מאמר שיטה

העכבר (hu-NSG) humanized הנד/SCID/IL2rγnull מודל עבור שכפול HIV ולימודי השהיה

DOI:

10.3791/58255

⸱

7 בינואר 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Biology, Beckman Research Institute of City of Hope, 2Irell and Manela Graduate School of Biological Sciences, Beckman Research Institute of City of Hope

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מספק שיטה ליצירת עכברים humanized (hu-NSG) באמצעות intrahepatic הזרקה של תאי גזע hematopoietic אנושי לתוך ממוזגים קרינה עכברים NSG neonatal. העכבר hu-NSG חשופה הידבקות ב- HIV טיפול תרופתי קומבינטורית (עגלה), משמש כמודל pathophysiological מתאימים לחקירות שכפול וההשהיה HIV.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תקנות אתיות ואתגרים טכניים לחקר פתולוגיה אנושית, אימונולוגיה ופיתוח טיפולית יש להציב מודלים בעלי חיים קטנים ביקוש גבוה. עם קרוב גנטיות והתנהגותיות דימיון של בני אדם, חיות קטנות כמו העכבר הם מועמדים טובים עבור מחלות אנושיות מודלים, שדרכו תסמינים דמויי אנוש ותגובות יכול להיות recapitulated. יתר על כן, ניתן לשנות את הרקע הגנטי של העכבר כדי להתאים לדרישות מגוונות. העכברnull (NSG) הנד/SCID/IL2rγ הוא אחד של זנים העכבר immunocompromised הנפוצה ביותר; זה מאפשר engraftment עם תאי גזע אנושי hematopoietic ו/או ברקמות אנושיות ופיתוח עוקבות של מערכת החיסון האנושית פונקציונלי. . זה יהווה אבן דרך קריטית להבנת הפרוגנוזה של הפתופיזיולוגיה של האדם הספציפי מחלות כמו איידס, סיוע בחיפוש אחר תרופה... במסמך זה, מדווחים פרוטוקול מפורט ליצירת מודל העכבר NSG humanized (hu-NSG) על ידי השתלת תא גזע hematopoietic לתוך עכבר ממוזגים קרינה NSG neonatal. המודל העכבר hu-NSG מציגה פיתוח השושלת רב המושתלים תאי גזע אנושי הרגישות לזיהום נגיפי HIV-1. זה גם recapitulates מאפיינים ביולוגיים מרכזיים בתגובה לטיפול תרופתי קומבינטורית (עגלה).

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כי הקמת בדגמים בעלי חיים מסוימים עבור מחלות אנושיות היא המפתח למציאת תרופה, מודלים בעלי חיים המתאימים זמן היה נרדף, שיפור לאורך זמן. פותחו זנים מרובים של מודלים מאתר immunocompromised, כי היתר את engraftment של רקמות או תאים אנושיים והוצאה לפועל עוקבות של פונקציות humanized1,2. מודל העכבר humanized שכזה הם קריטיים עבור חקירות של מחלות האדם הספציפי3,4,5.

אידס (איידס) הנובע זיהום עם וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV) הוא דוגמה אחת. לפני הקמת העכבר humanized מודלים, אתיים ומגבלות טכניות מוגבלת HIV/איידס פרה מחקרים שנעשו בבעלי חיים קופים3. עם זאת, הוצאות גבוהה ודרישות עבור טיפול מיוחדים עבור חיה כזאת לעכב HIV/איידס בלימודים אקדמיים הגדרות אופייניות. HIV בעיקר מדביק CD4 + T-תאים אנושיים, משפיעה על פיתוח, תגובות מערכת החיסון של תאים חיסוניים אנושיים אחרים כגון תאי-B, מקרופאגים תאים דנדריטים6; לכן, מודלים בעלי חיים קטנים מושתלים עם תפקודי מערכות החיסון האנושית יש ביקוש גבוה.

פריצת דרך הגיע בשנת 1988, כאשר היו עכברים CB17 -scid עם מוטציה Prkdcscid פיתח והראה engraftment מוצלחת של מערכת החיסון האנושית1. התוצאות Prkdcscid מוטציה בפונקציות פגומים T - ו B-cell, מערכת חיסונית אדפטיבית ablated בעכברים, ובעקבותיו את engraftment של האדם ההיקפית תאי תאי (PBMCs), תאי גזע hematopoietic (HSCs), הדם, רקמות העובר hematopoietic7,8. עם זאת, רמות נמוכות של engraftment הם נצפו לעתים קרובות במודל זה; סיבות אפשריות הן 1) שיורית הפעילות החיסונית מולדת מאופנן באמצעות הרוצח הטבעיים (NK)-תאים ופיתוח 2) בשלב מאוחר של העכבר T - ו B-תאים (leakiness)5. התפתחות סוכרת שאינו שמנים (הנד) עוקבות-scid העכבר דגם מושגת דרמטי למטה-ויסות פעילות תאי NK; לפיכך, הוא מסוגל לתמוך לרמה גבוהה יותר engraftment בר-קיימא של רכיבי מערכת החיסון האנושית9. בכדי לדכא או לעכב התפתחות של מולדת חסינות, מודלים העכבר זוקף לחיתוך או מהממת של interleukin-2 קולטן γ-הרשת (Il2rg) (הנד) -scid רקע הוקמו. Il2rg, הידוע גם בשם נפוץ ציטוקין קולטן γ שרשרת, היא מרכיב חיוני של שונים ציטוקין קולטנים10,11,12,13. זנים כמו במנוד ראש. Cg -PrkdcscidIl2rgtm1Wji (NSG) NODShi.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug (ליקר) נוכח שיבוש חזקים העכבר ציטוקין איתות ו אבלציה מלאה של התפתחות תאי NK, ב בנוסף ליקוי חמור של חסינות מסתגלת14,15,16.

