פרוטוקול זה מציג שיטה להעריך את פעילות הפרוטאוליטי פרוטאז תחלופה נמוכה-פעילות מהותית, יחיד בהקשר הסלולר. באופן ספציפי, שיטה זו מוחלת כדי להעריך את הפעילות הפרוטאוליטי של PCSK9, נהג מפתח של מטבולי הפעילות הפרוטאוליטי נדרש עבור תפקידה hypercholesterolemic האולטימטיבי.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
Assay לוציפראז תפוקה גבוהה כדי להעריך את Proteolysis של PCSK9 יחיד-מחזור פרוטאז
במאמר זה
סיכום
תקציר
סוג סבטיליזין/kexin proprotein convertase 9 (PCSK9) הוא פרוטאז יחיד-מחזור אשר מווסת את רמות ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (LDL) בסרום, וכתוצאה מכך מחלות לב וכלי דם. למרות PCSK9 proteolysis נדרשת עבור השפעתו hypercholesterolemic מלאה, הערכת פונקציית הפרוטאוליטי שלה הוא מאתגר: PCSK9 ידועה רק קליב עצמו עובר רק מחזור אחד, לאחר proteolysis, משמרת את המצע שלה ב אתר פעיל שלה כמו מעכב באופן אוטומטי. השיטות המובאות כאן לתאר וזמינותו אשר מתגבר על האתגרים הללו. הבדיקה מתמקדת proteolysis הבין-מולקולרי ההקשר מבוססת תא, המחשוף מוצלחות קישורים לפעילות לוציפראז המופרש, אשר ניתן בקלות לקרוא המדיום ממוזגים. דרך שלבים רציפים של מוטגנזה מכוונת, תרביות תאים ארעית של הבדיקה לוציפראז, וזמינותו יכול לחקור PCSK9 proteolysis בתנאים של ההפרעות גנטיות או מולקולרית באופן תפוקה גבוהה. מערכת זו היא מתאימה עבור הערכת בשני הביוכימי missense קלינית שהתגלו נוקלאוטיד יחיד פולימורפיזמים (SNPs), כמו גם באשר ההקרנה של מעכבי מולקולה קטנה של PCSK9 proteolysis.
מבוא
PCSK9 מטרות קולטן LDL (LDL-R) עבור השפלה, העלאת הכולסטרול LDL (LDL-C) ונהיגה טרשת עורקים מחלות לב1,2. PCSK9 מיקוד הרפוי robustly להוריד את LDL-C, לשפר את התוצאות לב וכלי דם לחולים, אפילו בעת הוספת טיפול אגרסיבי להורדת שומנים בדם עם סטטינים3,4. אולם, כיום שאושרו טיפולים מוגבלות לנוגדן מבוססי גישות, סובלים מחוסר משתלמת5,6. כדי לפתור בעיה זו, פחות יקר חלופות טיפוליות, אמצעי לזיהוי חולים עשויה להרוויח יתרונות גדולים יותר, או שניהם, נדרשים.
גישות מולקולה קטנה יכולה מטרה ת....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. מוטגנזה של וקטור פרוטאז
- עיצוב וסדר מסונתז מותאמת אישית oligonucleotides להתקין מוטציה של הריבית באמצעות שינוי של פרוטוקולים סטנדרטיים מוטגנזה12. תחל desalted רגיל (ללא טיהור נוסף) מקובלים לחלוטין.
הערה: הגישה הכללית של פריימר עיצובים כרוך ביצירת תחל חופפים חלקית, כמצוין בטבלה 1, באמצעות מחשבון טמפרטורה (Tm) ההיתוך ספיציפית פולימראז עניין. - להגדיר תגובות שרשרת של פולימראז (מותני) מוטגנזה בקרח, כמצוין בטבלה מס ' 2.
- מחזור את מותני כמצוין בטבלה3.
- לרוץ 2-5 µL של כל ה-PCR על 1% agarose ג'ל והמחש את המוצרים כדי לאשר הגברה מוצלחת.
