זיהוי של עותק נמוך מספר משולב ה-DNA הנגיפי נוצר על ידי במבחנה הפטיטיס B זיהום

HBV הוא וירוס DNA גדילי כפול שיכולים לגרום זיהום כרוני חיים ארוך, המוביל שחמת הכבד hepatocellular קרצינומה (HCC)^1,2,3. בעוד ישנם מספר המנגנונים המולקולריים נהיגה HBV התמדה⁴ (למשל, ביציבות גבוהה של התבנית תעתיק ויראלי epigenetic), התחמקות של מעקב המערכת החיסונית, תחלופה נמוכה של hepatocytes בכבד ו המשויך הסיכון של HCC חניכה^5,6 (למשל, דלקת כרונית, ההפעלה של הסלולרי להדגיש מסלולים), שילוב HBV DNA הגנום של התא המארח (מנגנון דיווח עבור שתי התופעות הללו) לקוי נחקרה . הסיבה הראשית היא חוסר מתאימים במבחנה זיהום מערכות HBV המאפשרים זיהוי אמין של אירועי שילוב. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול שפותח לאחרונה גם במבחנה הדור וגם גילוי של שילובי HBV DNA זה יכול לשמש כדי להבהיר את המנגנונים המולקולריים שבבסיס והשלכות הימנו.

היווצרות של HBV DNA אינטגרציה ושכפול של HBV נצפה בעבר בפרטים⁷. בקצרה, HBV נכנס hepatocytes שימוש פפטיד Co-transporting של נתרן Taurocholate (NTCP) הקולטן הסלולר העיקרי עבור זיהום^8,9. Nucleocapsids HBV המכיל (rcDNA) רגוע-HBV DNA מעגלי הגנום נכנס לגרעין, איפה rcDNA מומר DNA מעגלי סגור covalently episomal (cccDNA). CccDNA גרעיני משמש תבנית תעתיק של נגיפי mRNAs ל- RNA (pgRNA) מראש גנומית¹⁰. פולימראז HBV ו pgRNA ארוזים ואז לתוך nucleocapsids החדשה (מורכבת הדימרים חלבון הליבה HBV). HBV pgRNA היא הפוכה-עיבד בתוך nucleocapsid, וכתוצאה מכך גם על הגנום rcDNA או כפול גדילי לינארי דנ א (dslDNA) הגנום^11,12. אלה nucleocapsids בוגר המכיל HBV DNA הגנום סוף סוף אפוף, ייצוא virions.

זיהום של hepatocytes על ידי מעטפת חלקיקים המכילים מולקולות dslDNA יכול לגרום ויראלי השתלבותם המארח תא הגנום¹³, מוביל לטפסים פסול השכפול של HBV DNA^7,14,15. שילוב HBV DNA מתרחשת באתר של כרומוזומלית כפול גדילי DNA מעברי¹⁵. צבירת הראיות עולה כי כל אירוע אינטגרציה מתרחשת במצב בעיקרו של דבר אקראי בתוך^16,17הגנום בתא המארח. בנוסף, שילוב HBV DNA מתרחשת מעט לעיתים רחוקות, בקצב של 1 לכל 10⁴ תאים^13,18,19,20. שאלות חשובות בנוגע לשילוב HBV DNA נותרו ללא מענה, במיוחד לגבי המדויק מסלולים מולקולריים המעורבים, התלות ויראלי וגורמים המארח, אנטיגנים ויראלי הביע טפסים משולב, ואת תרומתם אפשרי התמדה ויראלי⁷. הקמנו מודל במבחנה לשפוך אור על חלק מהשאלות האלה.

בנגישות של HBV DNA שילוב אירועים (הן לגבי קצב אינטגרציה בכל תא, למספר עותק של כל שילוב ייחודי) במבחנה HBV זיהום מודלים להפוך אותם מאתגר כדי לזהות. תא מיטוזה מוגבל במערכת שלנו במבחנה , כמו החלוקה תאים שלא תומכים זיהום יעיל. לפיכך, בניגוד ברקמות הכבד החולה שבו משובט הרחבה משמעותית של hepatocytes מתרחשת^18,19,20, מאוד (1-2) עותקים של כל שילוב נוכחים בבריכה מסוים של תאים נגועים במבחנה . מצאנו גם כי שילוב מתרחשת בעיקר במהלך זיהום ראשוני של hepatocytes (וגם לא ברציפות ב נגועה באופן כרוני hepatocytes)¹³. בהתאם לכך, שילוב HBV DNA לא יכול להיות מוגברת על ידי פשוט culturing תאים לתקופה ארוכה יותר.

