מאמר שיטה

אדהזיה דינמי Assay לניתוח פונקציונלי של טיפולים למניעת הידבקות במחלות מעי דלקתיות

DOI:

10.3791/58210

⸱

20 בספטמבר 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine 1, University of Erlangen-Nuremberg

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אדהזיה דינמי של תאים חיסוניים לקיר כלי הוא תנאי הכרחי בטן יונת. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול עבור assay פונקציונלי במבחנה לניתוח ההשפעה של נוגדנים אנטי-אינטגרין, נוגדנים או גורמים אחרים על הדבקה תא דינמי של תאים אנושיים באמצעות addressin מצופים נימים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יונת הבטן של תאים חיסוניים חשוב בפתוגנזה של מחלות מעי דלקתיות (מחלת המעי הדלקתי). אינטגרין תלויית התא הדבקה על addressins שלב חיוני בתהליך זה, אסטרטגיות טיפוליות המפריעים אדהזיה הוקמו בהצלחה. הנוגדן אינטגרין anti-α4β7, vedolizumab, משמשת לטיפול קליני של מחלת קרוהן (CD) ו קוליטיס (UC) ותרכובות נוספות נוטים לעקוב.

הפרטים של ההליך אדהזיה ו את מנגנוני הפעולה של נוגדנים אנטי-אינטגרין עדיין אינם ברורים בנוגע רבים בשל השיטות הזמינות מוגבל לחקר תפקודית בתחום זה.

כאן, אנו מציגים וזמינותו אדהזיה דינמי עבור ניתוח תפקודי של התא האנושי אדהזיה תחת תנאי זרימה וההשפעה של טיפולים אנטי-אינטגרין בהקשר של מחלת המעי הדלקתי. הוא מבוסס על זלוף תאים אנושיים הראשי דרך נימים addressin מצופה זכוכית ודק במיוחד עם ניתוח מיקרוסקופי בזמן אמת. וזמינותו מציע מגוון רחב של הזדמנויות עבור ליטושים והשינויים ומחזיק פוטנציאל תגליות מכניסטית ויישומים translational.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תא תנועה הוא תהליך מוסדר בחוזקה לארגונה ההתפתחות והתפקוד של אורגניזמים רב תאית, אך הוא גם מעורב בפתוגנזה של שפע של מחלות1. לאחרונה, תהליך הביות של תאים חיסוניים של זרם הדם אל רקמות היקפיים צברה תשומת לב גדלה והולכת, מאז היא תורמת חידוש מלאי והרחבה של תאים פתוגניים ברקמות דלקתי במחלות immunologically בתיווך2 ,3. בפרט, יונת הוכח שיש רלוונטיות translational במחלות מעי דלקתיות (מחלת המעי הדלקתי). טיפולי אנטי-α4β7 אינטגרין נוגדן vedolizumab הפרעה המעיים יונת הראה יעילות בניסויים קליניים גדולים4,5 , נעשה בהצלחה בעולם האמיתי הקלינית6,7 , 8. תרכובות נוסף נוטים לעקוב אחר9,10. באופן דומה, הנוגדן אינטגרין טיפולי אנטי-α4, natalizumab, משמשת לטיפול של טרשת נפוצה (MS)11.

אולם, שלנו פונקציונלי להבנת תהליך הביות באופן כללי, מנגנון הפעולה של נוגדנים טיפולית כזה בפרט הוא עדיין מוגבל. היא מבוססת היטב כי יונת כוללת מספר שלבים לרבות תא tethering, מתגלגל עם תא עוקבות אדהזיה שמוביל המשרד מעצר ואחריו טרנס ההעברה אנדותל12,13. הנוגדנים הנ ל לנטרל אינטגרינים על פני התא מניעת אינטראקציה עם addressins על אנדותל של הקיר כלי. זה נחשב לעכב תא המשרד אדהזיה14,15. ובכל זאת, אנו רק מתחילים להבין את הרלוונטיות דיפרנציאלית של אינטגרינים ספציפי עבור תא אירוח של קבוצות משנה נפרדות תא. יתר על כן, ההשפעות של נוגדנים אנטי-אינטגרין על שונים תא קבוצות משנה ואינם שיוכים מנה-תגובה במידה רבה ידועים שמוביל המון שאלות פתוחות בתחום של טיפולים ביות והצמדות אנטי-בטן ב מחלת המעי הדלקתי.

