מאמר שיטה

Assay לוציפראז תפוקה גבוהה כדי להעריך את Proteolysis של PCSK9 יחיד-מחזור פרוטאז

7.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/58265

⸱

28 באוגוסט 2018

 ,  , 
1Division of Cardiology, Department of Medicine, Zuckerberg San Francisco General and University of California San Francisco, 2Department of Cellular and Molecular Pharmacology and Howard Hughes Medical Institute, University of California San Francisco

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מציג שיטה להעריך את פעילות הפרוטאוליטי פרוטאז תחלופה נמוכה-פעילות מהותית, יחיד בהקשר הסלולר. באופן ספציפי, שיטה זו מוחלת כדי להעריך את הפעילות הפרוטאוליטי של PCSK9, נהג מפתח של מטבולי הפעילות הפרוטאוליטי נדרש עבור תפקידה hypercholesterolemic האולטימטיבי.

תקציר

סוג סבטיליזין/kexin proprotein convertase 9 (PCSK9) הוא פרוטאז יחיד-מחזור אשר מווסת את רמות ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (LDL) בסרום, וכתוצאה מכך מחלות לב וכלי דם. למרות PCSK9 proteolysis נדרשת עבור השפעתו hypercholesterolemic מלאה, הערכת פונקציית הפרוטאוליטי שלה הוא מאתגר: PCSK9 ידועה רק קליב עצמו עובר רק מחזור אחד, לאחר proteolysis, משמרת את המצע שלה ב אתר פעיל שלה כמו מעכב באופן אוטומטי. השיטות המובאות כאן לתאר וזמינותו אשר מתגבר על האתגרים הללו. הבדיקה מתמקדת proteolysis הבין-מולקולרי ההקשר מבוססת תא, המחשוף מוצלחות קישורים לפעילות לוציפראז המופרש, אשר ניתן בקלות לקרוא המדיום ממוזגים. דרך שלבים רציפים של מוטגנזה מכוונת, תרביות תאים ארעית של הבדיקה לוציפראז, וזמינותו יכול לחקור PCSK9 proteolysis בתנאים של ההפרעות גנטיות או מולקולרית באופן תפוקה גבוהה. מערכת זו היא מתאימה עבור הערכת בשני הביוכימי missense קלינית שהתגלו נוקלאוטיד יחיד פולימורפיזמים (SNPs), כמו גם באשר ההקרנה של מעכבי מולקולה קטנה של PCSK9 proteolysis.

מבוא

PCSK9 מטרות קולטן LDL (LDL-R) עבור השפלה, העלאת הכולסטרול LDL (LDL-C) ונהיגה טרשת עורקים מחלות לב1,2. PCSK9 מיקוד הרפוי robustly להוריד את LDL-C, לשפר את התוצאות לב וכלי דם לחולים, אפילו בעת הוספת טיפול אגרסיבי להורדת שומנים בדם עם סטטינים3,4. אולם, כיום שאושרו טיפולים מוגבלות לנוגדן מבוססי גישות, סובלים מחוסר משתלמת5,6. כדי לפתור בעיה זו, פחות יקר חלופות טיפוליות, אמצעי לזיהוי חולים עשויה להרוויח יתרונות גדולים יותר, או שניהם, נדרשים.

גישות מולקולה קטנה יכולה מטרה תאיים PCSK9, מספקים נתיב משופרת של הממשל, לצמצם עלויות, שהופך אותם "הגביע הקדוש" זה באיזור7. עם זאת, PCSK9 הוכיח שקשה סמים על ידי מולקולות קטנות. כמו פרוטאז, מיקוד פונקציית הפרוטאוליטי של PCSK9 היא אסטרטגיית אטרקטיבי, כפי העצמי-proteolysis היא הצעד הגבלת קצב ההבשלה PCSK98 והוא נדרש לקבלת אפקט מקסימלי שלה ב- LDL-R9. עד כה, עם זאת, אסטרטגיה זו לא היה מוצלח, ככל הנראה בגלל הביוכימיה הייחודית של PCSK9: PCSK9 cleaves רק עצמו10, ביצוע תגובה אחת-מחזור, לאחר העצמי-המחשוף, PCSK9 prodomain כבולים בתוך האתר הפעיל כמו auto-מעכב11, מונע את המדידה של כל פעילות נוספת פרוטאז.