באופן כללי, שיטות השתמשת קודם לכן כדי לזהות משולב HBV DNA, כולל דרום כתם הכלאה^{21,22,23,24,25}, Alu-PCR^26,27 , בתיווך קלטת מצדו PCR²⁸, הגנום כל רצף^{29,30,31,32,33}, אין לי את הרגישות לזהות יחיד-עותקים של שילובים. ואנו חוקרים אחרים השתמשו ההופכי מקונן PCR (invPCR) לאתר האינטגרציה דנ א hepadnaviral ברווז וודצ'אק, כבדי אדם נגוע^{13,14,18,19, 35, 34,36}. אחרים הציגו פרוצדורלי שינויים הטכניקה invPCR עשוי לשנות את הדור של אותות חיובי-false, להגביל את היכולת של כימות³⁷. אם וזמינותו מתבצעת כפי שמתואר פרוטוקול זה, invPCR מייצג assay בדיקה רגישה וספציפית מזהה, מכמת (במספרים העתקה מוחלטת) שילובים HBV DNA מרובים. צומת תאים HBV DNA הוא רציף ברזולוציה זוג יחיד-בסיסים, ומאפשר bioinformatical מחקרים של נגיפי, מארח ה-DNA רצף באתרים של אינטגרציה¹³.

בעבר תארנו³⁸ תוצאות של invPCR על רקמה נגועה הדנ א של HBV מופק מגוון רחב של מקורות, כולל מוקפאים snap רקמות הכבד, פרפין-מוטבע מקטעים הכבד של דגימות רקמה קטן מאוד מבודד על ידי לייזר-microdissection¹⁹. פרוטוקול זה מתאר גרסה מעודכנת של וזמינותו invPCR באמצעות DNA מופק רקמות נגזר התרבות תאים לאחר במבחנה זיהום, שבו נוצרות עותק נמוך מספרים של שילובי (1-2 עותקים לכל שילוב). ה HBV DNA שילובים יצרו במבחנה דומים לאלה שנמצאו רקמות החולה לגבי פריסתם על הגנום הסלולר ועל צומת בתוך הרצף ויראלי זה משולב^13,16, רומז מסלול דומה כדי בתוך הכבד נגוע.

1. תא זיהום והפקת דנ א

1. לשמור על תרבות Huh7-NTCP תאים^8,9 בינוני (DMEM ששינה הנשר של Dulbecco) בתוספת 10% v/v עוברית שור סרום, 1 x פניצילין/סטרפטומיצין, ו- 2 מ מגלוטמין.
   הערה: זה בעבר דווח בפירוט⁴⁰.
2. זרע 2 x 10⁵ תאים למ"ל Huh7-NTCP תאים לתוך צלחת 12-ובכן עם 1 מ"ל של DMEM.
3. אם בדיקות תא טיפולים (למשל, מעכבי HBV), להחיל אותם על התרבות supernatant 4 שעות לאחר זריעה (יום 1 לפני HBV זיהום). עבור פקד שלילי, להחיל 200 ננומטר Myrcludex B (עוצמה HBV כניסה מעכב⁴¹).
4. להשתמש הפארין עמודות טיהור⁴² תגובת שיקוע HepAD38⁴³ inoculum כדי להדביק תאים על 1,000 VGE תא ב- 500 µL של תרבות התקשורת (DMEM בתוספת 10% v/v סרום שור עוברית, 1 x v/v פניצילין/סטרפטומיצין, 2 מ מגלוטמין ו- 2.5% דימתיל סולפוקסיד), המכיל 4% w/v פוליאתילן גליקול 8000 [מומס 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS)].
5. התרבות התאים חממה 37 ° C (מוגדר ב- 5% CO₂ ו- 90% לחות).
6. לשטוף את התאים פעמיים עם 1 מ"ל של PBS עקר 1 x ב- 16-24 שעות לאחר הפגיעה.
7. החלף את המדיה תרבות כל יומיים בעקבות זיהום HBV עד הקציר.
8. -יום 3 לאחר הפגיעה, מתייחסים התאים עם 5 מיקרומטר Tenofovir disoproxil ו- 10 מיקרומטר Lamivudine להגביל את הייצור של HBV intermediates replicative כי הם amplifiable על ידי invPCR.
9. יום 5 לאחר הפגיעה, trypsinize את התאים עם 200 µL של טריפסין-EDTA, resuspend אותם ב 2 מ של DMEM (בתוספת 10% v/v סרום שור עוברית, 1 x פניצילין/סטרפטומיצין, ו- 2 מ מגלוטמין), המכיל גם 5 מיקרומטר Tenofovir disoproxil ו- 10 מיקרומטר Lamivudine.
10. להעביר את המתלים תא צלחת 6-ובכן לזירוז סיבוב אחד של מיטוזה (אשר דווחה כדי לגרום לאובדן של HBV cccDNA⁴⁴ , אחרים intermediates HBV DNA כי הם amplifiable על-ידי invPCR).
11. יום 7 לאחר הפגיעה, trypsinize בתאים µL 400 של טריפסין-EDTA המורחב, resuspend התערובת של 1 מ"ל של DMEM. למקם את המתלים צינור 1.5 mL הצניפה התאים על ידי צנטריפוגה ב 500 g x במשך 5 דקות, להסיר את תגובת שיקוע על ידי השאיפה.
12. (אופציונלי) אחסן את כדורי תא ב-20 ° C עד שיהיו מוכנים להפקת DNA.
13. לחלץ את ה-DNA מ בגדר התא באמצעות ערכת חילוץ דנ א, לפי הוראות היצרן. מעריכים את ריכוז הדנ א הסופי באמצעות densitometry אופטי.
    הערה: התשואה DNA באמצעי אחסון • תנאי 100 μL בדרך כלל ~ 250-400 ng/μL.