לכן, כלי עבודה נוחים כדי לטפל שאלות כאלה יש צורך נואשות. ההשפעה של נוגדנים אנטי-אינטגרין על האינטראקציה addressin-אינטגרין עד כה בעיקר יוערכו על-ידי הערכת יעילות/איגוד מחייב עיכוב עם cytometry זרימה או דרך הידבקות סטטית מבחני16,17 ,18,19,20, ובכך עם פישוט לכאורה, סטייה במצב פיזיולוגי. לאחרונה הקמנו assay אדהזיה דינמי ללמוד תלויי-אינטגרין הידבקות של תאים אנושיים כדי addressins ואת ההשפעות של נוגדנים אנטי-אינטגרין תחת גזירה2. העיקרון של הטכניקה הוכח מקודם עם העכבר תאים21,22. . כאן, זה היה הותאם ופיתח להתייחס אל כל השאלות translational שהוזכרו לעיל, הפתיחה השדרות רומן טוב יותר להבין את המנגנונים של טיפול עם אנטי-אינטגרין נוגדנים ויוו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחקרים שתוארו בסעיפים הבאים בוצעו על פי אישור של ועדת האתיקה של אוניברסיטת פרידריך-אלכסנדר ארלנגן-נירנברג.

1. הכנת נימים

  1. להתחבר נימים מלבני לאורך צינור גומי על ידי מתיחה לאורך צינור בצד אחד עם מספריים קטנות והכנסת בקפידה את נימי (כ 0.5 ס מ) לתוך הצינור. חותם את הקשר בין נימי צינור עם סרט פרפין פלסטיק.
  2. מעיל של נים עם µL 20 addressin (recombinant Fc כמירה; 5 µg/mL addressin, כגון MAdCAM 1, במאגר ציפוי (150 מ מ NaCl + 1 מ HEPES)) או הפתרון בקרת isotype המתאים באמצעות פיפטה p20 (נוזל יציף עצמה לתוך נימי). לאחר מכן, לאטום את הצד אינו מחובר את הצנרור עם הסרט פלסטיק פרפין, תקופת דגירה של פחות שעה ב 37 º C. שימוש נימי מלא רק עם המאגר ציפוי או עם הפקד המתאים isotype כפקד שלילי.
  3. להסיר את הסרט פלסטיק פרפין מקצה נימי, לרוקן את הציפוי בכך שהוא מאפשר את להשרות נוזל החוצה נימי על נייר מגבת ולחסום נימים במשך לפחות שעה עם 20 µL של חסימת פתרון (1 x PBS עם 5% BSA) ב 37 º C. חותם בצידי פתח נימי עם סרט פרפין פלסטיק. אל תסיר הפתרון החסימה לפני שימשיך מיקרוסקופ.

2. תא בידוד, טיפול והכנה מיקרוסקופ

הערה: השלבים ניתן לבצע במהלך תקופות הדרושים להכנת נימי.

