אסטרטגיית יעיל ליצירת מערכות רקמות ספציפיות שעתוק בינאריים ב דרוזופילה על-ידי עריכת הגנום

סיכום

כאן, אנו מציגים שיטה ליצירת מערכות רקמות ספציפיות שעתוק בינאריים ב דרוזופילה על-ידי החלפת את אקסון קידוד הראשון של גנים עם מנהלי התקנים של שעתוק. השיטה מבוססת על CRISPR/Cas9 ממקם את רצף transactivator תחת ויסות גנים הוחלף אנדוגני, כתוצאה מכך ומקילה על ההתבטאות transctivator באופן בלעדי בדפוסי ייתכן גנים ספציפיים.

תקציר

. המערכות כלים רבי-עוצמה גנטיים בשימוש נרחב עבור להמחיש וטיפול גורל התא והביטוי ג'ין בקבוצות מסוימות של תאים או רקמות אורגניזמים דגם שעתוק בינארי. מערכות אלו מכילות שני רכיבים כשורות נפרדות מהונדס. נהג קו מבטא מפעיל גנים ברמת השעתוק תחת השליטה של רקמות ספציפיות היזמים/מוצרי טיפוח טבעיים, נמלים שורה של הכתב/אפקטור גן המטרה להציב downstream לאתר איגוד של שעתוק activator. חיות מחסה שני הרכיבים לגרום transactivation רקמות ספציפיות של ביטוי גנים היעד. ייתכן ביטוי מדויק של הגן ברקמות יישוב חיוני לפרשנויות לא משוחדת של פעילות התא/ג'ין. לפיכך, פיתוח שיטה ליצירת קווים בלעדיים תא/רקמות ספציפיות הנהג הוא חיוני. כאן אנו מציגים שיטה ליצירת מערכת ביטוי ממוקד מאוד רקמות ספציפיות על-ידי העסקת "מקובצים באופן קבוע Interspaced קצר Palindromic חוזר/CRISPR-הקשורים" (CRISPR/Ca)-מבוסס גנום עריכה טכניקה. בשיטה זו, מדריך endonuclease Cas9 מכוון על ידי שניים chimeric RNAs (gRNA) אתרים ספציפיים אקסון קידוד הראשון של גנים בגנום דרוזופילה ליצירת מעברי כפול-סטרנד (DSB). לאחר מכן, באמצעות פלסמיד התורם אקסוגני של המכיל את רצף transactivator, המכונות תיקון תא-אוטונומית מאפשרת תיקון מכוון הומולוגיה (HDR) של DSB, וכתוצאה מכך למחיקה מדויקת החלפת אקסון עם transactivator רצף. Transactivator הפיל במתבטא אך ורק בתאים איפה חבר העמים-רגולציה מרכיבי הגן הוחלף פונקציונליים. פרוטוקול צעד אחר צעד מפורט המובאת כאן ליצירת נהג תעתיק בינארי לידי ביטוי דרוזופילה fgf/branchless-הפקת תאים אפיתל עצביים יכולים להיות מאומץ עבור כל ביטוי גנים - או רקמות ספציפיות.

מבוא

ארגז הכלים גנטי על ביטוי גנים יישוב פותחה טוב דרוזופילה, שהופך אותו לאחד מערכות המודל הטוב ביותר לחקור את הפונקציה של גנים המעורבים במגוון רחב של תהליכים תאיים. מערכות ביטוי בינארי, כגון שמרים Gal4/UAS (רצף הפעלה נגד הזרם), אומצה תחילה על רקמות ספציפיות משפר השמנה וסדר -ג'ין misexpression מודל גנטי דרוזופילה ¹ (איור 1). מערכת זו הקל הפיתוח של מספר רב של טכניקות כגון ויסות זמן-מרחבי של ביטוי גנים, misexpression, נוקאאוט בקבוצות נבחרות של תאים כמו גם כמו אבלציה התא, התא סימון, עקיבה חיה של תאית ומולקולרית תהליכים בתוך העובר, רקמות, מעקב אחר שושלת היוחסין וניתוחים פסיפס במהלך הפיתוח. מספר של מערכת בינארית שעתוק, כגון חיידקי לקסה/לקסה_ניתוח המערכת (איור 1) ומערכת Neurospora Q-, הם כלים גנטיים רבי-עוצמה נמצאים כעת בשימוש נרחב דרוזופילה, בנוסף מערכת Gal4/UAS המקורי עבור ג'ין יישוב ביטוי^1,2,3.