2. היפוך של דנ א

1. Aliquot ~1.5–2.5 μg של ה-DNA הכולל לחלץ משלב 1 לתוך צינור PCR μL 200. להוסיף את הכמות המתאימה של אנזים הגבלה מאסטר-מיקס את התוצאה אמצעי תגובה 40 μL המכיל 1 x תקציר התגובה מאגר (למשל., מאגר CutSmart) ו- 10 U המשאני-HF.
2. לערבב את התגובות ביסודיות, ספין למטה ומפרידה צינורית קטנה. דגירה התגובה אנזים הגבלה במכונת ה-PCR ב 37 ° C עבור h 1 ליעילות לעיכול אופטימלי.
3. בטל את אנזים הגבלה על-ידי המקננת ב 80 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
4. להעביר את התגובה אנזים הגבלה כל צינור 1.5 מ. מוסיפים μL 400 1-T4 DNA ליגאז מאגר ו- 500 U של T4 DNA ליגאז ומערבבים אותו ביסודיות. האחסון תגובת גדולה מעודדת אינטרה-מולקולרית (להבדיל בין-מולקולריים) מצדו של שברי DNA מעוכל.
5. דגירה התגובה מצדו בטמפרטורת החדר במשך שעתיים להבטיח מצדו מלאה.
6. בטל את T4 DNA ליגאז ב 70 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
7. להוסיף 10 μL של 10% w/v dodecyl סולפט נתרן כדי להבטיח איון מוחלט של ליגאז T4.
8. לערבב את הצינורות על ידי הדופק vortexing, בקצרה ספין למטה תערובת התגובה. להוסיף NaCl ריכוז סופי של 100 מ מ, לתוספי (35-45 kDa) כדי ריכוז סופי של 90 µg/mL. לערבב את הצינורות על ידי הדופק vortexing, בקצרה ספין למטה תערובת התגובה.
9. הוסף 900 μL של 100% אתנול וביו -מיקס על ידי היפוך. לזרז את ה-DNA ב-20 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
10. צניפה הדנ א precipitated על ידי צנטריפוגה-14,000 g x עבור 15 דקות להסיר את תגובת שיקוע על ידי השאיפה עם פיפטה P200. לשטוף את גלולה עם 500 μL של 70% v/v אתנול וביו -צנטריפוגה ב g x 14,000 למשך 15 דקות.
11. הסר האתנול על ידי השאיפה עם פיפטה P200. מילה נהדרת בגדר DNA בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות.
12. להמיס בגדר ב 20 μL של H₂O. להוסיף 20 μL של אנזים הגבלה מאסטר-שילוב את התוצאה אמצעי תגובה 40 μL המכיל 1 x תקציר התגובה מאגר, 5 U של BsiHKAI ו-5 U של Sph-HF. Incubate התגובה אנזים הגבלה ב חום-רחוב 37 ° C (טמפרטורה אופטימלית עבור Sph-HF) לשעה.
13. בקצרה ספין למטה תערובת התגובה. דגירה התגובה אנזים הגבלה בתוך גוש חום-65 ° צ' (טמפרטורה אופטימלית עבור BsiHKAI) לשעה.
14. בקצרה ספין למטה תערובת התגובה.
15. חנות ה-DNA הופכיים ב-20 ° C עד השלב הבא.