מאמר זה מציג שיטה להעריך פונקציית הפרוטאוליטי PCSK9 אופנה תפוקה גבוהה8. דרך מוטגנזה, חוקרים יכולים להשתמש assay הזה כדי לחקור את ההשפעות של קידוד SNPs נמצאו במרפאה כדי להעריך אותם על ההשפעות על proteolysis, השלב הגבלת קצב ההבשלה PCSK9. בנוסף, שיטה זו תהיה שימושית בעיצוב של מסכי תפוקה גבוהה לזיהוי מאפננים של PCSK9 proteolysis, אשר נמצאים צפוי בסופו של דבר לשבש את המצגת של PCSK9 ה-LDL-r (ו לווסת את אפקט hypercholesterolemic של PCSK9) . לבסוף, פרוטוקול זה ניתן להתאים אחרים פרוטאזות עם פעילות מהותית נמוך, ובלבד i) זוג סובסטרט מסוים-פרוטאז ניתן למצוא, ii) עוגן תאיים מתאים יכול להתבסס על המצע.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. מוטגנזה של וקטור פרוטאז

  1. עיצוב וסדר מסונתז מותאמת אישית oligonucleotides להתקין מוטציה של הריבית באמצעות שינוי של פרוטוקולים סטנדרטיים מוטגנזה12. תחל desalted רגיל (ללא טיהור נוסף) מקובלים לחלוטין.
    הערה: הגישה הכללית של פריימר עיצובים כרוך ביצירת תחל חופפים חלקית, כמצוין בטבלה 1, באמצעות מחשבון טמפרטורה (Tm) ההיתוך ספיציפית פולימראז עניין.
  2. להגדיר תגובות שרשרת של פולימראז (מותני) מוטגנזה בקרח, כמצוין בטבלה מס ' 2.
  3. מחזור את מותני כמצוין בטבלה3.
  4. לרוץ 2-5 µL של כל ה-PCR על 1% agarose ג'ל והמחש את המוצרים כדי לאשר הגברה מוצלחת.
    הערה: PCR מוצלח יציגו להקה דנ א אחד, בולט ב דה מרקר בגודל המשוער של התבנית (~7.8 kB).
  5. להוסיף 0.5 µL (לכל תגובה 25-µL) של DpnI, דגירה בדגימות ב 37 ° C עבור 1 h.
  6. להפוך µL 2 התגובה לתוך כשיר מבחינה כימית Escherichia coli.
    הערה: זן e. coli בצמיחה מהירה תפחית הדגירה פעמים, אך כל זן שיבוט שיהיה מקובל.
  7. צלחת העתקות על גבי אגר לוריא-Bertani (LB) המכיל 50-100 carbenicillin µg/mL. דגירה הלוחות בן לילה ב 37 º C.
  8. בחר 2-4 מושבות לגדול בתרבות בקנה מידה קטן (2-5 מ ל LB בינוני עם 50-100 carbenicillin µg/mL). דגירה התרבות ב 37 ° C-220 סל"ד עד שזה עכורים.
  9. לבודד את פלסמיד ה-DNA של התאים באמצעות ערכת טיהור (קרי, "miniprep") דנ א פלסמיד בהתאם להוראות היצרן. לכמת את ריכוז הדנ א eluted באמצעות ספקטרופוטומטרים microvolume.
  10. רצף של פלסמיד DNA בהרחבה באמצעות שירות רצף סנגר (כגון ליבה או מתקן מסחרי). להכין דגימות ה-DNA בהתאם למפרטים של השירות. תחל בעבר בהצלחה בתגובות קודמות רצף מצוינים בטבלה4.
    הערה: עקב הגברה PCR של פלסמיד כולו, הרצף של האזור כולו של קידוד PCSK9 מומלצת עבור כל מוטציה.