כאן, אנו מציגים שיטה ליצירת מערכת ואמינים רקמות ספציפיות ביטוי בינארי בהחלת טכניקה לעריכת הגנום. הפיתוחים האחרונים בתחום הטכנולוגיה העריכה של הגנום CRISPR/Cas9 אפשרו הזדמנויות חסר תקדים לעריכת שינויים הגנום מכוונת במגוון רחב של אורגניזמים. מערכת CRISPR/Cas9 לעומת אחרים זמינים הגנום טכניקות עריכה, הוא זול, יעיל ואמין. טכנולוגיה זו משתמשת מרכיבי מערכת החיסון מסתגלת חיידקי: Cas9 endonuclease של סטרפטוקוקוס הפישחה ינפל תומימת יוצר הפסקה כפולה-סטרנד (DSB), של RNA מדריך chimeric (gRNA), אשר ידריך את Cas9 אל אתר מסוים הגנום עבור יישוב DSB⁴. התאים מכילים את מכונות כדי לתקן את DSB באמצעות מסלולים שונים. Non-הומולוגי סוף מצטרף (NHEJ) מוביל קטן שהתוספות או המחיקות כדי לשבש את תפקוד הגן, תוך תיקון מכוון הומולוגיה (HDR) מציג מוגדר ביים/רצוי גנומית ב/דפיקה-את מדהימה באמצעות תורם HDR אקסוגני כתבנית. האסטרטגיה מבוססת-HDR החלפת ביעילות יכול להיות מנוצל כדי ליצור מערכת ואמינים רקמות ספציפיות ביטוי בינארי, אשר ניתן להתגבר על כל המגבלות של השיטות מלכודת משפר מסורתיים. אנו מתארים הליך שלב אחר שלב של ניצול של HDR מבוססת על CRISPR/Cas9 תיקון ביצירת קו הנהג שעתוק בינארי מבוטא תחת השליטה של ויסות גנים ברמת השעתוק והתרגום post-transcriptional אנדוגני של דרוזופילה ג'ין. ב פרוטוקול זה, נדגים את הדור של קו מנהל התקן ספציפי עבור branchless (bnl) ג'ין קידוד החלבון של המשפחה FGF המווסת מורפוגנזה הסתעפות של אפיתל דרכי הנשימה והכו אותי⁵. בדוגמה זו, אקסון קידוד הראשון של הגן bnl הוחלף על ידי הרצף של רצף transactivator לקסה חיידקי מבלי לשנות כל אנדוגני cis-רצפים הרגולציה של הגן bnl . אנחנו מראים כי האסטרטגיה שנוצר קו נהג bnl-לקסה השולטת spatiotemporally את הביטוי של גנים כתב ממוקם במורד הזרם של LexAoperator (LexAop או LexO) bnl - באופן בלעדי הבעת אפיתל/mesenchymal/תאים עצביים.

