הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

כרומטין Immunoprecipitation Assay לזיהוי NFAT2 הרומן גנים היעד בלוקמיה לימפוציטית כרונית

7.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/58270

⸱

4 בדצמבר 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Dept. of Hematology, Oncology and Immunology, University of Tübingen, 2Dept. of Endocrinology, Diabetology, Clinical Pathology and Metabolism, University of Tübingen

במאמר זה

סיכום

לוקמיה לימפוציטית כרונית (CLL) הוא הלוקמיה הנפוץ ביותר בעולם המערבי. גורמי שעתוק NFAT הן הרגולטורים חשוב של פיתוח והפעלה סוגי תאים רבים. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול לשימוש של כרומטין immunoprecipitation (ChIP) בתאי CLL אדם לזיהוי גנים היעד הרומן של NFAT2.

תקציר

לוקמיה לימפוציטית כרונית (CLL) מאופיין על-ידי ההרחבה של תא B ממאיר שיבוטים ומייצג הלוקמיה הנפוץ במדינות המערב. רוב החולים CLL הצג מסלול indolent של המחלה, כמו גם של פנוטיפ anergic של תאים לוקמיה שלהם, בהתייחסו קולטן תא B להגיב גירויים חיצוניים. אנחנו לאחרונה הראו כי הגורם שעתוק NFAT2 מווסת מכריע של anergy ב- CLL. האתגר העיקרי בניתוח של התפקיד של פקטור שעתוק במחלות שונות הוא הזיהוי של הגנים שלו ביעד מסוים. זה משמעות רבה עבור הבהרה של מנגנונים pathogenetic והתערבויות טיפוליות אפשריות. כרומטין immunoprecipitation (ChIP) היא טכניקה קלאסית להפגין אינטראקציות חלבון-DNA ו, לכן, ניתן להשתמש לזיהוי גנים היעד הישיר של גורמי שעתוק בתאי יונקים. כאן, שבב שימש כדי לזהות LCK גן היעד הישיר של NFAT2 בתאי CLL אדם. ה-DNA, חלבונים הקשורים תפור באמצעות פורמלין, לאחר מכן לכסנתם על ידי sonication לחלקים הדנ א של 200-500 בסיסי זוגות (bp). שברי DNA צולבים המשויך NFAT2 נארזים בצורה סלקטיבית immunoprecipitated של שאריות תאים באמצעות נוגדן αNFAT2. לאחר טיהור, שברי DNA המשויך מזוהים באמצעות PCR כמותי בזמן אמת (לרביעיית-PCR). רצפי DNA עם העשרה ניכר מייצגים אזורים בגנום אשר מיועדים על-ידי NFAT2 ויוו. ההטיה המתאימה של ה-DNA, הבחירה של הנוגדן נדרש מכריעים במיוחד עבור היישום המוצלח של שיטה זו. פרוטוקול זה הינו אידיאלי עבור ההדגמה של אינטראקציות ישיר של NFAT2 עם גנים היעד. הגבלה העיקרי שלה הוא הקושי להעסיק. את השבב של מבחני בקנה מידה גדול לנתח את הגנים היעד של מספר גורמי שעתוק אורגניזמים שלמים.

מבוא

לוקמיה לימפוציטית כרונית (CLL) מייצג הלוקמיה הנפוץ ביותר אצל מבוגרים במדינות המערב, מפגין ברורים הצטברות CD19 CD23, CD5 לבטא בוגרת B תאים1. רוב המטופלים התערוכה קורס מחלת indolent, אשר לא מחייבים טיפול מיוחד במשך שנים רבות. לעומת זאת, חלק מהחולים מראים התקדמות מהירה המחייבים התערבויות טיפוליות מיידית עם החיסון-כימותרפיה או טיפולים ממוקדים אחרים,2,3. גרעיני גורם של תאי T מופעל (NFAT) היא משפחה של גורמי שעתוק השליטה התפתחותיים שונים ותהליכים הפעלה5,4,סוגי תאים רבים6. אנחנו לאחרונה הפגינו ביטוי והפעלה החוקתי של NFAT2 בתאי CLL מחולים עם מחלת indolent7. . כאן, זה מסדיר מצב לא להגיב כדי גירוי קולטן תא B נקרא anergy7. כדי להדגים NFAT2 נקשר חלבון ספציפי לימפוציט טירוזין קינאז (מזל) האמרגן ומסדיר LCK ביטוי בתאי CLL אדם, וזמינותו immunoprecipitation כרומטין ספציפי (ChIP) פיתח, המועסקים.