2. תפוקה גבוהה מבוססי לוציפראז Proteolysis Assay

  1. תא ציפוי (יום 0)
    1. להשתמש בתאים HEK293T נמוך-המעבר לניסויים ולשנות התרבות של Dulbecco איגל בינוני (DMEM) עם 10% סרום שור עוברית (FBS). לבצע כל תא עבודה בתנאים סטריליים בשכונה תרביות רקמה עד מוכן assay הפעילות לוציפראז. להעריך את מספר בארות ו לוחות הדרושים עבור הניסוי, צופה כי transfections יבוצעו דולר עבור כל תנאי נבדק.
    2. מביצועם HEK293T תאים מבקבוק האב אם תתייחס אליהם עם נפח מינימלי של 0.05% טריפסין-ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) כדי לכסות את התאים. בטל את טריפסין-EDTA עם 2 כרכים של DMEM בתוספת 10% FBS והעברת התאים צינור סטרילי. לספור את התאים באמצעות מונה הניתן תא אוטומטיות (ולא מכתים עם trypan blue). Centrifuge את הצינור ב x 500 g עבור 5 דקות כדי לשחזר את התאים.
    3. האחות בינוני המכילים טריפסין, לשקם את התאים בטווח הבינוני תרבות כדי ריכוז של 2 x 105 תאים למ"ל. באמצעות פיפטה רב-ערוצי, העברת 100 µL של התאים כל טוב של צלחת 96-ובכן לבן (אטום-למטה), אשר נותן ריכוז זריעה הסופי של 2 x 104 תאים/טוב.
      הערה: לניסויים הראשונית, זה עשוי להיות שימושי כדי בנוסף זרע של אחות, צלחת 96-ובכן ברור-התחתון, כדי לעקוב אחר גדילת התאים תוך היצמדות במהלך פרוטוקול ו מדריך פתרון עתידי.
    4. דגירה התאים-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 במשך 24 שעות ביממה.
    5. להכין צלחת הבסיס של פלסמידים בתבנית 96-ובכן. לדלל כל פלסמיד במאגר • תנאי (טריס-HCl, pH 8.5) כדי 50 ng/µL היטב בודדים של צלחת 96-ובכן.
      1. להכין 4 בארות פלסמיד בקרה חיובית (WT)8, שליטה שלילי (S386A) פלסמיד8ו נטול פלסמיד מאגר (עבור transfections מעושה). אם תרופות או טיפולים אחרים מבוססי סלולר להיות מתוכננים, אז להכין בסיס לצלחת עם פלסמיד בקרה חיובית (WT) כל היטב יחד עם 4 בארות כל אחד את פלסמיד שליטה שלילי (S386A), המאגר ללא פלסמיד.
  2. תרביות תאים (יום 1)
    1. להכין לתערובת תרביות תאים בתבנית 96-ובכן צלחת באמצעות לוחות 96 עמוק-טוב-טוב. לבצע את transfections דולר, הקפד להכין מספיק ריאגנטים לקחת בחשבון הפסדים pipetting והעברה.
      הערה: החישובים הבאים להכין מספיק ריאגנט להפעלת לוח 96-ובכן אחד דולר (אומדן שמרני-וולס 420).
      1. להפוך את תערובת הבסיס של ריאגנט תרביות תאים השומנים מדולל, הוספת µL 50.4 של ריאגנט 2050 µL של מדיום מופחת-סרום. להפוך את תערובת הבסיס של ריאגנט precomplexation DNA, הוספת µL 33.6 של ריאגנט לתוך 1730 µL של מדיום מופחת-סרום.
      2. באמצעות פיפטה רב-ערוצי, aliquot µL 16.8 של התערובת ריאגנט precomplexation DNA מדולל לבאר כל צלחת עמוקה-ובכן.
      3. באמצעות פיפטה רב-ערוצי, aliquot 3.2 µL (160 ng) של כל פלסמיד מהצלחת הראשית לבאר כל צלחת עמוקה-. טוב.
      4. באמצעות פיפטה רב-ערוצי, aliquot 20 µL תערובת ריאגנט תרביות תאים השומנים מדולל לכל אחד טוב של הצלחת ומערבבים את התוכן של כל טוב באמצעות פיפטה רב-ערוצי. לכסות את הלוחות ולתת להם לשבת בטמפרטורת החדר (RT) למשך 10-15 דקות כדי מתחמי השומנים: DNA טופס.