פרוטוקול

1. עיצוב ובניית gRNA את הביטוי וקטור

1. להחלפת במדויק אזור זמן המוגדר אקסון, להשתמש gRNA כפול הגישה⁶, שבו כל gRNA במיוחד יעד שני הקצוות של האזור הנבחר של ריבית. כדי לקבל ביטוי גנים ספציפיים ייתכן מדויק של מנהל ההתקן, בחר שני אתרי היעד gRNA בתוך אקסון קידוד הראשון של הגן.
2. דרוזופילה melanogaster, בחר את האתרים gRNA היעד באמצעות הכלי אופטימלית היעד מאתר flyCRISPR (http://tools.flycrispr.molbio.wisc.edu/targetFinder/). כלי עיצוב הזמינים אחרים CRISPR ניתן להשתמש גם כן, כולל כלי אופטימיזציה העיצוב CRISPR (http://crispr.mit.edu), FlyCas9 (https://shigen.nig.ac.jp/fly/nigfly/cas9), ו- E-פריך (www.e-crisp.org/E-CRISP).
   הערה: הפרוטוקולים הבאים של עיצוב gRNA, שיבוט אומצה השיטות שתוארו^6,7.
   1. העתק את רצף בפועל לתוך תיבת סיפק בכלי מקוון. בחר לאחרונה דרוזופילה melanogaster הגנום ביאור הגירסה המסחרית, "r_6," בתפריט הנפתח עבור "בחר הגנום. ב- "מדריך בחר אורך השדה (nt)," קלט "20". בחר כדי למצוא את "כל CRISPR מטרות" ולחץ על "למצוא מטרות CRISPR".
   2. להעריך כל המטרות gRNA המועמד על-ידי הגדרת "מקסימום" עבור "לכתחילה" ו- "הגולה בלבד" עבור "פאם". נסו לבחור את האתרים gRNA ללא כל הנחה-המטרות הפוטנציאליות או מספר מינימלי של חופש-מטרות אפשרי. שימוש בכלי האינטרנט המתוארים Doench. et al. 2014 ⁸ לבחירת gRNAs עם ציון "טוב" פעילות פוטנציאליות.
   3. במקביל, ודא כי יש פולימורפיזם נוקלאוטיד יחיד אין המטרות gRNA הגנום של הקו לטוס ההורה שנבחר עבור הזרקה (למשל, nos-Cas9 על כרומוזום X, BL # 54591). לעקוב אחר הפרוטוקול המתואר גרץ. ואח 2015⁷ כדי לחלץ את ה-DNA גנומי מהקו לטוס האב. PCR להגביר, כ, 500-1000 nt האזורים באמצעות תחל מחזיתות את הרצף של עניין של אמינות גבוהה DNA פולימראז; רצף-לאמת את המוצרים PCR מוגבר.
3. עבור יצירת וקטור ביטוי gRNA טנדם, בצע עצמאית מצדו שיבוט פרוטוקול⁶ להציג שני רצפים protospacer לתוך pCFD4 RNA ביטוי וקטור. שימו לב כי וקטור ביטוי משופר מולטי-gRNA (pCFD5) זמין כעת שבו sgRNAs שניהם באים לידי ביטוי U6:3 חזקה היזמים⁹ (https://www.crisprflydesign.org). להשתמש בשיטה DNA הרכבה לשבט את gRNAs לתוך וקטור pCFD4.