שלושה דגמים העכבר humanized הנושאת scid מוטציה, נוקאאוט Il2rg לעתים קרובות המועסקים ב- HIV/איידס המחקר: המודל בייקון (מח עצם הכבד קורנית) את מודל למידה (ליקוציט דם היקפיים), המודל SRC (SCID לאכלס מחדש תא) 3. בייקון מודל נוצר באמצעות ניתוח השתלת כבד עוברי אנושי, התימוס מתחת הקפסולה כליות העכבר בליווי ורידיות העובר בכבד HSCs3,17,18. המודל העכבר BLT מציע יעילות גבוהה engraftment, התפתחות תאים אנושיים hematopoietic בתוך כל שושלות, והקמת מערכת חיסונית חזקה האנושי; בנוסף, תאי-T משכילים ב בלוטת התימוס עצמיים אנושית ולהציג מוגבלת הלע תגובות חיסוניות4,5,17,19. עם זאת, הדרישה ניתוחים נשאר החיסרון העיקרי של המודל BLT. המודל העכבר למידה נוסדה על ידי זריקה תוך ורידי עם תאי הלימפה היקפי אדם. מודל למידה מציע נוחות ותשואות engraftment T-cell מוצלחת, אבל היישום שלו הוא מוגבל בשל תאי B לא מספיק מיאלואידית תא engraftment, רמות נמוכות engraftment הכללית, ואת תחילתה של חמור שתל – מול – מארח מחלות (GVHD)3 ,20. המודל העכבר SRC נקבעת באמצעות הזרקה של האדם HSCs לתוך עכברים SCID היילוד או צעירים למבוגרים. זה מוצגים engraftment הממוצע יעילות מעל 25% (העריכו דם היקפיים CD45 אחוז) ותומך פיתוח מרובת-השושלת HSCs מוזרק, לפתח את מערכת החיסון האנושית מולדת. עם זאת, המגבלה של המודל SRC היא כי התגובה תא T הוא עכבר H2-מוגבל במקום האנושי מוגבלת הלע14,21.

המודל העכבר SRC נחשב למודל נתיישב ואמין פרה HIV/איידס קטן מחקרים שנעשו בבעלי חיים, ומעוררות את engraftment עקבית של מערכת החיסון האנושית ופיתוח hematopoietic מוצלח. אנו קודם לכן דיווח על הקמת מודל העכבר NSG Hu-SRC-SCID (hu-NSG), תיאר את היישום שלה שכפול HIV, השהיה מחקרים22,23,24. מודל זה העכבר hu-NSG תערוכות רמות גבוהות של מח עצם יונת, הרגישות הידבקות ב- HIV, ואת החוק הביוגנטי של הידבקות ב- HIV ו פתוגנזה. בנוסף, דגם hu-NSG העכבר מגיב כראוי לטיפול תרופתי קומבינטורית (עגלה), recapitulates פלזמה ריבאונד ויראלי על העגלה נסיגה, המאשרת הקמת HIV השהיה מאגר25,26 ,27. זה מאגר השהיה HIV עוד תימוכין על ידי הייצור של המוסמכים-שכפול HIV וירוסים לשעבר vivo המושרה על ידי האדם נח CD4 + T תאים מבודדים של עכברים נגועים ו שטופלו העגלה hu-NSG.