  1. לאסוף 18 מ של דם אנושי מלא anticoagulated עם אוסף דם אספטי של וריד cubital התנדבות אנשים (למשל, מחלת המעי הדלקתי חולים ו/או פקדים בריא) לאחר הסכמה בכתב מושכלת בהתאם לנהלים המקומי ועדת האתיקה.
    הערה: שלב זה צריך לבצע אך ורק על ידי צוות רפואי מיומן ומנוסה לפי תקנות לאומי ו/או מקומיים.
  2. למלא את הדם לתוך צינור 50 מ ל ו לדלל לאמצעי אחסון של 35 מ עם 1 x PBS. אז זאת דר תערובת דם-PBS עם 10 מ"ל של צפיפות בינונית הדרגתיות.
  3. לבצע צפיפות צנטריפוגה הדרגתיות עבור 15 דקות ב x 800 גרם ו- 24 ° C ללא בלמים כדי להפריד בין תאים.
  4. לאסוף את תאי תאי הדם ההיקפיים (PBMCs) על ידי כ רפה בעברית השכבה תא לבן ישר לראש צפיפות צבע בינוני השכבה (שכבה אמצעית ברור). העברת PBMCs לתוך צינור מ"ל, למלא עד 50 מ עם 1 x PBS, צנטריפוגה 10 דקות 300 x g ו- 10 מעלות צלזיוס.
  5. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend בגדר תא ב- 10 מ"ל של 1 x PBS, לאחר מכן לספור מספרים תא, למשל, באמצעות תא נויבאואר ספירת קאמרית.
  6. אופציונלי: ללמוד הידבקות של גרנולוציטים בצע את ההליך הבא. אחרת, להמשיך עם שלב 2.7 או 2.8.
    1. לאסוף את השכבה גרנולוציט (השכבה התחתונה ביותר לאחר צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות המכיל גם את אריתרוציטים). Resuspend התאים ב- 40 מ ל 1 x PBS. לאחר מכן להוסיף 8 מ של 6% לתוספי ב- PBS 1 x, לערבב בעדינות ולתת משקעים תאים למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
      הערה: אריתרוציטים ישקעו לתחתית הצינור, ואילו הגרנולוציטים יישאר ההשעיה.
    2. לאחר 30 דקות, לאסוף את תגובת שיקוע, להעביר לתוך צינור מ"ל צנטריפוגה במשך 6 דקות 300 x g ו- 4 מעלות צלזיוס. למחוק את תגובת שיקוע ואת lyse של אריתרוציטים הנותרים על-ידי הוספת 5 מ של 0.2% NaCl ב- ddH2O. Incubate עבור 1 דקות.
    3. הוסף 5 מ של 1.4% NaCl ב- ddH2O דגירה עוד דקה. לעצור את פירוק היפוטוניק על-ידי הוספת 20 מ"ל של 1 x PBS, צנטריפוגה עבור 6 דקות ב x 300 גרם ו- 4 מעלות צלזיוס.
    4. Resuspend בגדר תא ב- 10 מ"ל של 1 x PBS. לאחר מכן, ספירת מספרי הטלפון הנייד באמצעות תא נויבאואר ספירת קאמרית.
  7. אופציונלי: ללמוד את הידבקות של קבוצות משנה PBMC, לטהר לסוגי תאים שונים או קבוצות משנה (למשל, CD4+ ו CD8+ T תאים או CD19+ B תאים) באמצעות גרגרי לפי הפרוטוקול של היצרן או על-ידי לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית תא מיון (FACS). אחרת, להמשיך עם שלב 2.8.
  8. Centrifuge התליה תא 10 דקות 300 x g ו- 10 מעלות צלזיוס. למחוק את תגובת שיקוע, כתם תאים עם תאים מעקב צבע (למשל, CFSE) על פי הוראות היצרן.
  9. לאחר מכן, centrifuge את התאים עבור 10 דקות ב x 300 גרם, ולמחוק את תגובת שיקוע. Resuspend ב- 1 x PBS, לקבוע את מספר הטלפון ואת צנטריפוגה שוב למשך 10 דקות ב x 300 גרם.
  10. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend בגדר תא ויטראז'ים ב הכמות המתאימה של מאגר אדהזיה (150 מ מ NaCl + 1 מ HEPES + MgCl 1 מ2 + 1 מ מ CaCl2) כדי לקבל השעיה של 1.5 x 106 תאים למ"ל. לאחר מכן, הוסף את הכמות המתאימה של 100 מ מ MnCl2 בריכוז הסופי של 1 מ מ.