השבב הוא אחד מספר טכניקות כדי לחקור את התפקיד של גורמי שעתוק גנים ביטוי8. ביטוי גנים הוא הדוק בניצוחו בצורה מאוד מורכב הרגולטורים מספר עם גורמי שעתוק לוקח תפקיד מיוחד במינו זה תהליך9,10,11,12. זוהו גורמי שעתוק ויסות בביטוי הגן בהקשר יכולות רבות מינים (למשל, עבור פיתוח ובידול)13,14,15, 16,17,18. שגיאות במנגנוני הבקרה מורכבים המערבים גורמי שעתוק יכול להוביל מגוון תהליכים פיפטות כולל סרטן19,20. לפיכך, זיהוי גורמי שעתוק, המטרות המתאימות שלהם עשויים להציע הרומן השדרות טיפולית21,22. כדי לחקור את שדה מסקרן זה מספר שיטות זמינים כמו שבב, ניידות electrophoretic assay shift (EMSA), מבחני נפתחים דנ א שונים כתב-מבחני8,11,12, 23 , 24.

כדי להדגים כי גורם שעתוק מסוימים אינטראקציה עם אזורים ספציפיים בגנום ויוו, השבב הוא טכניקה אידיאלית25. למטרה זו, ה-DNA, חלבונים הקשורים בתאים חיים הם קישורים צולבים באמצעות הקרנת UV או פורמלין (שבב צולבים, XChIP). שלב זה מושמט להשיג DNA יותר ושחזור חלבון כביכול יליד שבב (NChIP)26. מתחמי ה-DNA-חלבון מוטים לאחר מכן על ידי sonication לחלקים של 200-500 בסיסים (bp) immunoprecipitated תא הלבלב באמצעות של נוגדנים ספציפיים נגד גורם שעתוק עניין. שברי DNA המשויך מכן מטוהרים, המאופיינת PCR שיבוט מולקולרי, רצף. טכניקות חלופיות להשתמש מיקרו-מערכים (שבב על שבב) או רצף הדור הבא (צ'יפ-Seq) כדי לנתח את immunoprecipitated ה-DNA.

שבב הוצג לראשונה על ידי גילמור, ליס ב-1984 כאשר הם בשימוש UV אור כדי covalently קישור DNA וכרוך בכריכת חלבונים חיים חיידקים27. בעת פירוק התא, immunoprecipitation של חיידקי RNA פולימראז, הגששים ספציפי של גנים ידועים שימשו כדי למפות את התפלגות ויוו ואת צפיפות של RNA פולימראז. השיטה שימש לאחר מכן על ידי החוקרים אותו כדי לנתח את חלוקת האיקריוטים RNA פולימראז II על חום הלם חלבון גנים דרוזופילה28. וזמינותו XChIP היה מעודן יותר מאת ורשבסקי ועמיתים הנפוץ פורמלדהיד cross-linking ללמוד השיוך של היסטון H4 חום הלם חלבון גנים29,30. הגישה NChIP, אשר נושאת את היתרון של החלמה טובה יותר DNA וחלבון עקב epitopes באופן טבעי ללא פגע, לכן, להגדיר נוגדן, תוארה לראשונה על ידי Hebbes ועמיתיו בשנת 198831.

היתרון של שבב לעומת טכניקות אחרות לניתוח אינטראקציות חלבון-דנ א היא, למעשה, האינטראקציה בפועל של פקטור שעתוק ניתן ובדוקים ויוו טראקיס או מלאכותי שנוצר על-ידי אנשים רגילים או ג'לים התנאים מועסק8,11,12. על ידי שילוב שבב עם הדור הבא רצפי, מטרות מרובות ניתן לזהות בו זמנית.

מגבלות הגדולות של טכניקה זו הם שלה תחולה מוגבלת כדי מבחני בקנה מידה גדול אורגניזמים שלמים25. ניתוח דפוסי ביטוי גנים דיפרנציאלי יכול להיות גם מאתגר באמצעות טכניקות צ'יפ אם החלבונים בהתאמה באים לידי ביטוי רק ברמות נמוכות או תוך זמן קצר של windows. עוד פוטנציאל מגביל הוא הזמינות של נוגדן המתאים עבור השבב11.

פרוטוקול שבב המובאת כאן יכול להיות מועסק לצורך זיהוי ויוו של היעד גנים של פקטור שעתוק מאת PCR כמותי בזמן אמת (לרביעיית-PCR). באופן ספציפי, המטרה היא לזהות היעד הרומן גנים של NFAT2 ב CLL. שבב נבחר בגלל הפוטנציאל להדגים ישירות את הכריכה של NFAT2 אל מחוזות מקדם מטרה שונים גנים בתנאים טבעיים בתאי החולה CLL אדם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הניסויים שנערכו עם חומר אנושי אושרו על ידי ועדת האתיקה של אוניברסיטת טיבינגן, ממנו כל המטופלים אשר תרמו דגימות מחקר זה הושג בכתב הסכמה מדעת.

1. בידוד ותאי גירוי של Jurkat

הערה: כדי למטב את הפרוטוקול, השתמש בשורת תא Jurkat אשר ידוע לבטא רמות גבוהות של NFAT2. כל הצעדים מבוצעים תחת תא למינארי.