במסמך זה, אנו מתארים את פרוטוקול מפורט עבור הקמת המודל העכבר hu-NSG של עכברים NSG neonatal, לרבות ההליכים הקשורים זיהום ב- HIV וטיפול העגלה לפיתוח השהיה. אנו מצפים פרוטוקול זה להציע סט חדש של גישות במחקרים בעלי חיים HIV לגבי HIV וירולוגיה, השהיה, וטיפול.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל טיפול בבעלי חיים והתהליכים בוצעו על פי פרוטוקולים נבדקו ואושרו על ידי עיר של תקווה מוסדיים חיה הטיפול ועל שימוש הוועדה (IACUC) שנערך על-ידי החוקר הראשי של מחקר זה (ד ר ג'ון רוסי, IACUC #12034). רקמת הכבד העובר האנושי הושג ממשאבים מתקדמים Bioscience (Alameda, CA), ארגון ללא מטרות רווח, על פי תקנות פדרליים ועל מצב. הספק משלו מוסדיים סקירה לוח (IRB), הוא תואם לדרישות ההגנה בסובייקט. PBMCs האנושי הם בודדו אותנו מהמתרחש דגימות דם היקפיים שהושלכו מתורמים בריאים אנונימי ממרכז העיר של תקווה דם התורם (דוארטה, CA), עם אין זיהוי לגבי גיל, גזע, מין או מוצא אתני. IRB #/ REF #: 97071/075546

1. כללי עיסוק אספטי

  1. ביצוע ניסויים תרביות רקמה למינאריים המיועדים לכך.
  2. לשמור תרביות רקמה בינוני ותוספי מזון בתנאים סטריליים, סינון באמצעות לכהן יחידת סינון 0.22-מיקרומטר לשימוש.
  3. לשמר את HSCs האדם מוכן צינורות סטרילי ולשמור בקירור עד זריקה.
  4. כתוצאה חיסוני חמור, להתמודד עם עכברים NSG גילוח ורחיצה כירורגית. ללבוש שמלה ניתוח חד פעמיות, כובע שיער, מסכת פנים, ערדליים וכפפות למניעת זיהום. לנקות את השטח ספסל בעל הקרנה, אינדוקציה תא הרדמה עם כלור דיאוקסיד מבוסס sterilant (למשל, Clidox) לפני ואחרי ניסויים.
  5. להחיל משחה מבוססי נפט העין לאחר דימום רטרו-מסלולית למניעת יובש בעיניים.
  6. לשנות ל המכילות אנטיביוטיקה בתזונה כדי למנוע זיהום עקב דימום רטרו-מסלולית.

2. טיפול ב- HIV, נגוע בווירוס מכרסמים, המכיל וירוס דגימות דם/רקמה

זהירות: HIV היא פתוגניות מחלקה 3; הטיפול לציית לכללים בדיוק.

  1. להתמודד עם דגימות המכיל וירוס HIV ב BSL2 המיועד + / מעבדה 3 שטח. נעל המכיל וירוס ריאגנטים בצורה מאובטחת במיכל משני במהלך תחבורה. לחטא את המשטח החיצוני של כל הגורמים המכילים המשמשים על ידי ניגוב יסודי עם 10% מלבין, אלכוהול איזופרופיל לפני תחבורה.
  2. שמור כל פסולת המכילה וירוס המיועדת פסולת מכולות עם 2-3 שכבות של שקיות פסולת ותברואה. לפני לסילוק פסולת, לחטא בהתזה בנדיבות את הפסולת עם יוד/קנולה אתוקסילט nonylphenol פתרון (למשל, Wescodyne) והחיטוי.
  3. ללבוש ציוד מגן אישי: כובע שיער, כיסוי הפנים, מגן התזה נגד פניו, ערדליים, ניתוח חד פעמיות חלוק וכפפות שכבה כפולה.
  4. להתמודד עם מכרסמים נגועים בזהירות מירבית. התנהלות זריקות ואוספים דם תוך עכברים. הם תחת הרדמה (שלבים 5.1-5.2, 6.3-6.5, 7.3, ו- 8.1-8.2).

3. בידוד תאי גזע Hematopoietic

  1. להכין collagenase/dispase פתרון לעיכול רקמות.
    1. לפזר אבקת collagenase/dispase כדי פתרון מניות-ריכוז של 100 מ"ג/מ"ל, ואחסן פתרון מניות collagenase/dispase aliquots µL 150 ב-20 ° C.
    2. לעבודה collagenase פתרון, לדלל 150 µL collagenase/dispase מניות עם 15 מ"ל של RPMI 1640 בתוספת 10% FCS ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין.
      הערה: הריכוז הסופי של collagenase/dispase לעיכול רקמות היא 1 מ"ג/מ"ל.
  2. עם סכין גילוח סטרילי, לחתוך הכבד רקמה עוברית (16-24 שבועות הריון) לחתיכות קטנות (כ 2-3 מ מ3 בגודל) ואחריו העיכול עם פתרון collagenase/dispase (1 מ"ג/מ"ל) במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לכוון את עוצמת הקול של פתרון מערכת העיכול כך כל החלקים רקמות באופן מלא טובע. להשתמש בקצה האחורי של מזרק הבוכנה בעדינות לטחון את דגימת רקמה כדי להקל על עיכול.
  3. עוברים את התערובת עיכול מסנן רשת ניילון סטרילי 70-מיקרומטר לרכוש השעיה תא בודד.
  4. להעשיר עבור CD34 + HSCs באמצעות מערכת מקינטוש לפי הוראות היצרן.
  5. לספור את אחוז קיימא מועשר CD34 + HSCs באמצעות hemacytometer של28 והמשך intrahepatic הזרקה לתוך עכברים NSG neonatal.
  6. להקפיא שנותרו מועשר CD34 + HSCs קפואים מדיה (למשל, CryoStor CS2) ולשמר תאים במיכל חנקן נוזלי. בעת שימוש בעתיד, לספור מחדש את אחוז המופשרים CD34 + HSCs לפני הזרקת קיימא. עם השימוש של הקפאת מדיה, לאחר ההפשרה הכדאיות הוא בין 80 ל-90%.

