS עם EDTA 0.02%.
    4. בזהירות כיסוי mL 5 תא השעיה על פתרון הדרגתי של צפיפות 3 מ.
    5. צנטריפוגה ב g x 1,700 למשך 15 דקות ב RT ללא כל מעברי.
    6. הקציר mL ~ 2-3 של פתרון המכיל שכבות ביניים (איור 1 א') באמצעות פיפטה ומערבבים אותו עם 10 מ"ל של PBS עם EDTA 0.02%.
    7. Centrifuge את הנוזל הצפק-400 g x עבור 7 דקות ב RT וזורקים את תגובת שיקוע.
    8. להוסיף עוד 10 מ"ל של PBS עם EDTA 0.02%, צנטריפוגה g x 270 עבור 7 דקות-RT. להשליך תגובת שיקוע.
    9. להמיס בגדר תא (1 x 107) 60 µL מאגר עבור ערכת ההפרדה תא מגנטי.
    10. להוסיף 20 µL של Fc גוש כדורי, תקופת דגירה של מינימום 10-4 מעלות צלזיוס.
    11. הוסף 20 µL של האנטי-CD66b מצומדת עם גרגרי ואת תקופת דגירה של 10 דקות נוספות ב 4 º C.
    12. רוחצים את מחדש להשעות את כדורי ב- 500 µL מאגר מקינטוש.
    13. החלת התליה תא על עמודה מגנטי בשדה המגנטי של מפריד מגנטי מתאים ולאסוף זרימה דרך המכיל CD66b(-) התאים ע י שטיפת העמודה עם 15 מ"ל של המאגר.
    14. הסר את העמודה במפריד מגנטי, מיד לשטוף את התאים CD66b(+) מגנטית שכותרתו בדחיפה בחוזקה על הבוכנה לתוך העמודה.
      הערה: האוכלוסייה תא CD66b(+) מורכב בעיקר נויטרופילים כפי שנקבע על ידי ניתוח FACS המציין > 95% של השבר CD66(+) הם חיוביים עבור CD11b, CD15 CD16, אבל שלילי עבור CD14.
  3. דור של רשתות
    1. לאחר צנטריפוגה-g x 270 עבור 7 דקות-RT, מחדש להשעות את-כעבור שנה-מבודד (5 x 106) ב 1 מ"ל של RPMI1640 עם 10% FCS.
    2. תרבות של-כעבור שנה-על הצלחת מצופה 6-ובכן פולי-L-ליזין (6 ס מ קוטר) עבור 2 h ב- 37 הלעפה תרוטרפמט 5% CO2.
    3. להוסיף את counterstain פלואורסצנטי ירוק (צבע ממברנה-אטום כדי להכתים את גרעין ואת כרומוזומים) הריכוז הסופי של 5 מיקרומטר.
    4. מיד להבחין המורפולוגיה של רשתות (חוץ-תאי DNA הרכיבים שגורשו את-כעבור שנה-תחת מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית).

2. צביעת של תאים סרטניים עם צבע מקשר תא ניאון אדום

  1. להכין סרטן אנושי שורות תאים MKN45, NUGC, OCUM-1.
  2. לשטוף את התאים7 עונה 1 פרק 10 עם PBS + EDTA 0.02% 15 מ"ל שפופרת, צנטריפוגה ב 270 x g במשך 7 דקות ב- RT.
  3. להוסיף 1 מ"ל של פתרון עבור צבע מכתימה את כדורי, פיפטה בעדינות.
  4. להמיס 4 µL של צבע מקשר תא ניאון אדום ב 1 מ"ל של פתרון עבור צביעת ומערבבים עם התליה תא מהשלב 2.2.
  5. דגירה כדורי במשך 4 דקות ב- RT.
  6. להוסיף 4 מ של DMEM (10% FBS) כדי לעצור את התגובה מוכתמים.
  7. צנטריפוגה g x 270 עבור 7 דקות וזורקים את תגובת שיקוע.
  8. חזור על שלבים 2.6 ו- 2.7 פעמיים.
  9. בדוק עם מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית (עירור = 551 nm, פולטות = 567 ננומטר) כי בתאי הגידול מוכתמים באדום.