3. שרשור PCR

1. להסיר amplicons פוטנציאליים גושפנקה mat סיליקון לשימוש חוזר באמצעות פתרון השפלה דנ א, לשטוף את השטיח ביסודיות עם מים ללא ה-DNA, מילה נהדרת זה בטמפרטורת החדר תוך כדי הכנת התערובת PCR.
2. להכין 1 מ"ל של תערובת x PCR 1 המכיל פארווערטס החיצוני (5'-TTC GCT TCA CCT CTG CAC G-3'), הפוכה (5'-AAA לשממ יניינעל ילבולגה דרשמה מס רווחי הון CCC GCG חטיבתי-3') תחל בריכוז של 0.5 מיקרומטר.
3. להוסיף μL 170 של המיקס x PCR 1 בארות A1 ו- E1 לתוך צלחת PCR 96-ובכן.
4. להוסיף 120 μL של המיקס x PCR 1 בארות B1 ל H1.
5. להוסיף 10 μL של ה-DNA הופכיים משלב 2 בארות A1 ו- E1 (2 דוגמאות ההפוכה שונות ניתן לנתח באותה צלחת PCR). לערבב התגובה לכל היטב על ידי בעדינות pipetting כל אחד 10 פעמים משתמש של P1000 מוגדר כ- 100 μL.
6. באופן סדרתי שתדללו דגימות בארות A1 כדי D1 ביחס של 1:3 על ידי העברת μL 60 בכל שלב. לערבב את הבארות בכל שלב על ידי בעדינות pipetting אותם על פי 10 השימוש של P1000 מוגדר כ- 100 μL. הימנע ויוצרים בועות. חזור על שלב 3.6 עבור טוב E1, דילול ל H1 היטב.
7. ΜL 10 aliquot של תערובת התגובה באמצעות פיפטה רב ערוצית של בארות A1-H1 לתוך בארות A2-H2, A3-H3, וכן הלאה עד שהגיע בארות A12-H12 של צלחת 96-ובכן. מכסים את הצלחת ה-PCR עם המשטח יבש סיליקון מהשלב 3.1, כשאגיד.
8. מקם את הצלחת במכונת ה-PCR ולהפעיל את התוכנית הבאה: 10 דקות ב 95 מעלות צלזיוס; 35 מחזורי 15 s ב 95 ° C, 15 s ב 54 ° C ו 3 דקות ב-72 מעלות; 7 דקות ב-72 מעלות; . אז, להחזיק את הצלחת בטמפרטורת החדר.
9. מחממים את הסיכות של משכפל 96-pin כדי לוהט עם מבער בונזן, ואז להתקרר למשך לפחות 5 דקות בטמפרטורת החדר.
10. למלא הבארות של צלחת PCR השנייה עם μL 10 של תערובת x PCR 1 (מכיל מאגר עומס-מוכנות ג'ל), פארווערטס הפנימי (5'-CGC ATG איסור פרסום ACC ACC חברתנו A-3'), הפוכה (5'-CAC AGC CTA GCA GCC ATG G-3') ב- 0.5 מיקרומטר.
11. בזהירות להסיר הצלחת ה-PCR של צלחת 96-ובכן מ- PCR בסיבוב הראשון שטיח סיליקון, ולהימנע זיהום צולב בין בארות.
12. השתמש המשכפלים מקורר להעביר את המוצרים ה-PCR של צלחת 96-ובכן מ- PCR בסיבוב הראשון לצלחת 96-ובכן aliquoted לאחרונה. לבצע את ה-PCR המקונן משתמש באותם התנאים כמו שלב 3.8, למעט שינוי השלב הראשוני דנטורציה ב 95 ° C מ- 10 דקות ל- 2 דקות.