4. intrahepatic הזרקה של האדם CD34 + HSCs בעכברים Neonatal NSG

הערה: עכברים Neonatal NSG 2-3 ימים מהלידה הם המתאימים ביותר עבור הליך זה, כפי שהם חזקים מספיק כדי לשאת את הקרנה במינון קטלני חצי, בזמן מספיק צעיר כדי לגמרי לקויי מערכות החיסון. בלי הרדמה נדרש הזריקה HSC.

  1. מקום השגר כולו של עכברים NSG neonatal (בדרך כלל 5-10 עכברים, שני המינים) בתוך כלוב הקרנה בצורת עוגה סטרילי, לחשוף מנה סך של 200-250 cGy גמא קרינה ממקור קרינה צסיום-137. ודא שאת מינון הקרינה נמצא בטווח, כמו ירידה משמעותית במשקל או אפילו מוות יכול להיות שנצפו מתי NSG עכברים נחשפים מינונים גבוהים של הקרנה. 12
    הערה: קרינה היא סיכון בריאותי, הגנה אישית מפני קרינה יש לנקוט.
  2. בעקבות הקרנה, להזריק כל עכבר NSG neonatal 5 x 105 קיימא האנושי CD34 + HSCs באמצעות מלכודת מזרק/מחט (איור 1). ישירות מזריקים תאים לתוך הכבד.

5. engraftment אימות דרך רטרו-מסלולית דימום וניתוח Cytometry זרימה

  1. ב 10-12 שבועות זריקה פוסט-מועדון הכדורגל מונפלייה, עזים ומתנגד עכברים באמצעות מכשיר אינהלציה איזופלוריין/חמצן. להתאים את זרימת החמצן כדי לשמור על אחוז איזופלוריין ב 4-5%. הרדמה לוקח 3-5 דקות, בהתאם לעכבר הבודד. עכברים כראוי ומורדמת להראות איטי דפוס נשימה עמוקה, ואני מגיבה לגירוי צובט את הבוהן.
  2. לאסוף 50-100 µL מדם היקפי בכל עכבר באמצעות דגימה רטרו-מסלולית28. לאחסן דגימות דם K2EDTA או צינורות איסוף דם heparinized כדי למנוע קרישה.
    הערה: צינורות איסוף דם נדרשים יש ציפוי נוגד קרישה, כך PBMCs העכבר ניתן לבודד כל הדם לניתוח cytometry זרימה. EDTA זה ידוע לעכב תגובות אנזימטיות כגון PCR ו- PCR לרביעיית; לפיכך, אם הזרם אנזימטיות נדרשים, השתמש מנגנון איסוף דם heparinized.
  3. צנטריפוגה דגימות דם ב 2,000 x g במשך 20 דקות ב- 4 ° C עד הצניפה כדוריות הדם.
    1. להעביר את supernatants פלזמה חדשה צינורות microcentrifuge לאחר צנטריפוגה וחנות ב-80 מעלות צלזיוס אם ניתוח ציטוקין נדרשת.
    2. Lyse כדוריות דם אדומות (RBCs) בתוך גלולה תאי הדם בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות באמצעות מאגר פירוק תאי הדם האדומים (טבלה של חומרים).
      הערה: אם דגימות פלסמה אינם נדרשים, ישירות lyse הדם שלם עם פירוק פתרון ללא צנטריפוגה.
  4. גלולה כדוריות הדם שנותרו לאחר פירוק RBC ב g 300 x למשך 5 דקות ב 4 ° C; וארוקן את תגובת שיקוע. לשטוף את כדורי תא עם BSA 0.01% המכיל DPBS, צנטריפוגה ב 300 x g למשך 5 דקות ב 4 ° C, תשאף תגובת שיקוע. חזור על השלב כביסה עוד פעם אחת.
  5. לחסום תאים עם µL 100 1 x חסימת קוקטייל (טבלה 3 למתכון) במשך 20 דקות ב- 4 מעלות צלזיוס.
  6. לאחר חסימת, ישירות הוספת כל פתרון נוגדן התליה תא-ריכוז של 2 µL/106 תאים, דגירה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. נוגדנים עבור אימות engraftment הם: האנטי-האדם CD45 (לויקוציטים, RRID: AB_2732068), אדם אנטי CD3 (תאי-T, RRID: AB_396896), נגד CD4 (helper T-תאים, RRID: AB_397037), נגד CD8 (תאי-T ציטוטוקסיות, RRID: AB_2722501), נגד CD14 (monocytes, RRID: AB_10373536), ובני אנטי-אדם CD19 (תאי-B, RRID: AB_10373382). לקבלת לוח זרימה המוצע, עיין בטבלה 4 ו לטבלה של חומרים עבור הקטלוג, RRIDs ומספרי הרבה.
    הערה: נוגדן מכתים בחסימה הפתרון מבטלת שאינם ספציפיים קשירה של נוגדנים נגד לכיוון סמני משטח העכבר, כסמני משטח מספר לשתף הומולוגיה בין אדם ועכבר.
  7. לבודד את PBMCs האנושית מתורמים בריאים להכין תזרים שהוכתמו יחיד cytometry פיצוי פקדי משתמש PBMCs האנושי מטוהרים. לחילופין, להשתמש microspheres התווית על-ידי קרינה פלואורסצנטית פיצוי שולטת.29.
  8. לנתח את דגימות הדם ההיקפיים באמצעות cytometer של זרימה ולכמת את האחוז של תאים CD45 + אנושיים, תאי CD3 + אדם, התאים CD14 + האדם האנושי CD19 + תאים מתאי הדם ההיקפיים הכולל.
    1. הידבקות ב- HIV במורד הזרם, מחקרים השהיה, לחשב את אחוז CD4 + T-תאים ותאי CD8 + T-בתוך תאי CD3 +.
      הערה: בדרך כלל, יחס CD4:CD8 בין 1.5 ל- 2.5 הוא ציין לפני זיהום ב- HIV30.

