כאן, אנו מציגים את הפרוטוקולים כדי לזהות immunomodulators 1) וירוס מקודד המקדמים arbovirus השכפול וגורמים מארח 2) האיקריוטים שמגבילות את שכפול arbovirus. שיטות אלה פלורסצנטיות הפריה חוץ גופית מבוססות מאפשרים להשיג במהירות את המפרט כמותית של שכפול arbovirus ב מבחני פשטני עם יחס אות לרעש נמוך.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
זיהומים arbovirus כמו כלים ההקרנה לצורך זיהוי גורמים אנטי ויראלי Immunomodulators ומנחה
במאמר זה
סיכום
תקציר
התערבות RNA - ו גנום עריכה המבוססת על הקרנת פלטפורמות היה בשימוש נרחב כדי לזהות גורמים התא המארח להגביל את וירוס שכפול. עם זאת, את המסכים הבאים נערכות בדרך כלל בתאים באופן טבעי מתירניות לגורם המחלה ויראלי שנבחנה. לכן, השכפול חזקים של וירוסים בתנאי בקרה עלולה להגביל את הטווח הדינמי של המסכים הבאים. יתר על כן, המסכים הבאים עשויים להיות מסוגל לזהות בקלות מסלולים ההגנה התאית שמגבילות את שכפול הוירוס אם הווירוס הוא סטוש למחשב המארח ובעל יכולת של המאבק הגנות אנטי-ויראלי. במאמר זה, אנו מתארים פרדיגמה חדשה עבור חקר וירוס-פונדקאי אינטראקציות באמצעות מסכי מרכז על זיהומים שנכשל באופן טבעי על ידי arboviruses כגון vesicular stomatitis וירוס (VSV). למרות יכולת VSV לשכפל במגוון רחב של חרקים dipteran ומארח יונקים, VSV עובר זיהום, הכניסה לאחר שנכשל במגוון של שורות תאים שמקורם חרקים lepidopteran, כגון העש צועני (Lymantria dispar). עם זאת, זיהומים VSV שנכשל אלה יכולים להיות "לחלץ" כאשר המארח תא הגנות אנטי ויראליים הם בסכנה. נתאר כמה זנים VSV קידוד גנים כתב נוח ולא מגבילים ל' dispar שורות תאים ניתן לזווג מסכי הגדרת לזהות מארח גורמים מעורבים arbovirus ההגבלה. יתר על כן, אנו גם מראים את התועלת של כלים אלה ההקרנה הזיהוי של גורמים לשווק מקודד להציל VSV שכפול במהלך coinfection, או דרך ביטוי חוץ רחמי, כולל אלה מקודד על ידי וירוסים יונקים. ההגבלה הטבעי של שכפול VSV בתאים dispar ל' מספק יחס אות לרעש גבוה בעת הקרנת עבור התנאים המקדמים הצלה VSV, ובכך מאפשר שימוש פשטני הפריה חוץ גופית - קרינה פלואורסצנטית מבוססי מבחני לפקח השינויים VSV שכפול. מתודולוגיות אלו הם בעלי ערך להבנת יחסי הגומלין בין המארח תגובות אנטי ויראלי התחמקות המערכת החיסונית גורמים.
מבוא
היכולת של וירוס לשכפל באופן פרודוקטיבי שורה מסוימת כפוף באופן חלקי הזמינות של התא המארח גורמים התומכים נגיפי כניסה של שכפול1. הטווח וירוס-המארח יכול גם יכתיב את הקיבולת של וירוס מונה הגנות אנטי ויראליים הסלולר הפוגעים אחרת שכפול ויראלי2,3. זה התוצאה של אינטראקציות אלה מורכבים וירוס-מארח זה בסופו של דבר להחליט אם וירוס יהיה מסוגל להשלים את מחזור חייו מארח מסוים. לאור ההשלכות החולני שעשויות להיות עבור המארח אם שכפול ויראלי מתפתח, זה קריטי לפתח אסטרטגיות ניסיוני כדי לקדם את ההבנה שלנו של אינטראקציות וירוס מפתח-מארח זה יכול להטות את הכף בין שנכשל ופורה זיהומים. שחקרתי את התכונות מולקולרית ש....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. כללי Lymantria dispar (LD652) תא והתרבות וירוס
-
תא LD652 culturing יופיצ
- לתרבות dispar ל'-נגזר LD652 תאים, לשמור על טפט של תאים במדיום הגידול (טבלה של חומרים) מודגרות ב 27 ° C תחת אווירה רגילה. לשמור על התאים במנות רקמות-תרבות-טיפול 10 ס מ, המעבר את התאים בהגיעם 80% confluency.