   1. לעצב ולסדר את תחל ואחורה ידביקו שני רצפים protospacer pCFD4 וקטור ביטוי ה-RNA (טבלה 1 א). כפי שתואר קודם לכן⁶, פריימר לפנים מכיל את רצף protospacer הראשון ולצדו אזורים המתאימים יזם U6-1, gRNA הליבה ב- pCFD4; ומהצמיגים הפוכה מכיל את רצף משלים הפוך protospacer השני ולצדו אזורים המתאימים gRNA core ו- U6-3 יזם ב- pCDF4.
   2. Resuspend תחל כדי 100 μM עם DNase ונטולת RNase כפול מים מזוקקים (ddH₂O). להפוך 10 μM עבודה ריכוז פריימר. השתמש pCFD4 פלסמיד כתבנית ולהגדיר התגובה PCR באמצעות פולימראז של אמינות גבוהה ומומלץ הגדרות עבור ה-PCR תגובה⁶.
   3. לשבט את המוצר מוגבר לתוך pCFD4, לעכל pCFD4 פלסמיד עם אנזים BbsI על-ידי הגדרת את התגובה הבאה: 2 – 5 μg של פלסמיד pCFD4, 5 μL של 10 x מאגר עיכול, μL 1 של האנזים BbsI, ו- ddH₂O כדי להביא את עוצמת הקול הסופי 50 μL. מערבבים את תוכן התגובה על-ידי הקשה על הצינור ובעדינות איסוף את כל טיפות פזורים מהקיר של הצינור התחתון על ידי סיבוב קצר. דגירה המיקס התגובה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים.
   4. להפעיל את המוצר PCR שלב 2 ואת המוצר מתעכל משלב 3 ב- 1% agarose ג'ל. לבצע את אלקטרופורזה זמן מספיק להפריד לגמרי הלהקות הדנ א. את החלק הנכון בגודל DNA להקות תחת הטרנס-המאייר UV לפני טיהור המוצרים הצפוי באמצעות ג'ל עמודה • תנאי בעקבות ההוראה של היצרן (ראה טבלה של חומרים). המוצר PCR צריך להיות 600 bp, ואת את פלסמיד pCFD4 ליניארית צריך להיות kb ~6.4 ⁶.
   5. להגדיר את התגובה הרכבה DNA בשפופרת PCR, לפי הוראות היצרן (ראה טבלה של חומרים).
   6. להפוך את μL 2 של המוצר הרכבה המוסמכת חיידקים (DH5α או זנים דומה עם ΔrecA1, ΔendA1), צלחת לוקחת אמפיצילין (100 μg/mL) המכיל פלטות אגר ליברות (LB/כח), דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. שימו לב: לערבב מכלול ה-DNA עשוי להיות רעיל זני חיידקים מסוימים, אבל דילול המיקס האסיפה יכולה להפחית הרעילות.
   7. לקחת 3-4 מושבות עמידים אמפיצילין מהצלחת מודגרות לילה, לחסן את המושבה ב- 3 מ ל LB המכיל אמפיצילין μg/mL 100, לגדול חיידקים חוסנו ב שייקר 37 º C למשך הלילה. לחלץ פלסמיד החיידק תרבותי בין לילה באמצעות ערכת הכנה מיני פלסמיד בעקבות ההוראה של היצרן (ראה טבלה של חומרים).
   8. רצף של פלסמידים עם T3 פריימר אוניברסלי עבור שיבוטים הנכון המכיל את הכניסה gRNA טנדם מסך. ליצור גליצרול מלאי של חיידקים טרנספורמציה עם תבדוק-רצף pCFD4-gRNA ב- 20% גליצרול וחנות במקפיא-80 ° C לשימוש עתידי.