6. ניתוח של הידבקות ב- HIV של עכברים hu-NSG ו פלזמה הנגיפי באמצעות לרביעיית-PCR

  1. להפיץ את המניות נגיפי HIV BaL PBMCs האנושי מתורמים מאוד בריאים, הקציר ב זיהום שלאחר יום 10 ו- titrate באמצעות p24 אליסה קיט31.
  2. בחר hu-NSG עכברים עם יותר מ 20% CD45 האנושי + תאים בדם היקפי הידבקות ב- HIV.
  3. עזים ומתנגד hu-NSG עכברים באמצעות מכשיר אינהלציה איזופלוריין/חמצן (שלב 5.1).
  4. לאחר שנוכח חיה. הוא מורדם, להחדיר וירוס HIV BaL במינון של 200 ng של p24 לכל העכבר דרך בקרום הבטן.
    הערה: להיות זהיר מאוד עם המחט, לא לעשות שימוש חוזר במחטים, ולבטל מיד לאחר השימוש לתוך מיכל חדה המיועד. לחטא את האזור של הזרקה לאחר וירוס.
  5. שלושה שבועות לאחר הפגיעה, עזים ומתנגד hu-NSG עכברים ולאסוף דם היקפיים באמצעות רטרו-מסלולית הדימום באמצעות heparinized צינורות קפילר וצינורות האוסף.
  6. פלזמה נפרדים, כדוריות הדם על ידי צנטריפוגה ב 2,000 x g במשך 20 דקות.
  7. Lyse RBCs. בלוק, כתם כדוריות הדם שנותרו עם נוגדנים לניתוח cytometry זרימה (סעיף 5.3-5.8).
    הערה: ניתוח cytometry זרימה להתמקד על השוואת יחס CD4:CD8 לפני ואחרי זיהום. צפויה ירידה משמעותית בספירת תאי CD4 +, בשם CD4 אנטיגן משמש קולטן שיתוף עבור ערך ויראלי.
  8. שימוש דגימות פלסמה כדי לנתח את נגיפי האיידס לטעון באמצעות לרביעיית-PCR. לבודד RNA נגיפי מדגימות פלזמה באמצעות ערכת מיני נגיפי RNA. לבצע לרביעיית-PCR עם HIV-1 LTR ספציפיים תחל ומגדיר בדיקה (רצף פרטים ב טבלה 5), באמצעות הפרוטוקול של היצרן.

7. אוראלי מינהל העגלה ואת האימות של נגיפי דיכוי (אופציונלי)

הערה: שלב זה הוא אופציונלי עבור חקירות מצ ח בנוגע HIV פרוגנוזה, וירולוגיה או פתופסיולוגיה הקשורות זיהום במהלך שלב דלקת חריפה. עגלת טיפול נגוע ב- HIV hu-NSG משמש כדי לסכם HIV השהיה בין בני אדם חולים שקיבלו את העגלה. עכברים נגועים ב- HIV בהצלחה hu-NSG ניתנת העגלה למשך 4 שבועות. העגלה משטר מורכב tenofovir fumarate disoproxil (TDF; 300 mg/קפסולה), emtricitabine (ה-FTC; 200 mg/קפסולה), raltegravir (RAL; 400 מ ג/קפסולה). המינון של העגלה לטיפול עכברים נגועים ב- HIV hu-NSG מותאמת על פי הגוף שטח (טבלה 1, משוואה 1, בטבלה 2)32.