        הערה: על תרביות תאים, הרכיבים הסופי לכל טוב יהיה כדלקמן: 40 ng של ה-DNA, 0.12 µL של תרביות תאים ריאגנט µL 0.08 של ריאגנט pre-complexation דנ א, ואת התוכן של כל אחד יהיה 10 µL סה כ נפח (מופחת-סרום בינוני).
    2. בעדינות חילופי המדיום על תאים 293T לוחית 96-ובכן באמצעות פיפטה רב-ערוצי, מקפיד לא לשבש את התאים. להחליף את המדיום aspirated 95 µL של DMEM בתוספת 10% FBS.
      הערה: זה יהיה זמן מתאים לטיפול תאי בתרופה בכל עניין.
    3. להוסיף 10 µL של תערובת תרביות תאים לכל המתאים היטב באמצעות פיפטה רב-ערוצי. מערבולת בעדינות את הצלחת לערבב את התוכן הנמצא הבארות. דגירה את הצלחת ב 37 ° C עם 5% CO2 במשך 24 שעות ביממה.
      הערה: הנפח הסופי של הבארות מגיע 105 µL, להביא בחשבון התאדות מעל 24 שעות.
  3. Assay (יום 2)
    1. להכין פתרון מניות ריאגנטים coelenterazine: 3 מ' סודיום אסקורבט [מומס באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS), טרי] 5 מ' NaCl, 10 מ"ג/מ"ל שור אלבומין (BSA; מומס ב- PBS, טרי), coelenterazine 2 מ מ (מומס acidified מתנול המכיל 200 µL של HCl N 3 לכל 10 מ ל).
      הערה: ניתן לאחסן את coelenterazine 2 מ מ 2 שבועות כאשר נשמר ב-80 מעלות צלזיוס, בהיעדר אור.
    2. להכין 2 ריאגנטים x coelenterazine המדידה לוציפראז, עם נפרד ריאגנט כל התאים, בינוני, על פי טבלה 5. לערבב כל ריאגנטים להציל coelenterazine קודם, לסנן את התערובת דרך מסנן מזרק 0.22-מיקרומטר, ולאחר מכן להוסיף את coelenterazine. להגן על ריאגנטים אור עד שיהיו מוכנים להוסיף הצלחות.
      הערה: בשל האובדן של פתרון של סינון, לבצע מספיק ריאגנט לקחת בחשבון הן את ההפסד סינון, אך גם מן העברות. טבלה 5 מראה את הריכוז הסופי של ריאגנטים 2 x (כמו גם את כמות המניות פתרון כדי להוסיף לקרוא את לוח 96-ובכן אחד עם ריאגנט אחד).
    3. להסיר התאים החממה 24 שעות לאחר תרביות תאים. באמצעות פיפטה רב-ערוצי, להעביר µL 50 בינוני ממוזגים מכל קידוח טריים, עם תחתית לבן (אטום) 96-ובכן צלחת.
      1. תווית הלוחות לגבי אם הם מכילים בינוני או תאים. אם אחד או יותר צלחת 96-ובכן היה transfected, תווית את הצלחות על מנת להבטיח כי כל צלחת המכילות בינוני מזווג עם צלחת האב שלה של תאים.
    4. בעזרת פיפטה רב-ערוצי, להוסיף 50 µL של 2 x ריאגנט coelenterazine שאינם lytic לצלחת המכילה רק ממוזגים בינוני. בעדינות רוק או לנער את הצלחת בהיעדר אור למשך 5-10 דקות ב- RT.
    5. בעזרת פיפטה רב-ערוצי, להוסיף 50 µL של ריאגנט lytic coelenterazine x 2 לצלחת המכילות את התאים. בעדינות רוק או לנער את הצלחת בהיעדר אור למשך 5-10 דקות ב- RT.
    6. לאחר הדגירה, הקריא את הארה של צלחת בינונית בלבד בקורא צלחת. . אז, לקרוא החוצה של הפריה חוץ גופית של צלחת המכילות תאים בקורא ה-צלחת אותו.
    7. למחוק את הצלחות ולשמור את הקבצים עבור ניתוח נתונים.