- צלחת, מכך תאים חסיד LD652 מהצלחת מאת pipetting התקשורת שוב ושוב על גבי חד שכבתי (תאים אלה אינן דורשות trypsinization מכך) של לדלל את הדגימה בתקשורת צמיחה לדחיסות משוער של עונה 1 פרק 105 תאים/מ ל.... פיפטה 1 מ"ל של תרבות/טוב מדוללת של צלחת 24-. טוב. זרע מינימום של שלושה שכפל בארות/טיפול סוג ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כדוגמה של יישומי הדמיה לחיות תאים כדי לפקח VSV הצלה על VACV coinfection, LD652 התאים היו מצופה בצלחת chambered 8-ובכן ואז הנגועים מעושה או נגוע VSV-DsRed (MOI = 1), נוכחות או היעדרות של VACV-FL-GFP (MOI = 25). מאחר VSV-DsRed מבטא DsRed כמו חלבון חינם לא מותך VSV מבניים חלבונים (איור 1 א'), שהוא מתגלה רק לאחר כניסה VSV והביטוי ג'ין יוזם. כל התאים היו אז המסומנת לצבוע הכדאיות תא העובר בחופשיות דרך קרום הפלזמה של תאים, בו הוא מומר לתוך מוצר ממברנה-impermeant, אש.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
כאן תארנו מבחני פשוטה פלורסצנטיות הפריה חוץ גופית מבוססות על המסך עבור תנאי זה להציל את שכפול VSV בתרבויות תא lepidopteran מגבילים. זיהום שנכשל של VSV בתאים lepidopteran יוצר יחס אות לרעש מעולה כאשר assaying על ביטוי גנים VSV. למשל, האותות LU זוהה lysates מדלקות VSV-לוק יחיד היו ~ 1,000-fold גבוה בהרבה lysates נגועה מעושה, אך אותות אלה שונה רק כ כפולה על קורס זמן 72-h. לעומת זאת, coinfection של VSV-לוק עם VACV משופרת LU אותות ~ נגמר 300-fold יחיד VSV-לוק זיהומים על ידי מדד מחירי הבתים של 72. לפיכך, מבחני הצלה VSV להציג ט.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
ה2 נתמכה על ידי מימון מתוכנית חוקרים מאוניברסיטת טקסס הדרומית-מערבית למרכז הרפואי של מחונן. המחברים תודה מייקל Whitt (המרכז למדעי הבריאות אוניברסיטת טנסי) שון ווילן (הספר לרפואה של הרווארד) למתן VSV-DsRed ו- VSV-לוק. המחברים מודים גם גארי Luker (בית הספר לרפואה באוניברסיטת מישיגן) על מתנה נחמדה של המתח VACV-FL-GFP.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| צלחות תרבית רקמות 6 בארות | CELLTREAT | 229106 | |
| צלחות תרבית רקמות 24 בארות | CELLTREAT | 229124 | |
| 10 ס"מ כלי תרבית רקמות | קורנינג | C430167 | |
| גרייס s Insect Medium | Sigma | G8142 | |
| EX-CELL 420 | Sigma | 14420C | |
| סרום בקר עוברי - Optima | Atlanta Biologicals | S12450 | |
| Growth Medium | תערובת 1:1 של Grace's Insect Medium ו-EX-Cell 420 Serum-Free Medium המכיל גם 1% תמיסה אנטיביוטית-אנטי-פטרייתית ו-10% | ||
| תמיסה אנטיביוטית-אנטי-מיקרוטית של בקר עוברי (100&פעמים;) | סיגמא | A5955 | |
| דולבקו s פוספט חוצץ מלח (DPBS) | Sigma | D8662 | |
| מדיה ללא סרום (SFM) | Thermo Fisher | 10902096 | |
| ציטוזין ארבינוזיד | Sigma | C1768 | |
| מגיב טרנספקציה | תרמו פישר | 10362100 | |
| Corning cellgro DMSO (דימתיל סולפוקסיד) | קורנינג | 25950CQC | |
| מאגר ליזה מדווח 5x | Promega | E3971 | |
| Luciferase Assay Reagent | Promega | E1483 | |
| 96-Well Microplates | Corning | 3915 | |
| עכבר נגד FLAG נוגדן | Wako | 014-22383 | |
| ארנב נגד גחליליות לוציפראז נוגדן | Abcam | ab21176 | |
| נוגדן נגד אקטין עכבר | Sigma | A2066 | |
| עכבר נגד VSV M | N / A | N / A | ד"ר ג'ון קונור (אוניברסיטת בוסטון) |
| עכבר נגד VACV I3L | N / A | N / | A ד"ר דיוויד אוונס (אוניברסיטת אלברטה) |
| צלחת תא 8 בארות | Lab-Tek II | 155409 | |
| צבע כדאיות תאים | Thermo Fisher | C12881 | |
| קורא מיקרופלטות FLUOstar | BMG Labtech | FLUOstar | |
| מיקרוסקופ קונפוקלי | Olympus | FV10i-LIV | |
| תוכנת ניתוח תמונה | Olympus | v1.18 | cellSens software |
| Eppendorf 5702 צנטריפוגה מאווררת | Eppendorf | 22628102 | |
| Odyssey Fc מערכת הדמיה אינפרא אדום | Li-COR Biosciences | Odyssey Fc | |
| LD652 תאים | N/A | N/A ד | "ר בזיל עריף (משאבי טבע) קנדה) |
| תאי BSC-40 | ATCC | CRL-2761 | |
| תאי BHK | ATCC | CCL-10 | |
| תאי HeLa | ATCC | CCL-2 | |
| תאי BSC-1 | ATCC | CCL-26 | |
| in vitro ערכת שעתוק וטיהור | Thermo Fisher | AM1626 | |
| PCR ערכת טיהור | Qiagen | 28104 |
מקורות
- Nomaguchi, M., Fujita, M., Miyazaki, Y., Adachi, A. Viral tropism. Frontiers in Microbiology. 3, 281(2012).
- Werden, S. J., McFadden, G. The role of cell signaling in poxvirus tropism: the case of the M-T5 host range protein of myxoma virus.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