2. עיצוב ובניית התורם HDR

1. גנומית טוק-אין של רצף Gal4 או לקסה , עיצוב תורם HDR כפול גדילי המכיל את רצף transactivator ולצדו שתי זרועות הומולוגיה.
   1. שימוש > 1.5 kb עזב, זרועות הומולוגיה נכון איגוף הפגיעה המכוונת gRNA האתר. הומולוגיה המורחבת זרועות להגביר את היעילות של HDR במהלך תהליך תיקון ¹⁰.
   2. PCR להגביר את הזרועות הומולוגיה מהדנ גנומית (gDNA) שחולצו מן השורה לטוס האב שנבחר עבור הזרקה (למשל, nos-Cas9 (על כרומוזום X), BL # 54591). השתמש הגהת חם-start Taq-DNA פולימראז אנזים מתאים זמן PCR הרחבה (ראה טבלה של חומרים). רצף-לאמת.
2. כדי להימנע retargeting של gRNA על מיקומה מהונדסים, עיצוב התורם החלפת בצורה כזאת, כי האתרים זיהוי gRNA הם מובסים על רצף אקסוגניים הציג.
   הערה: כדי למנוע שינוי הרכיבים בשם cis-רגולציה, תמיד בחר את האתרים זיהוי gRNA בתוך אזור אקסון קידוד.
3. עבור הפקת קלטת חלופי, לתכנן את האסטרטגיה הרכבה דנ א כדי לאחד ארבעה מקטעים: הזרועות הומולוגיה 5' ו 3', רצף הדנ א transactivator אקסוגני האמצעי, השיבוט ליניארית וקטור עמוד השדרה (למשל, pUC19 או אחר נפוץ שיבוט וקטורים). בעקבות מנחה של היצרן עבור הרכבה דנ א (ראה טבלה של חומרים), לעצב את צבעי יסוד מתאים PCR הגברה והרכבה של כל אחד מהמקטעים. Resuspend תחל כדי 100 μM עם ddH₂O. להפוך 10 μM עבודה ריכוז פריימר. השתמש פולימראז באיכות גבוהה עבור כל התגובות PCR. לפי התקנון שלהלן:
   1. PCR להגביר את קלטת ביטוי Gal4 או לקסה של וקטור זמין (למשל, nls-LexA:p65; פלסמידים הביטוי האידיאלי Gal4/לקסה/QF2 ניתן למצוא, המתקבל משאבים משותפים כגון Addgene) באמצעות תחל המופיעים בטבלה 1B.
      1. כדי לשמור את כל המקורי גנים ברמת השעתוק והתרגום post-transcriptional התקנות של אקסון הוחלף על הביטוי של רצף הדנ א transactivator, לעצב את הקלטת בצורה כזאת, כי אלל גנומית הערוך מביעים של mRNA chimeric של transactivator, את הגן. משמרות סוף אקסון יישוב כדי לשמור על כל אות splicing 5' ו 3'.
      2. לשלב T2A רצף פפטיד עצמית שהפריד בין השארית 5' קידוד אקסון ואת הרצף transactivator כדי למנוע תרגום חלבון chimeric. הוסף codon עצירה של תרגום אחרי רצף אקסוגניים transactivator (איור 5).
   2. PCR להגביר את הזרועות הומולוגיה מהדנ גנומית (gDNA) שחולצו מן השורה לטוס האב שנבחר עבור הזרקה (למשל, nos-Cas9 (על כרומוזום X), BL # 54591) באמצעות תחל את המופיעים בטבלה 1B. השתמש פולימראז באיכות גבוהה עבור כל התגובות PCR באמצעות המערכות כדלקמן: 5 μL של 5 x תגובת מאגר, 0.5 μL של dNTPs 10 מ"מ, 1.25 μL של 10 μM פריימר לפנים, μL 1.25 של 10 μM הפוך פריימר, 0.5 μL של תבנית ה-DNA, 0.25 μL של אמינות גבוהה DNA פולימראז , ΜL 16.25 ddH₂O.
   3. השתמש ליניארית שיבוט וקטור כגון pUC19. מספר התורמים וקטורים זמינים כעת. ראה רשימה מקיפה-אתר האינטרנט-http://flycrispr.molbio.wisc.edu הבאים.
   4. להפעיל את המוצרים PCR על ג'ל agarose 1%. לבצע את אלקטרופורזה מספיק זמן להבטיח הפרדה ברורה של הלהקה הרצוי של הלהקות לא ספציפית רצויה (אם בכלל). ג'ל-לטהר שברי DNA הצפוי. למדוד את הריכוז של כל שבר DNA מטוהרים באמצעות ספקטרופוטומטרים.
   5. להגדיר את התגובה הרכבה DNA בעקבות ההוראה של היצרן. לערבב ליניארית שיבוט וקטור והיעד שברי מ שלב 3, שלב 4, התגובה הבאה: 1 μL של ליניארי שיבוט וקטור (50 ng/μL), 2-3 עודף הקיפול של כל שבר היעד, 10 μL של 2 x מיקס מאסטר הרכבה דנ א, להביא שעוצמת התגובה האחרונה μL 20 עם ddH < c21 > 2או Incubate המיקס התגובה למשך שעה ב 50 º C.
   6. להפוך את μL 2 של המוצר הרכבה חיידקים המוסמכת, צלחת על פלטות אגר ליברות/מגבר המכיל אמפיצילין μg/mL 100. בנוסף, להוסיף X-גל + IPTG בצלחת להקרנה כחול/לבן.
   7. לקחת 3-4 לבן מושבות מהצלחת מודגרות לילה, לחסן את המושבה ב- 3 מ ל LB המכיל אמפיצילין μg/mL 100, לגדול ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה ב שייקר. במדריך של תמצית פלסמיד מהבקטריות תרבותי בין לילה באמצעות ערכת הכנה מיני פלסמיד בעקבות היצרן (ראה טבלה של חומרים).
   8. מסך המושבה חיובי על ידי עיכול PCR או הגבלה.
   9. רצף לאמת האזור התורם HDR של פלסמיד הסופי. שמירת מלאי חיידקי טרנספורמציה הנכון שיבוטים גליצרול 20% ב- 80 ° C עבור חיסון לעתיד.