הערה: PCR מוצ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
וזמינותו תפוקה גבוהה proteolysis נשענת על התגברות על שלושה אתגרים מרכזיים. ראשית, כדי להתגבר על הפלט נמוך מהותית של יחיד-מחזור PCSK9 פרוטאז, פרוטאז PCSK9 חסר מעכבות את prodomain משמשת, עם הרצף המחשוף בזנב prodomain קשורה לוציפראז יכולים להיות מופרשים14. שנית, כדי לספק את הצורך פרוטאז לקפל מורכבים עם מעכבות את prodomain, שני polypeptides הם coexpressed טרנס בתוך ההקשר הסלולר15,16, באמצעות ו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
ניסיוני בהליכים המתוארים לעיל להציג שיטה להתגבר על הפעילות נמוך מהותית הפרוטאז יחיד-מחזור PCSK9 ולהעריך את פונקציית הפרוטאוליטי בצורה איתנה. המושג מפתח וזמינותו נשענת על המרת אירוע יחיד-מחזור readout enzymatically מוגבר. נקודות החוזק של וזמינותו כוללים את מסגרת זמן קצר יחסית קלות השימוש של הכתב לוציפראז, כמו גם את המדרגיות גישות תפוקה גבוהה. בנוסף, וזמינותו מוערך proteolysis בהקשרה טבעית, הסלולר. יתר על כן, עם זה assay, SNPs קלינית מזוהה נבחנים והשפעותיהם על PCSK9 proteolysis ללא הצורך בכל רקמה אנושית או החולה; רק הידע ג.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
המחברים את התמיכה מימון נדיב מן NHLBI/NIH (K08 HL124068 ו- HMOT1243 אימייל), NCATS/NIH דרך UCSF קלינית Translational המדע מכון זרז לתוכנית (UL1 TR000004), הסנאט אקדמי UCSF, קרן הלמן, תודה גלעד מדעי מחקר מלומד פרס, פרס לב וכלי דם מתאווים פייזר (הכל אל חריפה ס ג'ון), הווארד יוז המכון הרפואי (ועד גיא טל מ Galvan וקוואן לשווקת מ').
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| צינורות PCR | ארה"ב מדעי | 1402-2900 | עבור PCR |
| Q5 התחלה חמה | ניו אינגלנד Biolabs | M0493L | תערובת תמיסת DNA פולימראז דאוקסינוקלאוטיד בנאמנות גבוהה |
| ניו | אינגלנד Biolabs | N0447L | dNTPs (עבור PCR) |
| pPCSK9-NLucProteaseAssay-WT | מחברים | n/a | זמין אצל המחברים |
| pPCSK9-NLucProteaseAssay-S386A | מחברים | n/a | זמין אצל המחברים |
| Agarose LE | Gold Biotechnology | A-201-100 | עבור ג'ל DNA |
| מערכת הדמיית E-Gel עם בסיס אור כחול | ThermoFisher Scientific | 4466612 | להדמיית ג'ל |
| DNA SYBR כתם ג'ל DNA בטוח | ThermoFisher Scientific | S33102 | עבור ג'ל DNA |
| Tris Base | ThermoFisher Scientific | BP152-1 | עבור DNA ג'ל ריצה מאגר |
| חומצה אצטית קרחונית | ThermoFisher Scientific | A38-500 | עבור DNA ג'ל ריצה מאגר |
| Ethylenediaminetetraacetic תמיסת חומצה | Millipore Sigma | 3690 | EDTA, עבור DNA ג'ל ריצה מאגר |
| 1 kb סולם DNA | זהב ביוטכנולוגיה | D010 | סולם DNA |
| DpnI | ניו אינגלנד Biolabs | R0176S | אנזים הגבלה |
| צלחות LB Agar עם 100 ומיקרו; g/mL קרבניצילין | Teknova | L1010 | LB-Carb |
| צלחות One Shot Mach1 T עמיד בפני פאג'ים מוכשר כימית E. coli | ThermoFisher Scientific | C862003 | תאים מוכשרים כימית |
| מרק LB, Miller | ThermoFisher Scientific | BP1426-2 | LB |
| קרבניצילין | זהב ביוטכנולוגיה | C-103-5 | אנטיביוטיקה |