    הערה: תאים אלה מוכנים עכשיו מיקרוסקופ.
  11. אופציונלי: מתייחסים לתאים עם ציטוקינים, נטרול נוגדנים או תרכובות אחרות. אחרת, להמשיך את שלב 3.
    1. להשמיט שלב 2.10, resuspend בגדר תא מוכתם מהשלב 2.9 RPMI בינוני (עם 10% FBS ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין) בריכוז של 1.5 x 106 תאים למ"ל.
    2. פיפטה 1 מ"ל של ההשעייה תא לתוך בארות רבות של צלחת 48-ובכן כפי ישנם תנאים כדי להיות מנותח. תמיד הכינו באר אחת עם תאים שלא טופלו כדי להיות perfused דרך נימי ללא ציפוי כפקד שלילית וכל אחד עם תאים שלא טופלו כדי להיות perfused דרך נימי addressin מצופים כפקד חיובי.
    3. לטיפול עם נוגדנים anti-אינטגרין, להוסיף את הכמות המתאימה של נוגדנים (למשל, 10 vedolizumab µg/mL) התליה תא. תקופת דגירה של h 1-37 מעלות צלזיוס. הטיפול בעזרת ציטוקינים, להוסיף את הכמות המתאימה של ציטוקין רקומביננטי (למשל, 10 ng/mL CXCL10) התליה תא. תקופת דגירה של 5 דקות ב 37 º C.
    4. לאחר דגירה, קציר תאים על-ידי resuspending תאים מספר פעמים באמצעות פיפטה של p1000. העברת תאים לתוך צינור 2 מ"ל, לשטוף היטב שוב עם 1 מ"ל של PBS 1 x ולהוסיף הצינור 2 מ"ל. לקבוע את המספר הסלולרי.
      הערה: דגירה של אוכלוסיות תאים חסיד (למשל, ומונוציטים) עשוי לדרוש אמצעים נוספים (למשל., טיפול עם טריפסין) כדי לנתק את התאים מהצלחת.
  12. צנטריפוגה תאים עבור 10 דקות ב x 300 g ב- 10 מעלות צלזיוס. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend בגדר תא ב הכמות המתאימה של מאגר אדהזיה לקבל השעיה של 1.5 x 106 תאים למ"ל. לאחר מכן, הוסף את הכמות המתאימה של 100 מ מ MnCl2 בריכוז הסופי של 1 מ מ. כאשר pretreating עם נוגדנים אינם מוסיפים MnCl2 התליה תא. תאים אלה מוכנים עכשיו מיקרוסקופ.
    הערה: האחסון המזערי משמש וזמינותו היא תלויה המשאבה ואת צינורות בשימוש. במחקר זה, באמצעות משאבת סחרור של הצנרת המצוין בטבלה של חומרים, נפח מינימלי של 400 µL היה נדרש. אם הרצוי, ישים (בהתאם לסוג התא תשואה) ניתן להגדיל את הריכוז תא ההשעיה למדוד הדבקה גבוה יותר תוך תקופה קצרה של זמן.
  13. פוטנציאל השינוי: assay תחרותי דינמי אדהזיה
    1. בצע את השלבים הנ עם אוכלוסיות תאים שונים לצורך השוואה אחד לשני (למשל, רגולציה ו אפקטור T תאים מבודדים באמצעות בידוד חרוז מגנטי בעקבות הוראות היצרן לפי שלב 2.7).
    2. כתם לכל האוכלוסייה עם צבע שונה (למשל, CFSE ו FarRed) כפי שמתואר צעדים 2.8 – 2.9 היכולת להבדיל בין אוכלוסיות תאים במהלך מיקרוסקופ.
    3. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend כדורי תא ויטראז'ים ב הכמות המתאימה של מאגר אדהזיה (150 מ מ NaCl + 1 מ HEPES + 1 מ MgCl2 + 1 מ מ CaCl2) כדי לקבל השעיה של 1.5 x 106 תאים למ"ל.
    4. לערבב נפחים שווים של המתלים התא (למשל, 500 µL של תאי T רגולטוריים) ו- 500 µL אפקטור T תאים כדי להשיג סופית מעורב תא ריכוז של 1.5 x 106 תאים למ"ל. לאחר מכן, הוסף את הכמות המתאימה של 100 מ מ MnCl2 בריכוז הסופי של 1 מ מ. כזאת השעיות לאחר מכן ניתן לניתוח תחרותי של תהליך הדבקה על ידי פרפוזיה אוכלוסיות תאים שונים דרך נימי אותו.