3. העובר הזרקה, גנטיקה לעוף, הקרנה לעריכה הגנום

1. להכין הגבוה טוהר gRNA נטולת אנדוטוקסין ביטוי וקטור, כמו גם את פלסמיד התורם HDR באמצעות maxiprep של פלסמיד קיט (ראה טבלה של חומרים).
2. שיתוף להזריק את פלסמיד ביטוי gRNA (100 ng/μL), התורם חלופי (500 ng/μL) לתוך germline של עוברי nos-Cas9 ⁶. הערה: אנו משתמשים שירות מסחרי להזרקה, אך ניתן לבצע הליך זה גם במעבדה.
3. לטוס גנטיקה ההקרנה (איור 2 , איור 3):
   1. כאשר מוזרק העוברים המתפתחים להיות מבוגרים, לחצות כל יחיד G₀ טסה שאיזון זבובים. בחר מאזן מתאים עבור כרומוזום המכיל אלל יישוב.
   2. עזים ומתנגד של F1 צאצאים של כל G0 לחצות על משטח₂ CO, נבחר באקראי 10-20 גברים תחת stereomicroscope. לחצות אותם בנפרד אל הנקבות שאיזון כמוצג באיור3.
   3. כאשר הפתח הזחלים F2, בחר האב F1 יחיד מהצלב כל ולחלץ את gDNA באמצעות אחד לטוס גנומית DNA הכנה פרוטוקול:
      1. הכנת מאגר החילוץ gDNA: 10 מ מ טריס-Cl pH 8.2, 1 מ"מ EDTA, 25 מ מ NaCl, לשמור בטמפרטורת החדר. להכין 20 מ"ג/מ"ל פתרון מניות Proteinase K ולאחסן במקרר.
      2. מכניסים כל זבוב צינור מיקרו-צנטריפוגה 1.5 mL ויסמנו את הצינור. לשמור במקפיא-80 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
      3. הכנת אמצעי העבודה טריים gDNA החילוץ מאגר המכיל 200 µg/mL הריכוז הסופי של ק' Proteinase
         הערה: אין להשתמש מאגר הישן לצעד הזה.
      4. למחוץ כל זבוב עבור s 10 – 15 עם טיפ פיפטה המכיל 50 μL של מחיצות מאגר ללא מחלק את הנוזל. לוותר על המאגר הנותרים לתוך הצינור ומערבבים היטב. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 20-30 דקות.
      5. לשים צינורות בבלוק חום 95 מעלות צלזיוס למשך 1-2 דקות להשבית את ק' Proteinase
      6. ספין למטה במשך 5 דקות ב x 10,000 ג'י. לאחסן את התכשיר 4 ° C לצורך ניתוח נוסף PCR.
4. להשתמש באותה השיטה כדי להכין gDNA מחבצלת nos-Cas9 , אשר משמש פקד שלילי. לבצע שלושה שלבים מסכי ה-PCR מבוסס כדי לזהות את הנכונות "מסתיימת החוצה" HDR (איור 2, איור 5) באמצעות gDNA של כל זכר F1 כמו תבנית⁵. השתמש μL 1 של ההכנות DNA במערכת ה-PCR התגובה הבאה: μL 10 של 2 x מיקס מאסטר PCR עם צבע, μL 1 של כל פריימר (10 μM), μL 1 של תבנית ה-DNA, 7 μL של ddH₂O.
5. כפי שמוצג באיור 5A, לבצע PCR באמצעות תחל fwd1 rev1 למסך את עצם קיומו של ההכנסה או החלפת; לבצע PCR באמצעות תחל fwd2 ו- rev2 כדי לוודא את ההכנסה או החלפת מאזור 3'; לבצע PCR באמצעות תחל M13F ו- rev3 כדי לבדוק "מסתיים-ב" HDR (טבלה 1C).