4. PCR מוצר בידוד והפקת ג'ל

1. לנתח את המוצרים PCR על-ידי שימוש 96-ובכן עם 1.3% w/v agarose ג'ל אלקטרופורזה בג'ל. עבור agarose 100 מ ל ג'ל, הפעל ב- 200 וולט למשך 10-15 דקות.
2. בלו הלהקות דנ א ג agarose באמצעות קשיות שתייה חד פעמיות. עבור כל מוצר ה-PCR, למקם את הקש, agarose ג'ל לחבר צינור 1.5 mL ולחיתוך הקש לגודל עם מספריים.
   הערה: זה מספיק כדי לבודד להקות רק מפני דילולים האלה שבהם ניתן לפתור מוצרי ה-PCR יחיד.
3. (אופציונלי) אחסן את הצינורות ב-20 ° C לחילוץ מאוחר יותר.
4. הוצאת השתלים agarose לתוך כל שפופרת לוחצת על הסוף של השבר קש. להוסיף 300 μL ג'ל החילוץ מאגר ו μL 5 של ג'ל החילוץ זכוכית חרוז slurry כל שפופרת.
5. לחלץ את המוצרים PCR לפי הוראות היצרן עבור ערכת חילוץ ג'ל (למעט שימוש חצי-אמצעי אחסון לכביסה צעדים), elute את ה-DNA של החרוזים עם 30 μL של מים.
6. שלח את ה-DNA מטוהרים עבור סנגר רצף (לפי ההוראות של הספק) עם פריימר לפנים המשמשים את הסיבוב השני מקונן PCR.

5. רצף ניתוח

1. לאשר תאים וירוס DNA צמתים על ידי ביצוע ניתוח הפיצוץ נוקלאוטיד (באמצעות הגדרות ברירת המחדל של יישור לאוסף נוקלאוטיד כולו).
   הערה: תוצאות ייצוגית מפורטים איור 3 להלן.
   1. אם רק יישור חלקי של הרצף נצפית, לקצץ את 5' HBV DNA רצף לפני הפעלה מחדש ניתוח הפיצוץ.
2. החלת קריטריוני הבחירה מחמירים כדי לקבוע אם רצף נתון מייצג שילוב נכון צומת כדלקמן:
   1. כוללים רק רצפים המכיל > 20 bp של רצף הסלולר עבור בטוח מיפוי הגנום הסלולר.
   2. להתעלם כל רצפי המכילים הגבלת אתרים של כל אנזימים שמוצעת 10 bp של הצומת שילוב תאים וירוס אמור, כפי שהם מייצגים סביר במבחנה מצדו אירועים במקום שילוב נכון צמתי.
   3. להתעלם כל רצפי עם רמות קרינה פלואורסצנטית ברור שיא שונה משני צדי הצומת אינטגרציה אמור ב רצף כרומטוגרפי, שכן הן הסבירות חפצים שנוצרו על-ידי זיהום צולב במהלך התגובה רצף או צינור קפילר כרומטוגרפיה.
   4. מגדירים אירועי שילוב ייחודי כמו אלה עם HBV המדויק, רצפים הסלולר בצומת תאי וירוס.
      הערה: חזרה על אירועי שילוב ייחודי יכול לנבוע משובט הרחבה של תאים המכילים שילובים אלו או זיהום צולב במהלך ה-PCR (אשר יכול להיבדק באמצעות שלילי-לשלוט בתגובותיו, מפורט נוסף בתוצאות נציג להלן). שילובים חוזרות לתוך רצפים ספציפיים הסלולר צפויים להציג אתרים שונים של מסוף HBV עבור כל אירוע אינטגרציה, כמו מסלולים שאינם הומולוגיים סוף מצטרף גם בשימוש¹⁵.
3. לחשב את תדירות אינטגרציה על-ידי הכפלת הגורם דילול של תבניות DNA הפוכה על ידי מספר צמתים וירוס-תא זוהה ליד זה דילול, ואחריו נורמליזציה לסכום הכולל DNA קלט לתוך התגובה היפוך. באופן כללי, תדירות אינטגרציה היא הסדר 1:10⁴ תאים.

ייצוג סכמטי של הטכניקה invPCR מוצג באיור1. דוגמה agarose בג'ל של invPCR מוצלח מוצג באיור 2 לפני ואחרי הבידוד מוצר ה-PCR. איור 3 מראה את הפלט ניתוח הפיצוץ מהשלב 5.1 במקרים של הגברה (i) של צומת ה-DNA וירוס-תא ו (ii) הגברה של ביניים replicative HBV DNA.