3. חיים תא הדמיה של אדהזיה דינמי

  1. הפעלת המיקרוסקופ, בחר במסנן המתאים או לייזר כדי לעורר את התא מעקב dye(s) (למשל, 488 ננומטר לייזר עבור CFSE), אובייקטיבית המתאים (למשל, 40 X), רכישת מצב המאפשר זמן לשגות לדימות.
  2. הסר את הסרט פלסטיק פרפין מקצה נימי וחבר את נימי עם חתיכה קצרה של אבובים (כ 5 ס מ אורך) על ידי מתיחה לאורך צינור בצד אחד עם מספריים קטנות והכנסת בקפידה את נימי (כ 0.5 ס מ) לתוך הצינור. חותם את החיבור בין נימי צינור עם הסרט פלסטיק פרפין.
  3. לטעון את נימי על מגש קיבעון (למשל, מכסה מצלחת 6-ובכן עם מלבני לגזור את מעט קצר יותר מאורך נים) ומניחים את נימי קבוע על מגש האוחז המיקרוסקופ, כך נימי נמצא המוקד ומוכן עבור מיקרוסקופ.
  4. הכנס לאורך צינור גומי לתוך החריץ המתאים של המשאבה ממברנות ולמקם הסוף שאינו מחובר את נימי לאמבטיה מדגם עפ י המכיל התליה תא. הכנס הצינור קצר בצד השני של נים צינור 15 מ"ל. לאיסוף זרימה דרך.
  5. . תן את המילוי אבובים עם קצב זרימה של 500 µL לדקה עד התליה תא מגיע כמעט את נימי. אז תן מילוי קפילרי קצב זרימה של µL 100/min.
    הערה: מהיר להתמלא של נים מבטיחה בהתפלגות רגילה של התליה תא פנימה נימי.
  6. כאשר נימי מתמלא התליה תא, להתאים את קצב הזרימה כדי µL 10/min.
    הערה: המחירים זרימה הללו עשויים להשתנות, כאשר נימים של גודל שונה או משאבות סחרור שונים משמשים. במחקר זה, קצב הזרימה של µL 10/min אופטימלי עבור משאבת ו נימים לחקות ויוו זרימת הדם.
  7. לכידת תמונות בצילום מואץ של תאי עובר לאט דרך נימי לאורך addressin מצופים בתוך הקיר כל 2 s עבור סכום כולל של 3 דקות.
    הערה: במרווחי זמן של הזמן הכולל עשויות להשתנות בהתאם לסוג התא שאלה שתפנה.
  8. לפני השלכת את נימי, מסך את כל נימי דרך היצירה העין של מיקרוסקופ כדי לוודא כי הסעיף שמוצג על הוידאו הוא נציג. במידת הצורך, לבצע הקלטה השני.
  9. ללא הצנרת מהמשאבה ולתת את הנוזלים הנותרים לרוץ בחזרה לתוך הצינורית 2 מ"ל, ולאחר מכן נתק את נימי אבובים ממגש קיבוע ולהמשיך נימי הבא.