| E.Z.N.A. ערכת מיני פלסמיד I | אומגה ביוטק | D6942-02 | ערכת מיני-הכנה לטיהור DNA |
| NanoDrop 2000 ספקטרופוטומר | ThermoFisher Scientific | ND-2000C | ספקטרופוטומטר |
| 293T תאי | תרביות רקמות אמריקאיות (ATCC) | CRL-3216 | HEK 293T תאי |
| DMEM, גלוקוז גבוה, פירובט | ThermoFisher Scientific | 11995065 | DMEM, תא יונקים מדיה |
| עובר בקר Sera | Axenia Biologix | F001 | FBS |
| Trypsin-EDTA (0.05%), פנול אדום | ThermoFisher Scientific | 25300062 | טריפסין, לדיסוציאציה של תאים |
| פוספט חוצץ מלח (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | PBS |
| Countess מונה תאים אוטומטי | ThermoFisher Scientific | C10227 | ספירת תאים אוטומטית |
| שקופיות תא ספירת תאים של רוזנת | ThermoFisher Scientific | C10228 | שקופיות לספירת תאים |
| צלחות תרבית רקמות CELLSTAR, לבן, לבן-תחתון, עם מכסה | Grenier Bio-One | 655083 | לבן, לבן תחתון 96 צלחת |
| באר TempPlate ללא חצאית 96 בארות PCR, טבעי | USA Scientific | 1402-9596 | 96 צלחת באר לצלחת פלסמיד מאסטר |
| Nunc 2.0 מ"ל DeepWell צלחות | ThermoFisher Scientific | 278743 | 96 באר עמוקה צלחת |
| ליפופקטמין 3000 | ThermoFisher Scientific | L3000008 | מגיב טרנספקציה ליפיד, Lf3K |
| P3000 מגיב | ThermoFisher Scientific | L3000008 | מגיב קדם קומפלקסציה DNA, מסופק עם Lf3K |
| OptiMEM I סרום מופחת בינוני | ThermoFisher Scientific | 31985062 | מדיום סרום מופחת עבור טרנספקציה |
| (+)-נתרן L-אסקורבט | Millipore Sigma | A4034 | נתרן אסקורבט |
| נתרן כלורי | Millipore Sigma | S9888 | NaCl |
| אלבומין, סרום בקר, שבר V, מתכות כבדות נמוכות | Millipore Sigma | 12659 | BSA |
| מתנול (HPLC) | ThermoFisher Scientific | A4524 | MeOH |
| חומצה הידרוכלורית | VWR | JT9535-2 | מרוכז HCl |
| Coelenterazine | Gold Biotechnology | CZ2.5 | מסנן מזרק מצע לוציפראז |
| , מסנן | ThermoFisher Scientific | 09-720-3 | סטרילי, PVDF, 0.22 ומיקרו; m נקבוביות |
| Pipet-Lite רב פיפטה L12-200XLS + | Rainin | 17013810 | רב ערוצי |
| פיפטה Pipet-Lite רב פיפטה L12-20XLS + | Rainin | 17013808 | פיפטה רב ערוצית |
| Pipet-Lite רב פיפטה L12-10XLS + | Rainin | 17013807 | רב ערוצי |
| פיפטה ריאגנט מאגר | קורנינג | 4870 | שוקת לריאגנטים |
| צינורות צנטריפוגה, 15 מ"ל | ThermoFisher Scientific | 05-539-12 | צינורות 15 מ"ל |
| צינורות צנטריפוגה, 50 מ"ל | צינורות קורנינג | 430829 50 מ"ל | |
| קורא מיקרופלטות ניצוץ קורא צלחות | Tecan | N/a | Excel |
| Microsoft | 2016 עבור Mac | תוכנת גיליון אלקטרוני | |
| פריזמה | GraphPad תוכנה | v7 | תוכנת ניתוח נתונים מדעית |
מקורות
- Park, S. W., Moon, Y. A., Horton, J. D. Post-transcriptional regulation of low density lipoprotein receptor protein by proprotein convertase subtilisin/kexin type 9a in mouse liver. Journal of Biological Chemistry. 279 (48), 50630-50638 (2004).
- Cohen, J. C., Boerwinkle, E., Mosley, T. H., Hobbs, H. H.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