3. ניתוח נתונים

  1. לבצע ניתוח נתונים ראשוניים באמצעות תוכנת הגיליון האלקטרוני. צור גיליון המכיל את התוצאות של התא עם הלוחיות בינוני.
  2. באופן ידני לבדוק את הנתונים מכל הלוחות תא לזהות לקוי transfected בארות. וולס המציגים < 5% - 10% של המדידה של פלסמיד שליטה שלילי (S386A) צריכה להיחשב הכי גרוע transfected, שהופך את הפרשנות של החשוד נתונים אלה.
  3. לחשב את לומינסנציה רקע הממוצע של כל צלחת מן הבארות transfected מעושה. להחסיר את הרקע של כל צלחת לפי הערכים של הלוחית הזאת.
    הערה: ערך זה עשוי להיות זניח בהתאם לקורא לצלחת משמש.
  4. הנתונים על-ידי חישוב היחס של פעילות לוציפראז המדיום בהשוואה הפעילות לוציפראז הכללית במשך כל תהליך. כי הצלחת התא מכיל שני בינוני ממוזגים בנוסף תאים, לצלחת בינונית בלבד מכיל את אותה כמות של בינוני ממוזגים כמו הלוח התא, זה ראוי לעשות שימוש במשוואה הבאה:
    figure-protocol-1
    הנה, RLU = יחידות הפריה חוץ גופית יחסית, המדידה המופחת-רקע מהקורא את הצלחת.
  5. לחשב את לוציפראז המופרש אכזרי של הפקד חיובי (WT) ואת הבארות שליטה שלילי (S386A).
  6. להעריך את האיכות הכוללת של הניסוי על-ידי חישוב של Z-פקטור13:
    figure-protocol-2
    הערה: ערכי פעיל באות מהפקד חיובי (WT), הערכים שאינם פעילים מגיעים מן הבארות שליטה שלילי (S386A). ערכים קרוב יותר ל- 1 מצביעים על איכות ניסויית גבוהה יותר. לשקול לחזור על הניסוי או מיטוב זרימת העבודה אם הערך הוא מתחת ל-0.
  7. להעביר את הנתונים מתוך התוכנית הגיליון האלקטרוני לתוך תוכנת ניתוח נתונים מדעיים.
  8. לנרמל את הפעילות לוציפראז המופרש לערכים אכזרי של הפקד חיובי (WT) ואת הפקד שלילי (S386A), הגדרת הפקד חיוביים כמו 1 ופקד שלילי של-0.
  9. נקה את הנתונים עבור ליניאריים באמצעות שיטת הסרה (האלכסון) ברגרסיה, חריג חשוד טעות, הגדרת הקצב המרבי גילוי שווא על 1%.
  10. הערכת הבדלים משמעותיים סטטיסטית על-ידי השוואת הנתונים עבור כל המוטציות תנאי (או מוטציה) כדי הממוצע של הפעילות WT (מנורמל לערך של 1). לבצע אינטראקצית מרובים t-בדיקות, תיקון להשוואות מרובות באמצעות שיטת הולם-Sidak α = 0.05.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

וזמינותו תפוקה גבוהה proteolysis נשענת על התגברות על שלושה אתגרים מרכזיים. ראשית, כדי להתגבר על הפלט נמוך מהותית של יחיד-מחזור PCSK9 פרוטאז, פרוטאז PCSK9 חסר מעכבות את prodomain משמשת, עם הרצף המחשוף בזנב prodomain קשורה לוציפראז יכולים להיות מופרשים14. שנית, כדי לספק את הצורך פרוטאז לקפל מורכבים עם מעכבות את prodomain, שני polypeptides הם coexpressed טרנס בתוך ההקשר הסלולר15,16, באמצעות ו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

ניסיוני בהליכים המתוארים לעיל להציג שיטה להתגבר על הפעילות נמוך מהותית הפרוטאז יחיד-מחזור PCSK9 ולהעריך את פונקציית הפרוטאוליטי בצורה איתנה. המושג מפתח וזמינותו נשענת על המרת אירוע יחיד-מחזור readout enzymatically מוגבר. נקודות החוזק של וזמינותו כוללים את מסגרת זמן קצר יחסית קלות השימוש של הכתב לוציפראז, כמו גם את המדרגיות גישות תפוקה גבוהה. בנוסף, וזמינותו מוערך proteolysis בהקשרה טבעית, הסלולר. יתר על כן, עם זה assay, SNPs קלינית מזוהה נבחנים והשפעותיהם על PCSK9 proteolysis ללא הצורך בכל רקמה אנושית או החולה; רק הידע ג...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

המחברים את התמיכה מימון נדיב מן NHLBI/NIH (K08 HL124068 ו- HMOT1243 אימייל), NCATS/NIH דרך UCSF קלינית Translational המדע מכון זרז לתוכנית (UL1 TR000004), הסנאט אקדמי UCSF, קרן הלמן, תודה גלעד מדעי מחקר מלומד פרס, פרס לב וכלי דם מתאווים פייזר (הכל אל חריפה ס ג'ון), הווארד יוז המכון הרפואי (ועד גיא טל מ Galvan וקוואן לשווקת מ').

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צינורות PCRארה"ב מדעי1402-2900עבור PCR
Q5 התחלה חמהניו אינגלנד BiolabsM0493Lתערובת תמיסת DNA פולימראז דאוקסינוקלאוטיד בנאמנות גבוהה
ניואינגלנד BiolabsN0447LdNTPs (עבור PCR)
pPCSK9-NLucProteaseAssay-WTמחבריםn/aזמין אצל המחברים
pPCSK9-NLucProteaseAssay-S386Aמחבריםn/aזמין אצל המחברים
Agarose LEGold BiotechnologyA-201-100עבור ג'ל DNA
מערכת הדמיית E-Gel עם בסיס אור כחולThermoFisher Scientific4466612להדמיית ג'ל
DNA SYBR כתם ג'ל DNA בטוחThermoFisher ScientificS33102עבור ג'ל DNA
Tris BaseThermoFisher ScientificBP152-1עבור DNA ג'ל ריצה מאגר
חומצה אצטית קרחוניתThermoFisher ScientificA38-500עבור DNA ג'ל ריצה מאגר
Ethylenediaminetetraacetic תמיסת חומצהMillipore Sigma3690EDTA, עבור DNA ג'ל ריצה מאגר
1 kb סולם DNAזהב ביוטכנולוגיהD010סולם DNA
DpnIניו אינגלנד BiolabsR0176Sאנזים הגבלה
צלחות LB Agar עם 100 ומיקרו; g/mL קרבניציליןTeknovaL1010LB-Carb
צלחות One Shot Mach1 T עמיד בפני פאג'ים מוכשר כימית E. coliThermoFisher ScientificC862003תאים מוכשרים כימית
מרק LB, MillerThermoFisher ScientificBP1426-2LB
קרבניציליןזהב ביוטכנולוגיהC-103-5אנטיביוטיקה
E.Z.N.A. ערכת מיני פלסמיד Iאומגה ביוטקD6942-02ערכת מיני-הכנה לטיהור DNA
NanoDrop 2000 ספקטרופוטומרThermoFisher ScientificND-2000Cספקטרופוטומטר
293T תאיתרביות רקמות אמריקאיות (ATCC)CRL-3216HEK 293T תאי
DMEM, גלוקוז גבוה, פירובטThermoFisher Scientific11995065DMEM, תא יונקים מדיה
עובר בקר SeraAxenia BiologixF001FBS
Trypsin-EDTA (0.05%), פנול אדוםThermoFisher Scientific25300062טריפסין, לדיסוציאציה של תאים
פוספט חוצץ מלח (PBS)ThermoFisher Scientific10010023PBS
Countess מונה תאים אוטומטיThermoFisher ScientificC10227ספירת תאים אוטומטית
שקופיות תא ספירת תאים של רוזנתThermoFisher ScientificC10228שקופיות לספירת תאים
צלחות תרבית רקמות CELLSTAR, לבן, לבן-תחתון, עם מכסהGrenier Bio-One655083לבן, לבן תחתון 96 צלחת
באר TempPlate ללא חצאית 96 בארות PCR, טבעיUSA Scientific1402-959696 צלחת באר לצלחת פלסמיד מאסטר
Nunc 2.0 מ"ל DeepWell צלחותThermoFisher Scientific27874396 באר עמוקה צלחת
ליפופקטמין 3000ThermoFisher ScientificL3000008מגיב טרנספקציה ליפיד, Lf3K
P3000 מגיבThermoFisher ScientificL3000008מגיב קדם קומפלקסציה DNA, מסופק עם Lf3K
OptiMEM I סרום מופחת בינוניThermoFisher Scientific31985062מדיום סרום מופחת עבור טרנספקציה
(+)-נתרן L-אסקורבטMillipore SigmaA4034נתרן אסקורבט
נתרן כלוריMillipore SigmaS9888NaCl
אלבומין, סרום בקר, שבר V, מתכות כבדות נמוכותMillipore Sigma12659BSA
מתנול (HPLC)ThermoFisher ScientificA4524MeOH
חומצה הידרוכלוריתVWRJT9535-2מרוכז HCl
CoelenterazineGold BiotechnologyCZ2.5מסנן מזרק מצע לוציפראז
, מסנןThermoFisher Scientific09-720-3סטרילי, PVDF, 0.22 ומיקרו; m נקבוביות
Pipet-Lite רב פיפטה L12-200XLS +Rainin17013810רב ערוצי
פיפטה Pipet-Lite רב פיפטה L12-20XLS +Rainin17013808פיפטה רב ערוצית
Pipet-Lite רב פיפטה L12-10XLS +Rainin17013807רב ערוצי
פיפטה ריאגנט מאגרקורנינג4870שוקת לריאגנטים
צינורות צנטריפוגה, 15 מ"לThermoFisher Scientific05-539-12צינורות 15 מ"ל
צינורות צנטריפוגה, 50 מ"לצינורות קורנינג430829 50 מ"ל
קורא מיקרופלטות ניצוץ קורא צלחותTecanN/aExcel
Microsoft2016 עבור Macתוכנת גיליון אלקטרוני
פריזמהGraphPad תוכנהv7תוכנת ניתוח נתונים מדעית
סלקטיבית אוסף סטרילי