4. הערכה וספירת תא

  1. לפתוח את רצף זמן לשגות עם התוכנה המתאימה ולייצא את התמונות הראשון שלוש ("התחלה") ותמונות שלושת ("סיום") כקובצי Tiff.
  2. שלושה "מתחיל" התמונות ב- ImageJ, פתוח להמיר ל- 32 סיביות ('תמונה | סוג | 32 סיביות ') מיזוג תמונות (' תמונה | צבע | למזג ערוצי; להקצות את הצבעים אדום, ירוק וכחול תמונות שונות). המרת תמונה ללא הפרדות צבע RGB (' תמונה | Type-RGB') ולשמור כקובץ Tiff. חזור עם תמונות "סיום".
    הערה: במבחני אדהזיה תחרותי דינמי עם תאים צבעונית עם צבעים שונים, לפצל תחילה את הערוצים של תמונות כדי לנתח את הידבקות של אוכלוסיות תאים שונים בנפרד.
  3. לספור את התאים הלבנים גלויות ב- "התחלה" של "סיום" הפרדות צבע, החסר את מספר התאים הלבנים "מההתחלה" את התאים הלבנים בסופו של דבר"".
    הערה: ההבדל מייצג מספר לאחרונה הקפדה תאים במרווח זמן 3 דקות. בתמונה ללא הפרדות צבע, תאים שזז גלויים בצבע מסוים שובץ למסגרת המתאימים מאז הם בתרגום במקום אחר במסגרת הקודמים והבאים. עבור תאים שנמצאים כנצרות, האותות אדום, ירוק וכחול באותו החפיפה ספוט ללבן.
  4. כדאי להמחיש את התוצאות, לקמפל וידאו רצפי זמן לשגות, למשל, באמצעות ImageJ.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השיטה המובאת כתב יד זה שואף לדמות התהליך ויוו של התא האנושי אדהזיה לקיר אנדותל פונקציונלית ככל האפשר כדי להעריך תא אדהזיה ואת התפקיד של נוגדנים מפריעות. לכן, נימים זגוגית מצופה addressins, perfused עם תאים אנושיים fluorescently שכותרתו עניין באמצעות משאבה זלוף. ניתן לצפות באמצעות תא חי הדמיה את הידבקות תאים אנושיים כדי addressins בזמן אמת (איור 1).

שיטה זו מתאימה במיוחד התירי את המנגנונים ש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול הנ ל מתאר טכניקה שימושית ללמוד אדהזיה דינמי של תאים חיסוניים אנושי כדי ליגנדים אנדותל. דרך וריאציה על ליגנדים מצופה, סוגי תאים perfused או קבוצות משנה, דגירה עם גירויים נוספים או נטרול נוגדנים שונים, הוא כמעט בלתי מוגבל של יישומים אפשריים. לכן, מבחני אדהזיה דינמי כזה עשוי להיות שימושי לענות על שתי שאלות עקרוניות של מחקר בסיסי, כמו גם שאילתות translational שיכול לעזור לפתח, לייעל את הטיפול הקליני עם סמים מפריעים לתהליך אדהזיה.