  1. לחשב את הכמות של כל התרופות הדרושות עבור כל הכלוב במהלך שבוע אחד של טיפול, אם לוקחים בחשבון את עוצמת הקול של הבקבוק מים, את מספר עכברים בכלוב כל, ואת צריכת מים יומית ממוצעת של 4 מ"ל לכל העכבר.
    הערה: נקודת המפתח בשלב זה נועד להבטיח כל עכבר רוכשת את המנה היומית שלה בתוך 4 מיליליטר מים לשתייה.
  2. לטחון כל שלוש תרופות במינונים מנוכי עונתיות לאבקה בסדר, לפזר את תערובת אבקת במים ממותקים (למשל, Medidrop Suralose). לשנות את הבקבוק מים כל שבוע עם קוקטייל בעגלה מומס טרי סיפק מים ממותקים.
    הערה: האבקה סמים אולי לא לפזר מיד, ללחוץ נמרצות כדי להשיג השעיה הומוגנית לפני שחזר את הבקבוק על הכלוב אחזקות.
  3. לאסוף דגימות דם היקפיים באמצעות רטרו-מסלולית דם כל שבועיים ולנתח הן היחס CD4:CD8 באמצעות cytometry זרימה (סעיף 5.3-5.8) את המטען הנגיפי פלזמה באמצעות לרביעיית-PCR (בסעיף 6.6).
    הערה: בדרך כלל לאחר 4 שבועות של טיפול, המטען הנגיפי של פלזמה יורד אל מתחת למגבלת זיהוי, יחס טיפוסי CD4:CD8 משוחזר.

8. אימות של נגיפי ריבאונד על העגלה משיכה (אופציונלי)

הערה: השלב זה קריטי אימות המודל השהיה, כמו נגיפי ריבאונד על העגלה משיכה מספק עדות ישירה של מאגר השהיה. מומלץ גם לשמש ניסוי שליטה לחקירות טיפולית על HIV ריבאונד המדכאים.

  1. תוכנית לנסיגה העגלה לאחר פלזמה עומסים ויראלי של דגימות דם היקפיים הם מתחת לגבול זיהוי והוא היחס CD4:CD8 משוחזר מגוון בין 1.5 ל- 2.5.
  2. לאסוף דגימות דם היקפיים באמצעות רטרו-מסלולית דימום כל 2 שבועות לאחר נסיגת העגלה. לעקוב מקרוב אחר השינוי פלזמה ויראלי טוען (סעיף 6.6) כמו גם היחס CD4:CD8 (סעיף 5.3-5.8).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתוח cytometry זרימה מתבצע בתדירות גבוהה כדי לאמת את טוהר HSCs מבודדים, להעריך את רמות engraftment, פרופיל החיסונית התגובות זיהום ויראלי, סקר העגלה היעילות. פאנל נוגדן טיפוסי מכיל נוגדנים fluorescently שכותרתו בודדים 4-6; לפיכך cytometer זרימה עם לייזרים מרובים ומבחר רחב של מסננים חיוני להשגת תוצאות מדויקות.