צפוי תוצאות חיוביות פקדים: Huh7-NTCP תאים נגועים מטוהרים הפארין HBV מניות כפי שתואר לעיל (איור 1) יכול לשמש פקד חיובי. במקרה זה, מוצרי ה-PCR יחיד צריך להיות מושגת על ידי דילול 1:3 השני או השלישי של כל דגימה (תואם ל- ~ 104 תאים המקבילים לכל דילול, איור 2). -אלה דילולים, כ- 50% של מוצרים מייצגות וירוס אמיתי-תא DNA צמתים, בעוד החצי השני מייצג הגברה של HBV DNA intermediates (איור 3).

מחקרים קודמים13, מצאנו כמה מופעים של צמתי תא וירוס חוזרות ונשנות, רומז אין אתרי גנומית הסלולר של אינטגרציה HBV DNA מועדף. גם נמצא כי ^80% של תאים וירוס צמתי להתרחש בין נוקלאוטידים 1732 ו- 1832 (לפי נוקלאוטיד המספור של HBV גנוטיפ D, ההצטרפות GenBank #U95551.1), כאשר האחרון מייצג הסופית יד ימינו של הטופס dslDNA HBV. רצפים של צמתי וירוס אמיתי-תא מצא דרך השיטה שלנו ניסויים במבחנה זמינים בפומבי ב GenBank (ההצטרפות מספרים MH057851 כדי MH058006).

צפוי תוצאות שליליות פקדים: uninfected Huh7-NTCP תאים או מחוסן Huh7-NTCP תאים טרום טיפול עם Myrcludex B יכול לשמש כפקדי שלילי. ניתוח InvPCR של ה-DNA שחולצו מן התאים האלה צריך לייצר מוצרים PCR. הפעלת הדגימות שלילי-פקד באותה צלחת PCR כדוגמאות חיובית מאפשרת בדיקה של זיהום צולב במהלך תהליך מקונן-PCR. הבדיקה המחמירים ביותר של זיהום צולב הוא הפעלה של מדגם שלילי-בקרה בבארות A-D והמדגם חיובי בבארות E-H על צלחת 96-ובכן. במקרה זה, דילול הכי מרוכז של המדגם חיובי מופעל ברציפות סמוכים ישירות הדילול לפחות מרוכז של הדגימה שלילית. אם מוצרי הגברה הם נצפו בדגימות שלילי-control, מכון האמצעים הציע בדיון כדי למזער את אירועי זיהום צולב.

איור 1: איור סכמטי של תהליך invPCR כדי לזהות HBV DNA שילובים. לאחר זיהום HBV, רק מיעוט של תאים Huh7-NTCP מכילות HBV dslDNA (אדום) משולב לתוך הגנום של התא המארח (אדום), מתואר בחלק העליון. סה כ ה-DNA ואז שחולצו מן התאים (שלב 1), הפוכה (שלב 2), מוגבר על ידי ה-PCR מקוננים (שלב 3). מוצגות היחסיים של האתרים אנזים הגבלה (המש BsiHKAI ואני) בצומת DNA תאי וירוס נכרת. הדמות היא ממאמרו של הפרסום הקודם13. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2: Agarose ג'ל אלקטרופורזה והפקת ג'ל עוקבות invPCR מוצלח. "M" מייצג את הסולם סמן הדנ א. כל שורה של 12 מייצג משכפל טכני-לדילול יחיד על הצלחת ה-PCR. ניתן להפעיל את שתי דגימות DNA הופכיים לכל PCR צלחת/agarose ג'ל. מוצרים PCR עבור כל דילול אמור titrate בחוץ ב ~ 1:3 יחס. הפקת המוצרים מן דילולים מרוכז לפחות שני איפה להקות יחיד ניתן בקלות לבודד מספיקה בדרך כלל, כפי שיעור אינטגרציה HBV DNA נקבעת על-ידי טיטור מובילים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3: הפיצוץ אנליזה של רצפים המוצר invPCR. כפי ספינלי ארוך של רצף מופקים מן סנגר רצף, המקור של רצפי DNA הוא בדרך כלל ברורה וחד משמעית. יישור חזקה HBV ו הגנום הסלולר נצפית בתחומים שונים של הקובץ רצף FASTA המופקים סנגר רצף בחלונית העליונה ', רומז צומת ה-DNA תאי וירוס אמיתי. בחלונית התחתונה, מיישר הרצף רק על שברי הגנום HBV, מציעה מוצר שנוצר על ידי ההגברה של HBV DNA הגנום שסודר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

בוגרות הוא המועמד שותף, שותף ממציא פטנטים מגן Myrcludex B כמו מעכב כניסה HBV/HDV. טי. מצהיר שאין ניגודי אינטרסים.