השירות של וזמינותו לחקור את ההשפעות של טיפולים אנטי אדהזיה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M.F.N. שימש כיועץ עבור Pentax, ג'וליאני, MSD, Abbvie, ינסן, טקדה ו- Boehringer. M.F.N., ש ז קיבל תמיכה במחקר טקדה, רוש.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחקר של CN, IA, מחוברים MFN SZ נתמך על ידי המרכז הבינתחומי למחקר קליני (IZKF), תוכנית ELAN את אוניברסיטת ארלנגן-נירנברג, Kröner-Fresenius-Stiftung אחר, פריץ-בנדר-Stiftung, קרוהן, גרמנית ו קוליטיס קרן (DCCV), טופס קבוצת מחקר קליני של הגרמנית למחקר המועצה (DFG), התוכנית נושא DFG על Microbiota, היוזמה שדה המתעוררים את DFG שיתופי מחקר מרכזי 643, 796 and 1181.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צלחת 48 בארותSarstedt833,923
מאגר הדבקה: 150 מ"מ NaCl + 1 מ"מ HEPES + 1 מ"מ MgCl2 + 1 מ"מ CaCl2
פתרון חסימה: 1x PBS ב-ddH2O + 5% BSA
סרום בקר אלבומין (BSA)ApplichemA1391,0100
CaCl2Merck2382
נימים: צינורות בורו מלבן 0.20 מ"מ x 2.00 מ"מ ID, אורך 50 מ"מCM Scientific3520-050
CCL-2,כלי חיסון11343384
CD4-Microbeads, HumanMiltenyi Biotec130-045-101
CellTrace™ ערכת התפשטות תאים CFSEThermoFischer ScientificC34554
צנטריפוגה (Rotixa 50 RS)הטריך
: 150 מ"מ NaCl + 1 מ"מ מיקרוסקופ קונפוקלי HEPES
(TCS SP8)Leica
CXCL-10,כלי חיסון11343884
Dextran 500Roth9219.3
EDTA KE/9 מ"ל MonovetteSarstedt
Falcons (50 מ"ל)Sarstedt62,547,004
Fc כימרה בקרת איזוטיפR& D Systems110-HG
קצב זרימה משאבה פריסטלטית (LabV1)Baoding Shenchen חברת
HEPESVWRJ848-100ML
בקרת איזוטיפ IgG אנושיתThermoFischer Scientific31154
מולקולת הידבקות בין-תאית 1 (ICAM-1) Fc כימרהR& D Systems720-IC-050
LS-ColumnsMiltenyi Biotec130-042-401
MgCl2>Roth
MnCl2Roth
mouse בקרת איזוטיפ IgGMiltenyi Biotec130-106-545
כתובת כלי דם רירית במולקולת הידבקות תאים 1 (MAdCAM-1) כימרה Fcמו"פ D Systems6056-MC
NaClRoth3957.3
NatalizumabBiogen
Neubauer RothT729.1
Pancoll, HumanPAN BiotechP04-601000
תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) BiochromL 182-10w/o סרט פרפין מפלסטיק Mg ו-Ca
: Parafilm (PM-996)VWR52858-000
מטוהר אנטי-אנושי CD18Biolegend302102
RPMI Medium 1640Gibco Life Technologies61870-010
צינורות גומי: צינורות LMT-55 SC0059T 3 מצבים, 1.02 מ"מ ID, אורך 406.4 מ"מIsmatecSC0059
פיפטססרולוגי Sarstedt861,254,025
טריפן כחולרוטCN76.1
מולקולת הידבקות תאי כלי דם 1 (VCAM-1) כימרה FcBiolegend553706
Vedolizumab (Entyvio)Takeda
אנושיים מאגר ציפוי אנושיים משאבות דיוק תא ספירה של