עבור אימות engraftment הראשונית, האדם CD45 + ספירת יכול לנוע בין 20% עד 80%, קבוצות משנה של לויקוציטים אנושיים אמור להופי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עכברים immunocompromised engrafted עם תאים/רקמה אנושית להציג מאפיינים פיזיולוגיים דמוי אדם, ערך עצום ללימודי פתולוגיה, פתופיזיולוגיה ו אימונולוגיה לגבי אדם ספציפי במחלות. בין הזנים מרובים של עכברים immunocompromised, הסימן. Cg -PrkdcscidIl2rgtm1Wji (NSG) הדגם הוא immunodeficient ביותר בשל חוסר חסינות מולדת והן אדפטיבית, כמו גם ציטוקין העכבר ספציפיים ablated איתות3,12,19 . לכן, עכברים NSG כבר מנוצל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים לחשוף שאין ניגודי אינטרסים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מכוני הבריאות הלאומיים [להעניק מספרים R01AI29329, R01AI42552, R01HL07470 J.J.R.] מכון הסרטן הלאומי של מכוני הבריאות הלאומיים [מספר גרנט P30CA033572 כדי לתמוך עיר של תקווה אינטגרטיבית גנומיקה פרמקולוגיה אנליטית, ליבות Cytometry אנליטית]. הכימית הבאה הושג באמצעות הפניה ריאגנט התוכנית, חלוקה של איידס, NIAID, ומחקר של איידס NIH NIH: HIV BaL וירוס.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ערכת MicroBead CD34,MiltenyiBiotec130-046-703
CryoStor CS2Stemcell Technologies07932
NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wji מעבדת ג'קסון005557 הזמינו מגדלים במקום עכברי ניסוי
IsoFloPatterson Veterinary07-806-3204הזמינו דרך מתקן בעלי חיים, פריט מוגבל
חומר חיטוי ClidoxFisher SicentificNC9189926
WescodyneFisher Sicentific19-818-419
המילטון 80508 מזרק/מחטהמילטון80508בהתאמה אישית
(K2EDTA)BD Bioscience367843
צינור איסוף דם (Heparin)BD Bioscience365965
צינור נימי (Heparinized)Fisher Sicentific22-362574
מאגר ליזה של תאי דם אדומיםסיגמא Aldrich11814389001
QIAamp ערכת מיני RNA ויראליQiagen52906
TaqMan Fast VIrus 1-step Master MixThermofisher4444434
HIV-1 P24 ELISA (ערכת 5 צלחות)PerkinElmerNEK050B001KT
IgG מסרום אנושיSigma AldrichI4506-100MG
IgG מסרום עכברSigma AldrichI5381-10MG
BB515 עכבר אנטי אנושי CD45 (שיבוט HI30)BD Biosciences564586RRID: AB_2732068, LOT 6347696
PE-CY7 עכבר אנטי אנושי CD3 (Clone SK7)BD Biosciences557851RRID: AB_396896, LOT 6021877
Pacific Blue Mouse Anti-Human CD4 (Clone RPA-T4)BD Biosciences558116RRID: AB_397037, LOT 6224744
BUV395 עכבר אנטי אנושי CD8 (שיבוט RPA-T8)BD Biosciences563795RRID: AB_2722501, LOT 6210668
APC-Alexa Fluor 750 עכבר אנטי אנושי CD14 (TuK4)ThermoFisherMHCD1427RRID: AB_10373536, LOT 1684947A
PE עכבר אנטי אנושי CD19 (SJ25-C1)ThermoFisherMHCD1904RRID: AB_10373382, LOT 1725304B
אנושי צינור איסוף דם