3. ניתוח של גידול התא הדבקה על רשתות

  1. מחדש להשעות את תאי הגידול מוכתם ניאון אדום (1 x 106) ב 1 מ"ל של RPMI 1640 בתוספת BSA 0.1%.
  2. הוסף את תאי הגידול התרבות-כעבור שנה-שהפיקה את הרשתות כפי שמתואר בשלב 1.3.
  3. תקופת דגירה של 5 דקות ב 37 הלעפה תרוטרפמט, אשר מאפשרת לתאי הגידול ליצור קשר עם הרשתות.
    הערה: זמן דגירה גורם גידול התא אדהזיה-כעבור שנה- או את הצלחות.
  4. להסיר את המדיום ולשטוף בעדינות את הבארות על-ידי הוספת 2 מ"ל של מדיה prewarmed (BSA 0.1% + RPMI 1640), מתערבל המנה.
  5. חזור על הפעולות כביסה בשלב 3.4 פעמיים.
    הערה: מאז רשתות בחולשה לצרף הצלחת, כביסה צריך להיעשות בעדינות ככל האפשר כדי למנוע הסרה של הרשתות עצמם.
  6. הוסף את הפלורסנט ירוק עבור מכתימה את גרעין ואת כרומוזומים-ריכוז הסופי של 5 µg/mL עבור ויזואליזציה של הרשתות.
  7. לצפות את הרשתות ומחוברת תאים סרטניים באמצעות את המסננים המתאימים (ירוק, עירור = 504 nm, פולטות = 523 ננומטר; רד, עירור = 551 nm, פולטות = 567 ננומטר).
  8. למזג את הנתונים כדי להציג את תאי הגידול כי הם לכודים על ידי הרשתות.
    הערה: כמה ניסויים, האנזים DNA השפלה נוספה התרבות-כעבור שנה-(הריכוז הסופי של 100 U/mL) 5 דקות לפני שיתוף הדגירה למשך 5 דקות.

4. זמן לשגות ניתוח וידאו של תאי הגידול לכוד

  1. תרבות-כעבור שנה-פריטוניאלית ב 35 מ מ עגול מאכל מצופה פולי-L-ליזין כפי שמתואר בשלב 1.3.
  2. הוסף את הפלורסנט ירוק עבור מכתימה את גרעין ואת כרומוזומים להמחיש רשתות כפי שמתואר בשלב 1.3.
  3. לאחר 1 דקות של דגירה, מסיר את המדיה ולהוסיף 2 מ"ל של BSA 0.1% + RPMI 1640.
  4. מסיר את המדיה ולהוסיף מוכתם עונה 1 פרק 106 MKN45 תאים הושעו ב- 0.1% BSA + RPMI 1640. תקופת דגירה של 5 דקות ב- RT.
  5. להסיר תאים סרטניים כעיגולים בצבע כלשהו על ידי שטיפת בעדינות כפי שמתואר בשלב 3.4 ולהוסיף DMEM עם 10% FCS בתוספת 100 u/mL פניצילין, סטרפטומיצין µg/mL 100.
  6. הר המנה תרבות במערכת תצפית נוף כל תא, בחר את השדה המתאים איזה גידול תאים לכוד על ידי הרשתות.
  7. ממשיכים תרבות משותפת עבור נוספים יומיים לצלם תמונות רציף של השדה בכל 6 דקות תחת תאורה רגילה וזריחה, אשר מזהה תאים MKN45 ורשתות, בהתאמה.
  8. להרכיב את התמונות על כל timepoint ולבנות זמן לשגות וידאו באמצעות התוכנה מציג תמונה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בתרבות 2 שעות CD66b(+)-כעבור שנה-נגזר מבנים מחרוזת הראה נוזל שטיפת הצפק צבעונית עם צבע ירוק-פלורסנט עבור גרעיני, כרומוזום (איור 1B), בעוד CD66b(-) תאי תאי לא (איור 1C). עם זאת, כאשר pretreated היו התרבויות-כעבור שנה-עם 100 DNase U/mL, המבנה האופייני היה נהרס (איור 1D), המציין כי הם מורכבים של דנ א חוץ-תאית, שגורשו נויטרופילים. כאשר-כעבור שנה-היו תרבותי על צלחות פלסטיק ללא ציפוי, אשכולות נטו רבים צף, ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מחקרים קודמים דיווחו כי מחזורי תאים סרטניים יכולים להיות. לכוד סובסטרטים נטו ויוו10,11. תאי סרטן שד גרורתי הוכחו לעורר נויטרופילים, זירוז היווצרות של רשתות, אשר מסייע צמיחת תאים סרטניים גידולים איבר המטרה17. בנוסף, מצאנו כי של נוזל שטיפה לאחר הניתוח לטווח קצר תרבויות של-כעבור שנה-המיוצר מסיבי ברשתות יכול ביעילות אומללותו תאים סרטניים ללא גירוי נוסף15. מקרים אלה מצביעים על תפקיד אפשרי למעורבות מכני של רשתות ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