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. von Andrian, U. H., Mackay, C. R. T-Cell Function and Migration - Two Sides of the Same Coin. New England Journal of Medicine. 343 (14), 1020-1034 (2000).
  2. Zundler, S., et al. The α4β1 Homing Pathway Is Essential for Ileal Homing of Crohn's Disease Effector T Cells In Vivo. Inflammatory Bowel Diseases. 23 (3), 379-391 (2017).
  3. Binder, M. -T., et al. Similar inhibition of dynamic adhesion of lymphocytes from IBD patients to MAdCAM-1 by vedolizumab and etrolizumab-s. Inflammatory Bowel Diseases. , in press (2018).
  4. Feagan, B. G., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for ulcerative colitis. The New England Journal of Medicine. 369 (8), 699-710 (2013).
  5. Sandborn, W. J., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for Crohn's disease. The New England Journal of Medicine. 369 (8), 711-721 (2013).
  6. Baumgart, D. C., Bokemeyer, B., Drabik, A., Stallmach, A., Schreiber, S. Vedolizumab Germany Consortium Vedolizumab induction therapy for inflammatory bowel disease in clinical practice--a nationwide consecutive German cohort study. Alimentary Pharmacology & Therapeutics. 43 (10), 1090-1102 (2016).
  7. Kopylov, U., et al. Efficacy and Safety of Vedolizumab for Induction of Remission in Inflammatory Bowel Disease-the Israeli Real-World Experience. Inflammatory Bowel Diseases. 23 (3), 404-408 (2017).
  8. Amiot, A., et al. Effectiveness and Safety of Vedolizumab Induction Therapy for Patients With Inflammatory Bowel Disease. Clinical Gastroenterology and Hepatology: The Official Clinical Practice Journal of the American Gastroenterological Association. 14 (11), 1593-1601 (2016).
  9. Vermeire, S., et al. Etrolizumab as induction therapy for ulcerative colitis: a randomised, controlled, phase 2 trial. Lancet. 384 (9940), London, England. 309-318 (2014).
  10. Vermeire, S., et al. Anti-MAdCAM antibody (PF-00547659) for ulcerative colitis (TURANDOT): a phase 2 randomised, double-blind, placebo-controlled trial. Lancet. 390 (10090), London, England. 135-144 (2017).
  11. Miller, D. H., et al. A Controlled Trial of Natalizumab for Relapsing Multiple Sclerosis. New England Journal of Medicine. 348 (1), 15-23 (2003).
  12. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
  13. Ley, K., Rivera-Nieves, J., Sandborn, W. J., Shattil, S. Integrin-based therapeutics: biological basis, clinical use and new drugs. Nature Reviews. Drug Discovery. 15 (3), 173-183 (2016).
  14. Wyant, T., Yang, L., Fedyk, E. In vitro assessment of the effects of vedolizumab binding on peripheral blood lymphocytes. mAbs. 5 (6), 842-850 (2013).
  15. Fischer, A., et al. Differential effects of α4β7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo. Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).
  16. Wyant, T., Estevam, J., Yang, L., Rosario, M. Development and validation of receptor occupancy pharmacodynamic assays used in the clinical development of the monoclonal antibody vedolizumab. Cytometry. Part B, Clinical Cytometry. 90 (2), 168-176 (2016).
  17. Tidswell, M., et al. Structure-function analysis of the integrin beta 7 subunit: identification of domains involved in adhesion to MAdCAM-1. Journal of Immunology. 159 (3), Baltimore, Md. 1497-1505 (1997).
  18. Soler, D., Chapman, T., Yang, L. -L., Wyant, T., Egan, R., Fedyk, E. R. The Binding Specificity and Selective Antagonism of Vedolizumab, an Anti-α4β7 Integrin Therapeutic Antibody in Development for Inflammatory Bowel Diseases. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 330 (3), 864-875 (2009).
  19. Parikh, A., et al. Vedolizumab for the treatment of active ulcerative colitis: a randomized controlled phase 2 dose-ranging study. Inflammatory Bowel Diseases. 18 (8), 1470-1479 (2012).
  20. Wendt, E., White, G. E., Ferry, H., Huhn, M., Greaves, D. R., Keshav, S. Glucocorticoids Suppress CCR9-Mediated Chemotaxis, Calcium Flux, and Adhesion to MAdCAM-1 in Human T Cells. The Journal of Immunology. 196 (9), 3910-3919 (2016).
  21. Nussbaum, C., et al. Sphingosine-1-phosphate receptor 3 promotes leukocyte rolling by mobilizing endothelial P-selectin. Nature Communications. 6, (2015).
  22. Pruenster, M., et al. Extracellular MRP8/14 is a regulator of β2 integrin-dependent neutrophil slow rolling and adhesion. Nature Communications. 6, (2015).
  23. Binder, M. -T., et al. Similar Inhibition of Dynamic Adhesion of Lymphocytes From IBD Patients to MAdCAM-1 by Vedolizumab and Etrolizumab-s. Inflammatory Bowel Diseases. 24 (6), 1237-1250 (2018).
  24. Wang, L., et al. Vessel Sampling and Blood Flow Velocity Distribution With Vessel Diameter for Characterizing the Human Bulbar Conjunctival Microvasculature. Eye & Contact Lens. 42 (2), 135-140 (2016).
  25. House, S. D., Johnson, P. C. Diameter and blood flow of skeletal muscle venules during local flow regulation. The American Journal of Physiology. 250 (5 Pt 2), H828-H837 (1986).
  26. Zundler, S., Neurath, M. F. Pathogenic T cell subsets in allergic and chronic inflammatory bowel disorders. Immunological Reviews. 278 (1), 263-276 (2017).
  27. Zundler, S., Becker, E., Weidinger, C., Siegmund, B. Anti-Adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease-Molecular and Clinical Aspects. Frontiers in Immunology. 8, (2017).
  28. Zhou, Y., Kucik, D. F., Szalai, A. J., Edberg, J. C. Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), (2014).
  29. Zundler, S., et al. Blockade of αEβ7 integrin suppresses accumulation of CD8(+) and Th9 lymphocytes from patients with IBD in the inflamed gut in vivo. Gut. 66 (11), 1936-1948 (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים