Method Article

אסטרטגיית יעיל ליצירת מערכות רקמות ספציפיות שעתוק בינאריים ב דרוזופילה על-ידי עריכת הגנום

DOI:

10.3791/58268

⸱

September 19th, 2018

 ,  ,  , 
1Department of Cell Biology and Molecular Genetics, University of Maryland

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים שיטה ליצירת מערכות רקמות ספציפיות שעתוק בינאריים ב דרוזופילה על-ידי החלפת את אקסון קידוד הראשון של גנים עם מנהלי התקנים של שעתוק. השיטה מבוססת על CRISPR/Cas9 ממקם את רצף transactivator תחת ויסות גנים הוחלף אנדוגני, כתוצאה מכך ומקילה על ההתבטאות transctivator באופן בלעדי בדפוסי ייתכן גנים ספציפיים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. המערכות כלים רבי-עוצמה גנטיים בשימוש נרחב עבור להמחיש וטיפול גורל התא והביטוי ג'ין בקבוצות מסוימות של תאים או רקמות אורגניזמים דגם שעתוק בינארי. מערכות אלו מכילות שני רכיבים כשורות נפרדות מהונדס. נהג קו מבטא מפעיל גנים ברמת השעתוק תחת השליטה של רקמות ספציפיות היזמים/מוצרי טיפוח טבעיים, נמלים שורה של הכתב/אפקטור גן המטרה להציב downstream לאתר איגוד של שעתוק activator. חיות מחסה שני הרכיבים לגרום transactivation רקמות ספציפיות של ביטוי גנים היעד. ייתכן ביטוי מדויק של הגן ברקמות יישוב חיוני לפרשנויות לא משוחדת של פעילות התא/ג'ין. לפיכך, פיתוח שיטה ליצירת קווים בלעדיים תא/רקמות ספציפיות הנהג הוא חיוני. כאן אנו מציגים שיטה ליצירת מערכת ביטוי ממוקד מאוד רקמות ספציפיות על-ידי העסקת "מקובצים באופן קבוע Interspaced קצר Palindromic חוזר/CRISPR-הקשורים" (CRISPR/Ca)-מבוסס גנום עריכה טכניקה. בשיטה זו, מדריך endonuclease Cas9 מכוון על ידי שניים chimeric RNAs (gRNA) אתרים ספציפיים אקסון קידוד הראשון של גנים בגנום דרוזופילה ליצירת מעברי כפול-סטרנד (DSB). לאחר מכן, באמצעות פלסמיד התורם אקסוגני של המכיל את רצף transactivator, המכונות תיקון תא-אוטונומית מאפשרת תיקון מכוון הומולוגיה (HDR) של DSB, וכתוצאה מכך למחיקה מדויקת החלפת אקסון עם transactivator רצף. Transactivator הפיל במתבטא אך ורק בתאים איפה חבר העמים-רגולציה מרכיבי הגן הוחלף פונקציונליים. פרוטוקול צעד אחר צעד מפורט המובאת כאן ליצירת נהג תעתיק בינארי לידי ביטוי דרוזופילה fgf/branchless-הפקת תאים אפיתל עצביים יכולים להיות מאומץ עבור כל ביטוי גנים - או רקמות ספציפיות.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ארגז הכלים גנטי על ביטוי גנים יישוב פותחה טוב דרוזופילה, שהופך אותו לאחד מערכות המודל הטוב ביותר לחקור את הפונקציה של גנים המעורבים במגוון רחב של תהליכים תאיים. מערכות ביטוי בינארי, כגון שמרים Gal4/UAS (רצף הפעלה נגד הזרם), אומצה תחילה על רקמות ספציפיות משפר השמנה וסדר -ג'ין misexpression מודל גנטי דרוזופילה 1 (איור 1). מערכת זו הקל הפיתוח של מספר רב של טכניקות כגון ויסות זמן-מרחבי של ביטוי גנים, misexpression, נוקאאוט בקבוצות נבחרות של תאים כמו גם כמו אבלציה התא, התא סימון, עקיבה חיה של תאית ומולקולרית תהליכים בתוך העובר, רקמות, מעקב אחר שושלת היוחסין וניתוחים פסיפס במהלך הפיתוח. מספר של....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. עיצוב ובניית gRNA את הביטוי וקטור

  1. להחלפת במדויק אזור זמן המוגדר אקסון, להשתמש gRNA כפול הגישה6, שבו כל gRNA במיוחד יעד שני הקצוות של האזור הנבחר של ריבית. כדי לקבל ביטוי גנים ספציפיים ייתכן מדויק של מנהל ההתקן, בחר שני אתרי היעד gRNA בתוך אקסון קידוד הראשון של הגן.
  2. דרוזופילה melanogaster, בחר את האתרים gRNA היעד באמצעות הכלי אופטימלית היעד מאתר flyCRISPR (http://tools.flycrispr.molbio.wisc.edu/targetFinder/). כלי עיצוב הזמינים אחרים CRISPR ניתן להשתמש גם כן, כולל כלי אופטימיזציה העיצוב CRISPR (http://crispr.mit.edu), FlyCas9 (https://shigen.nig.ac.jp/fly/nigfly/cas9), ו- E-פריך (www.e-crisp.org/E-CRISP).....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה שימש בהצלחה כדי ליצור ביטוי בינארי יישוב כתב מערכת ספציפי עבור bnl לבטא תאים5. Cis-אלמנטים רגולטוריות (קרס) כי ייתכן מורכבים bnl הביטוי שליטה לא מאופיינים. לכן, כדי להשיג ביטוי ייתכן תחת השליטה של רצף רגולטורי אנדוגני bnl , רק אקסון קידוד הראשון של bnl נועד להיות מוחלף עם רצף transactivator לקסה חיידקי. נבחר של קלטת משופרת nls-LexA::p65 ידוע לספק מיטביים ביטוי דרוזופילה .

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

באופן מסורתי, מלכודות משפר דרוזופילה נוצרו על ידי שתי שיטות שונות. אחת הדרכים כולל הכניסה אקראי של מנהל התקן (למשל., Gal4) רצף הגנום על ידי טרנספוזיציה (למשל., P-אלמנט טרנספוזיציה)1 . לחלופין, ניתן להציב את רצפי הנהג תחת שליטה תעתיק של אזור משפר בשם/יזם בונה פלסמיד, אשר אז ניתן לשלב אתר חוץ רחמי של גנום3,11. למרות ששיטות אלה יצרו בריכה גדולה של Gal4 או מלכודות משפר לקסה עבור דרוזופילה, .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים יציאת פ ד ר ד ר ק' אוקונור-ג'יילס, ד ר ס פנג לדיונים על אסטרטגיה CRISPR; שחפת ד ר קורנברג, המרכז מניות בלומינגטון ריאגנטים; UMD מתקן דימות הליבה; המימון של NIH: R00HL114867 ו- R35GM124878 כדי האב

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
X-Gal/IPTGGentrox (Genesee Scientific)18-218שיבוט
LB-AgarBD DifcoBD  244520שיבוט
Tris-HClSigma AldrichT3253ביולוגיה מולקולרית
EDTASigma AldrichE1161ביולוגיה מולקולרית
NaClSigma AldrichS7653ביולוגיה מולקולרית
UltraPure DNase/RNase מים ללאThermoFisher Scientific10977-023ביולוגיה מולקולרית
10% SDSסיגמא אולדריץ'71736ביולוגיה מולקולרית
KOAcFisher-ScientificP1190ביולוגיה מולקולרית
EtOHFisher-Scientific04-355-451ביולוגיה מולקולרית
GeneJET MiniprepThermoFisher ScientificK0503Miniprep
PureLink HiPure Plasmid Maxipep ערכותThermoFisher ScientificK210006Maxiprep
BbsINEBR0539Sשל אנזים הגבלה
IDT-DNAPCR
pCFD4מעבדתתבנית DNA ווקטור עבור gRNA
KAPA HiFi Hot Start- (Kapa Biosystems)Kapa biosystemsKK2601PCR
Q5-נאמנות גבוהה TaqNEBNEB #M0491PCR
Gibson Assembly Master MixNEBNEB #E2611הרכבת DNA
pBPnlsLexA:p65UwAddgeneלהגברת LexA
Proteinase KThermoFisher Scientific25530049ביולוגיה מולקולרית
2x PCR PreMix, עם צבע (אדום)SydlabMB067-EQ2Rג'ל לביולוגיה מולקולרית
Zymo Research (Genesee Scientific)11-300מגיב
TRI לביולוגיה מולקולריתערכות טיהור RNA של Sigma-Aldrich
Direct-zolZymo Research (Genesee Scientific)11-330ביולוגיה מולקולרית
OneTaq ערכת RT-PCR חד-שלביתNEBE5315Sביולוגיה מולקולרית
lexO-CherryCAAXKornberg Labקו זבוב
UAS-CD8:GFPמעבדתקו זבוב
btl-Gal4Kornberg labline
MKRS/TB6Bמעבדתקו זבוב
מיקרוסקופ קונפוקלי SP5XLeicaדפוס ביטוי הדמיה
CO2 stationGenesee Scientific59-122WCUזבוב דוחף
מיקרוסקופ סטריאואולימפוסSZ-61זבוב דוחף
עליים הומוגניזציה של מיקרו-צינורותפישר-סיינטיפיק03-421-217בידוד DNA גנומי
ספקטרופוטומטרNanoDrop ThermoFisher ScientificND-1000כימות DNA
פריימרים קורנברג תבנית DNA של ערכת שטיפת Biology קורנברג קורנברג

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  2. Lai, S. -L., Lee, T. Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophil....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

CRISPR Cas9Binary Transcription SystemTissue specific ExpressionDrosophila Genome EditingHomology directed RepairGuide RNA DesignTransactivator Knock inExon ReplacementSpatiotemporal RegulationGAL4 LexA System

Related Articles