תודות

אנו מודים גברת ג'יי שינוהרה, אני Nieda על עבודה טכנית, קלריקלי. כמו כן, אנו מודים ד"ר שירו מאצומוטו, Hidenori Haruta, Kurashina קנטארו ו Kazuya טקהאשי על שיתוף הפעולה שלהם עבור רכישת המדגם בחדר ניתוח. עבודה זו נתמכה על ידי מענק הסיוע למחקר מדעי של משרד החינוך, המדע, הספורט, ואת התרבות של יפן והחברה יפן הקידום של המדע (17K 10606).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Ficoll-Paque PLUSGE Healthcare, שוודיה17-1440-02
StraightFrom™ Whole Blood CD66b MicroBeadsMiltenyi Biotec , ברגש גלדבאך, גרמניה130-104-913
Fc blockMiltenyi Biotec , ברגש גלדבאך, גרמניה130-059-901
MACS Rinsing SolutionMiltenyi Biotec , ברגש גלדבאך, גרמניה130-091-222
MACS BSA Stock SolutionMiltenyi Biotec , ברגש גלדבאך, גרמניה130-091-376
עמודות LSMiltenyi Biotec, ברגיש גלדבאך, גרמניה130-041-306
מפריד מגנטי MACSMiltenyi Biotec, ברגיש גלדבאך, גרמניה130-042-501
תמיסת כתם חומצת גרעין ירוקה של SYTOX 5 מ"מ ב-DMSOThermo Fisher Scientific, וולת'אם, MA, ארה"בS7020
PKH26 ערכת קישור תאים פלואורסצנטיים אדומים לתיוג קרום תא כלליסיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"בP9691
מדלל Cסיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"בCGLDIL
בינוניסיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"בR8758
Dulbecco' s Modified Eagle גלוקוז בינוני-גבוה (DMEM)סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"בD5796
Dulbecco' s תמיסת מלח חוצצת פוספט (DPBS)סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"בD8537
תמיסת 0.5mol/l-EDTA (pH 8.0)nacalai tesque, יפן06894-14
סרום בקר עוברי, מוסמך, אזורים מאושרים על ידי USDAgibco by Life Technologies, מקסיקו10437-028
סרום בקר אלבומין אבקה ליופילית, ≥ 96% (אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז)סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"בA2153
פניצילין סטרפטומיציןLife Technologies יפן15140-122
פלסמוצין מונעInvivoGen, סן דייגו, קליפורניה-ארה"בant-mpp
DNase Iוורת'ינגטון, לייקווד ניו ג'רזי)LS002138
MICROPLATE מצופה פולי-L-ליזין 6WellIWAKI, יפן4810-040
MICROPLATE מצופה פולי-L-ליזין 24WellIWAKI, יפן4820-040
סטריאומיקרוסקופ פלואורסצאיןBX8000, Keyence, אוסקה יפןBZ-X710
מערכת תצפית על תאים בתצוגה מלאהניקון, קנאגאווה, יפןBioStudio (BS-M10)
MKN45 קו תאי סרטן קיבה אנושיRiken, Tukuba יפןN/A
NUGC-4 קו תאי סרטן קיבה אנושיRiken, טוקובה יפןN/A
OCUM-1 קו תאי סרטן קיבה אנושיאוניברסיטת אוסקה סיטי, יפןN/Aמתנה מד"ר מ. יאשירו
RPMI1640

מקורות

  1. Hacbarth, E., Kajdacsy-Balla, A. Low density neutrophils in patients with systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, and acute rheumatic fever. Arthritis and Rheumatology. 29 (11), 1334-1342 (1986).
  2. Denny, M. F., et al. A distinct subset of proinflammatory neutrophils isolated from patients with systemic lupus erythematosus induces vascular damage and synthesizes type I IFNs. The Journal of Immunology. 184 (6), 3284-3297 (2010).
  3. Morisaki, T., Goya, T., Ishimitsu, T., Torisu, M. The increase of low density subpopulations and CD10 (CALLA) negative neutrophils in severely infected patients. Surgery Today. 22 (4), 322-327 (1992).
  4. Schmielau, J., Finn, O. J. Activated granulocytes and granulocyte-derived hydrogen peroxide are the underlying mechanism of suppression of t-cell function in advanced cancer patients. Cancer Research. 61 (12), 4756-4760 (2001).
  5. Brandau, S., et al. Myeloid-derived suppressor cells in the peripheral blood of cancer patients contain a subset of immature neutrophils with impaired migratory properties. Journal of Leukocyte Biology. 89 (2), 311-317 (2011).
  6. Carmona-Rivera, C., Kaplan, M. J. Low-density granulocytes: a distinct class of neutrophils in systemic autoimmunity. Seminars in Immunopathology. 35 (4), 455-463 (2013).
  7. Villanueva, E., et al. Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus. The Journal of Immunology. 187 (1), 538-552 (2011).
  8. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  9. Demers, M., et al. Cancers predispose neutrophils to release extracellular DNA traps that contribute to cancer-associated thrombosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (32), 13076-13081 (2012).
  10. Cools-Lartigue, J., et al. Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells and promote metastasis. Journal of Clinical Investigation. , (2013).
  11. Tohme, S., et al. Neutrophil Extracellular Traps Promote the Development and Progression of Liver Metastases after Surgical Stress. Cancer Research. 76 (6), 1367-1380 (2016).
  12. Monti, M., et al. Integrin-dependent cell adhesion to neutrophil extracellular traps through engagement of fibronectin in neutrophil-like cells. Public Library of Science One. 12 (2), e0171362(2017).
  13. Najmeh, S., et al. Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells via beta1-integrin mediated interactions. International Journal of Cancer. 140 (10), 2321-2330 (2017).
  14. Najmeh, S., Cools-Lartigue, J., Giannias, B., Spicer, J., Ferri, L. E. Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).
  15. Kanamaru, R., et al. Low density neutrophils (LDN) in postoperative abdominal cavity assist the peritoneal recurrence through the production of neutrophil extracellular traps (NETs). Scientific Reports. 8 (1), 632(2018).
  16. Eades-Perner, A. M., Thompson, J., van der Putten, H., Zimmermann, W. Mice transgenic for the human CGM6 gene express its product, the granulocyte marker CD66b, exclusively in granulocytes. Blood. 91 (2), 663-672 (1998).
  17. Park, J., et al. Cancer cells induce metastasis-supporting neutrophil extracellular DNA traps. Science Translational Medicine. 8 (361), 361ra138(2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

NETMACSDNase ITime Lapse
נויטרופילים מלכודות חוץ-תאי שנוצר על ידי נויטרופילים בצפיפות נמוכה המתקבל נוזל שטיפת הצפק התחלקות התא הגידול וקובץ מצורף
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.