6. לשמור על הקווים לטוס עם HDR אישר הקצוות-אאוט ולהקים מניות מאוזנת בני הדור F2. Outcross הזבוב העומס שוב כדי להסיר כל מוטציות לא מכוונות על כרומוזום אחרים.
7. להכין gDNA באיכות גבוהה מן המניות הוקמה עבור הגברה PCR ארוך (> 800-1000 nt) אמפליקון עם אמינות גבוהה. אנזימים, באופן מלא רצף לאמת את amplicons המתקבל האזורים גנומית מהונדסים. לחלופין, השתמש gDNA גולמי תמצית כמתואר קודם לכן כדי להגביר קצר יותר (< 800 nt), חופפים PCR מוצרים לאימות רצף הגנום הערוך. השתמש בפרוטוקול הבא להכין באיכות טובה דרוזופילה דנ א גנומי:
   1. לשים על הזבוב הבוגר 25 1.5 mL microcentrifuge צינור, ומקפיאים במקפיא-20 ° C או -80 ° C למשך לפחות שעה.
   2. להוסיף 250 μL של פתרון A (pH 9.0 טריס HCl 0.1 M, EDTA 0.1 M, למען חברה דמוקרטית 1%).
   3. Homogenize זבובים באמצעות בקווקז homogenizing את צינורות microcentrifuge והניח את הצינורית על קרח.
   4. דגירה-70 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
   5. הוספת 35 μL של KOAc (5 מ'), לנער, לערבב היטב, אבל לא מערבולת.
   6. דגירה על קרח למשך 30 דקות.
   7. ספין-x 12,000 g למשך 15 דקות.
   8. עם micropipette 1 מ"ל, בזהירות להעביר רק את תגובת שיקוע ברור צינור חדש, עוזב חזרה כל המשקע או לאטמוספרה.
   9. להוסיף 150 μL של אלכוהול איזופרופיל תגובת שיקוע. מערבבים בעדינות על-ידי היפוך.
   10. ספין-x 10,000 g עבור 5 דקות.
   11. בזהירות להסיר את תגובת שיקוע ולהשאיר בגדר בצינור.
   12. לשטוף את גלולה עם 1 מ ל 70% EtOH.
   13. ספין-x 12,000 g עבור 5 דקות.
   14. הסר את תגובת שיקוע. האוויר יבש בגדר למשך 15-20 דקות. לא מעל יבשה בגדר.
   15. להמיס בגדר ב 100 μL של ddH₂O.
   16. השתמש דיוק גבוה DNA פולימראז מתאים אמפליקון ארוך (> 800 bp) כדי להגביר את האזור הערוך השלם. באופן אידיאלי, לקחת שני צבעי יסוד מחוץ בקלטת שנוספו כדי להגביר את האזור גנומית. ג'ל לטהר את המוצר PCR, כפי שהוסבר קודם, רצף לאמת את המוצר עם תחל חופפים מרובים.
8. לאמת את דפוסי ביטוי ייתכן הנכון מעוברים ביתור רקמות/הקווים לטוס מהונדסים:
   1. לבצע RT-PCR מ הרנ א הכולל כדי לאמת את הביטוי של המוצר mRNA היברידית (1D טבלה).
   2. ביצוע של הכלאה בחיי עיר של המוצר mRNA של הריבית ב הרקמות/העובר זחל כדי לאמת את הביטוי.
   3. למסך עבור דפוסי ביטוי ייתכן מדויק של רקמות ספציפיות בין השורות הקצוות-אאוט תבדוק-רצף, צלב לכל הקווים הערוך שהושג עבור מנהל ההתקן ביטוי בינארי עם LexO- GFP או LexO- RFP (עבור לקסה נהג) קו (זמין ממרכזי מניות בלומינגטון) ולבחון את לקסה או Gal4 מונע כתב-גנים ברקמות העובר, זחל, מבוגר מתחת למיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית.