מקורות

  1. Park, S. W., Moon, Y. A., Horton, J. D. Post-transcriptional regulation of low density lipoprotein receptor protein by proprotein convertase subtilisin/kexin type 9a in mouse liver. Journal of Biological Chemistry. 279 (48), 50630-50638 (2004).
  2. Cohen, J. C., Boerwinkle, E., Mosley, T. H., Hobbs, H. H. Sequence variations in PCSK9, low LDL, and protection against coronary heart disease. New England Journal of Medicine. 354 (12), 1264-1272 (2006).
  3. Ridker, P. M., et al. Cardiovascular Efficacy and Safety of Bococizumab in High-Risk Patients. New England Journal of Medicine. 376 (16), 1527-1539 (2017).
  4. Sabatine, M. S., et al. Evolocumab and Clinical Outcomes in Patients with Cardiovascular Disease. New England Journal of Medicine. 376 (18), 1713-1722 (2017).
  5. Kazi, D. S., et al. Cost-effectiveness of PCSK9 Inhibitor Therapy in Patients With Heterozygous Familial Hypercholesterolemia or Atherosclerotic Cardiovascular Disease. Journal of the American Medical Association. 316 (7), 743-753 (2016).
  6. Kazi, D. S., et al. Updated Cost-effectiveness Analysis of PCSK9 Inhibitors Based on the Results of the FOURIER Trial. Journal of the American Medical Association. 318 (8), (2017).
  7. Pettersen, D., Fjellström, O. Small molecule modulators of PCSK9 - A literature and patent overview. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 28 (7), 1155-1160 (2018).
  8. Chorba, J. S., Galvan, A. M., Shokat, K. M. Stepwise processing analyses of the single-turnover PCSK9 protease reveal its substrate sequence specificity and link clinical genotype to lipid phenotype. Journal of Biological Chemistry. 293 (6), 1875-1886 (2018).
  9. Maxwell, K. N., Breslow, J. L. Adenoviral-mediated expression of Pcsk9 in mice results in a low-density lipoprotein receptor knockout phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (18), 7100-7105 (2004).
  10. Benjannet, S., et al. NARC-1/PCSK9 and its natural mutants: zymogen cleavage and effects on the low density lipoprotein (LDL) receptor and LDL cholesterol. Journal of Biological Chemistry. 279 (47), 48865-48875 (2004).
  11. Cunningham, D., et al. Structural and biophysical studies of PCSK9 and its mutants linked to familial hypercholesterolemia. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (5), 413-419 (2007).
  12. Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnology. 8, 91(2008).
  13. Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  14. Hall, M. P., et al. Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS Chemical Biology. 7 (11), 1848-1857 (2012).
  15. McNutt, M. C., Lagace, T. A., Horton, J. D. Catalytic activity is not required for secreted PCSK9 to reduce low density lipoprotein receptors in HepG2 cells. Journal of Biological Chemistry. 282 (29), 20799-20803 (2007).
  16. Chorba, J. S., Shokat, K. M. The proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) active site and cleavage sequence differentially regulate protein secretion from proteolysis. Journal of Biological Chemistry. 289 (42), 29030-29043 (2014).
  17. Benjannet, S., Rhainds, D., Hamelin, J., Nassoury, N., Seidah, N. G. The proprotein convertase (PC) PCSK9 is inactivated by furin and/or PC5/6A: functional consequences of natural mutations and post-translational modifications. Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30561-30572 (2006).
  18. Zhao, Z., et al. Molecular characterization of loss-of-function mutations in PCSK9 and identification of a compound heterozygote. American Journal of Human Genetics. 79 (3), 514-523 (2006).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

PCSK9throughputHEK293CoelenterazineSNP

מאמרים קשורים