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Greiner, D. L., Hesselton, R. A., Shultz, L. D. SCID mouse models of human stem cell engraftment. Stem cells. 16 (3), 166-177 (1998).
  2. Rongvaux, A., et al. Development and function of human innate immune cells in a humanized mouse model. Nature. 32 (4), 364-372 (2014).
  3. Walsh, N. C., et al. Humanized Mouse Models of Clinical Disease. Annual review of pathology. 12, 187-215 (2017).
  4. Shultz, L. D., Brehm, M. A., Garcia-Martinez, J. V., Greiner, D. L. Humanized mice for immune system investigation: progress, promise and challenges. Nature reviews. Immunology. 12 (11), 786-798 (2012).
  5. Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nature reviews. Immunology. 7, (2007).
  6. Moir, S., Fauci, A. S. B cells in HIV infection and disease. Nature reviews. Immunology. 9 (4), 235-245 (2009).
  7. McCune, J. M., et al. The SCID-hu mouse: murine model for the analysis of human hematolymphoid differentiation and function. Science. 241 (4873), 1632-1639 (1988).
  8. Mosier, D. E., Gulizia, R. J., Baird, S. M., Wilson, D. B. Transfer of a functional human immune system to mice with severe combined immunodeficiency. Nature. 335, 256(1988).
  9. Shultz, L. D., et al. Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice. Journal of immunology. 154 (1), 180-191 (1995).
  10. Ohbo, K., et al. Modulation of hematopoiesis in mice with a truncated mutant of the interleukin-2 receptor gamma chain. Blood. 87 (3), 956-967 (1996).
  11. Ito, M., et al. NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
  12. Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. Journal of immunology. 174 (10), 6477-6489 (2005).
  13. Ishikawa, F., et al. Development of functional human blood and immune systems in NOD/SCID/IL2 receptor {gamma} chain(null) mice. Blood. 106 (5), 1565-1573 (2005).
  14. Watanabe, Y., et al. The analysis of the functions of human B and T cells in humanized NOD/shi-scid/gammac(null) (NOG) mice (hu-HSC NOG mice). International immunology. 21 (7), 843-858 (2009).
  15. McDermott, S. P., Eppert, K., Lechman, E. R., Doedens, M., Dick, J. E. Comparison of human cord blood engraftment between immunocompromised mouse strains. Blood. 116 (2), 193-200 (2010).
  16. Mazurier, F., Doedens, M., Gan, O. I., Dick, J. E. Rapid myeloerythroid repopulation after intrafemoral transplantation of NOD-SCID mice reveals a new class of human stem cells. Nature. 9 (7), 959-963 (2003).
  17. Melkus, M. W., et al. Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1. Nature medicine. 12, 1316(2006).
  18. Lan, P., Tonomura, N., Shimizu, A., Wang, S., Yang, Y. -G. Reconstitution of a functional human immune system in immunodeficient mice through combined human fetal thymus/liver and CD34+ cell transplantation. Blood. 108 (2), 487-492 (2006).
  19. Brehm, M. A., Bortell, R., Verma, M., Shultz, L. D., Greiner, D. L. Humanized Mice in Translational Immunology. Translational Immunology. , 285-326 (2016).
  20. King, M. A., et al. Hu-PBL-NOD-scid IL2rgnull mouse model of xenogeneic graft-versus-host-like disease and the role of host MHC. Clinical & Experimental Immunology. 157, 104-118 (2009).
  21. Halkias, J., et al. Conserved and divergent aspects of human T-cell development and migration in humanized mice. Immunology and cell biology. 93 (8), 716-726 (2015).
  22. Satheesan, S., et al. HIV replication and latency in a humanized NSG mouse model during suppressive oral combinational ART. Journal of virology. , (2018).
  23. Zhou, J., et al. Receptor-targeted aptamer-siRNA conjugate-directed transcriptional regulation of HIV-1. Theranostics. 8 (6), 1575-1590 (2018).
  24. Zhou, J., et al. Cell-specific RNA aptamer against human CCR5 specifically targets HIV-1 susceptible cells and inhibits HIV-1 infectivity. Chemistry & biology. 22 (3), 379-390 (2015).
  25. Brechtl, J. R., Breitbart, W., Galietta, M., Krivo, S., Rosenfeld, B. The use of highly active antiretroviral therapy (HAART) in patients with advanced HIV infection: impact on medical, palliative care, and quality of life outcomes. Journal of pain and symptom management. 21 (1), 41-51 (2001).
  26. Richman, D. D., Margolis, D. M., Delaney, M., Greene, W. C., Hazuda, D., Pomerantz, R. J. The Challenge of Finding a Cure for HIV Infection. Science. 323 (5919), 1304-1307 (2009).
  27. Pace, M. J., Agosto, L., Graf, E. H., O'Doherty, U. HIV reservoirs and latency models. Virology. 411 (2), 344-354 (2011).
  28. Van Herck, H., et al. Blood sampling from the retro-orbital plexus, the saphenous vein and the tail vein in rats: comparative effects on selected behavioural and blood variables. Laboratory animals. 35 (2), 131-139 (2001).
  29. Autissier, P., Soulas, C., Burdo, T. H., Williams, K. C. Evaluation of a 12-color flow cytometry panel to study lymphocyte, monocyte, and dendritic cell subsets in humans. Cytometry. 77 (5), 410-419 (2010).
  30. Lu, W., Mehraj, V., Vyboh, K., Cao, W., Li, T., Routy, J. -P. CD4:CD8 ratio as a frontier marker for clinical outcome, immune dysfunction and viral reservoir size in virologically suppressed HIV-positive patients. Journal of the International AIDS Society. 18, 20052(2015).
  31. van't Wout, A. B., Schuitemaker, H., Kootstra, N. A. Isolation and propagation of HIV-1 on peripheral blood mononuclear cells. Nature protocols. 3, 363(2008).
  32. Reagan-Shaw, S., Nihal, M., Ahmad, N. Dose translation from animal to human studies revisited. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 22 (3), 659-661 (2008).
  33. Han, Y., Wind-Rotolo, M., Yang, H. -C., Siliciano, J. D., Siliciano, R. F. Experimental approaches to the study of HIV-1 latency. Nature reviews. Microbiology. 5 (2), 95-106 (2007).
  34. Marsden, M. D., et al. HIV Latency in the Humanized BLT Mouse. Journal of virology. 86 (1), 339-347 (2012).
  35. Karpel, M. E., Boutwell, C. L., Allen, T. M. BLT humanized mice as a small animal model of HIV infection. Current opinion in virology. 13, 75-80 (2015).
  36. Durand, C. M., Blankson, J. N., Siliciano, R. F. Developing strategies for HIV-1 eradication. Trends in immunology. 33 (11), 554-562 (2012).
  37. Van Lint, C., Bouchat, S., Marcello, A. HIV-1 transcription and latency: an update. Retrovirology. 10, 67(2013).
  38. Xu, L., Zhang, Y., Luo, G., Li, Y. The roles of stem cell memory T cells in hematological malignancies. Journal of hematology & oncology. 8, 113(2015).
  39. Chun, T. -W., Moir, S., Fauci, A. S. HIV reservoirs as obstacles and opportunities for an HIV cure. Nature immunology. 16 (6), 584-589 (2015).
  40. Redel, L., et al. HIV-1 regulation of latency in the monocyte-macrophage lineage and in CD4+ T lymphocytes. Journal of leukocyte biology. 87 (4), 575-588 (2010).
  41. Laird, G. M., et al. Rapid Quantification of the Latent Reservoir for HIV-1 Using a Viral Outgrowth Assay. PLoS pathogens. 9 (5), e1003398(2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

NSGRT PCRcARTHSC CD34

מאמרים קשורים