תוצאות

פרוטוקול זה שימש בהצלחה כדי ליצור ביטוי בינארי יישוב כתב מערכת ספציפי עבור bnl לבטא תאים⁵. Cis-אלמנטים רגולטוריות (קרס) כי ייתכן מורכבים bnl הביטוי שליטה לא מאופיינים. לכן, כדי להשיג ביטוי ייתכן תחת השליטה של רצף רגולטורי אנדוגני bnl , רק אקסון קידוד הראשון של bnl נועד להיות מוחלף עם רצף transactivator לקסה חיידקי. נבחר של קלטת משופרת nls-LexA::p65 ידוע לספק מיטביים ביטוי דרוזופילה .

דיון

באופן מסורתי, מלכודות משפר דרוזופילה נוצרו על ידי שתי שיטות שונות. אחת הדרכים כולל הכניסה אקראי של מנהל התקן (למשל., Gal4) רצף הגנום על ידי טרנספוזיציה (למשל., P-אלמנט טרנספוזיציה)¹ . לחלופין, ניתן להציב את רצפי הנהג תחת שליטה תעתיק של אזור משפר בשם/יזם בונה פלסמיד, אשר אז ניתן לשלב אתר חוץ רחמי של גנום^3,11. למרות ששיטות אלה יצרו בריכה גדולה של Gal4 או מלכודות משפר לקסה עבור דרוזופילה, ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
X-Gal/IPTG	Gentrox (Genesee Scientific)	18-218	שיבוט
LB-Agar	BD Difco	BD  244520	שיבוט
Tris-HCl	Sigma Aldrich	T3253	ביולוגיה מולקולרית
EDTA	Sigma Aldrich	E1161	ביולוגיה מולקולרית
NaCl	Sigma Aldrich	S7653	ביולוגיה מולקולרית
UltraPure DNase/RNase מים ללא	ThermoFisher Scientific	10977-023	ביולוגיה מולקולרית
10% SDS	סיגמא אולדריץ'	71736	ביולוגיה מולקולרית
KOAc	Fisher-Scientific	P1190	ביולוגיה מולקולרית
EtOH	Fisher-Scientific	04-355-451	ביולוגיה מולקולרית
GeneJET Miniprep	ThermoFisher Scientific	K0503	Miniprep
PureLink HiPure Plasmid Maxipep ערכות	ThermoFisher Scientific	K210006	Maxiprep
BbsI	NEB	R0539S	של אנזים הגבלה
	IDT-DNA		PCR
pCFD4	מעבדת		תבנית DNA ווקטור עבור gRNA
KAPA HiFi Hot Start- (Kapa Biosystems)	Kapa biosystems	KK2601	PCR
Q5-נאמנות גבוהה Taq	NEB	NEB #M0491	PCR
Gibson Assembly Master Mix	NEB	NEB #E2611	הרכבת DNA
pBPnlsLexA:p65Uw	Addgene		להגברת LexA
Proteinase K	ThermoFisher Scientific	25530049	ביולוגיה מולקולרית
2x PCR PreMix, עם צבע (אדום)	Sydlab	MB067-EQ2R	ג'ל לביולוגיה מולקולרית
	Zymo Research (Genesee Scientific)	11-300	מגיב
	TRI לביולוגיה מולקולריתערכות טיהור RNA של Sigma-Aldrich
Direct-zol	Zymo Research (Genesee Scientific)	11-330	ביולוגיה מולקולרית
OneTaq ערכת RT-PCR חד-שלבית	NEB	E5315S	ביולוגיה מולקולרית
lexO-CherryCAAX	Kornberg Lab		קו זבוב
UAS-CD8:GFP	מעבדת		קו זבוב
btl-Gal4	Kornberg lab		line
MKRS/TB6B	מעבדת		קו זבוב
מיקרוסקופ קונפוקלי SP5X	Leica		דפוס ביטוי הדמיה
CO2 station	Genesee Scientific	59-122WCU	זבוב דוחף
מיקרוסקופ סטריאו	אולימפוס	SZ-61	זבוב דוחף
עליים הומוגניזציה של מיקרו-צינורות	פישר-סיינטיפיק	03-421-217	בידוד DNA גנומי
ספקטרופוטומטר	NanoDrop ThermoFisher Scientific	ND-1000	כימות DNA