  1. להכין 50 מ של RPMI 1640 בתוספת 10% FCS ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין מאת מהרהרת היא 37 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים.
  2. תרבות Jurkat תאים עבור 1-2 d בבקבוקון התרבות התא-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 ב- 20 מ של RPMI 1640 בתוספת 10% FCS ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין על צפיפות של 2 x 106 תאים למ"ל (תאים ייספרו עם Trypan כתמים כחולים ו- a תא נויבאואר תחת המיקרוסקופ) ולמסוק בהם על ידי צריך שתוציאו בשביל 5 דקות ב x 200 גרם.
  3. הסר את תגובת שיקוע עם פיפטה ולאחר resuspend התאים 10 מ"ל של RPMI 1640 בתוספת 10% FCS ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין. לאחר מכן, לספור את התאים לבין קונבנציונלי trypan blue של צביעת תא נויבאואר מתחת למיקרוסקופ.
  4. Centrifuge התאים מהשלב 1.3 עבור 5 דקות ב x 200 גרם ולהסיר את תגובת שיקוע על ידי השאיפה. לאחר מכן, resuspend את התאים על צפיפות של 2 x 107 תאים למ"ל בשנת 1640 RPMI בתוספת 10% FCS, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, העברת מ 1 ל צינור קונבנציונאלי מ ל pipetting.
  5. לגרות את התאים על-ידי הוספת 32.4 nM phorbol פעילים-12 13-אצטט (PMA) ionomycin 1 מיקרומטר. ואז דגירה את התאים עבור h 16-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 עם המכסה של הצינור נפתח (כדי למנוע זיהום, סרט איטום חדיר לאוויר יכול לשמש).

2. בידוד וגירוי של תאים CLL העיקרי מחולים אנושי

הערה: החולה היו רכשה ודוגמאות מגורה כפי שתואר לעיל7. כל הצעדים מבוצעים תחת תא למינארי.

  1. להכין את הציוד הנדרש דם מחולים וכדי לבצע הפרדה הדרגתיות צפיפות: 21-G מחטים, עורקים, NH4-הפרין-דם אוסף מזרקים (למשל, S-monovettes), 1 x PBS, צפיפות בינונית הדרגתי (צפיפות 1.077 g/mL) .
  2. על venipuncture, לקחת הדם מחולים CLL (ca. 40 מ"ל דם לחולה) לתוך תארגן את הדברים. ואז להעביר את הדם צינורות חרוט 50 מ. רוחצים את המזרק עם 10 מ"ל PBS את מאגר הדם-PBS-התליה צינורות 50 מ ל (לכוונן את מספר צינורות לנפח של דם).
  3. להכין 15 מ"ל של המדיום הדרגתיות צפיפות צינור חרוטי מ"ל. לאחר מכן, שכבת 35 מ של הדם-PBS-התליה בקפידה על המדיום הדרגתיות צפיפות. לענין זה, להחזיק את הצינור ב זווית שטוחה, לאט pipette הדם-PBS-התליה הקיר התחתון של צינור חרוטי 50 מ. כפי יותר של הדם-PBS-ההשעיה היא צבירת בצינור חרוט 50 מ ל, להגדיל את הזווית של הצינור עד זווית ישרה. חזור על שלב זה על פי נפח הדם-PBS-התליה.
  4. לבצע צנטריפוגה ב x 560 גרם במשך 20 דקות (ללא בלם), ולאחר מכן לחלץ את שלב התא תאי אשר מכיל תאי תאי הדם ההיקפיים (PBMCs). כדי לעשות זאת, לאסוף את לאטמוספרה לבן ההפרדה הדרגתיות צפיפות עם פיפטה סרולוגית 5 מ ל להעביר אותו צינור חרוטי 50 מ.
  5. למלא התא-התליה עד 50 מ"ל PBS, צנטריפוגה למשך 5 דקות ב x 360 גר'. הסר את תגובת שיקוע על ידי השאיפה. חזור על שלב זה עם צנטריפוגה עבור 5 דקות ב x 275 גרם. לאחר מכן, בריכת התאים של מטופל אחד ב- 5-10 מ של PBS צינור חרוטי 50 מ.
  6. לספור את התאים כמתואר ב- 1.3.
    הערה: זה תלוי הפרופורציה של תאים CLL PBMCs מבודדים, אם התאים יכול לשמש ישירות עבור הליך זה או בידוד תא B צריך להתנהל, למשל, באמצעות תא מגנטי מיון (מקינטוש). הבידוד תא B מומלץ אבל יכול להיות מושמט אם היחס של תאים CLL היא מעל 95% של סך לימפוציטים (שנקבע באמצעות cytometry זרימה). דם של CLL מטופלים קבועים, lysed על פי הוראות היצרן. לאחר מכן מכתים עם נוגדנים CD19-FITC ו- CD5-PE תתבצע בהתאם להוראות היצרן, התאים הם ניתחו ויה cytometry זרימה. מטופל למופת אחד מוצג באיור 1, שבו היחס של תאים CLL הוא 89.03%. לפיכך, בידוד תא B יש לבצע אצל החולה הזאת. חלקם של תאי B פיזיולוגיים הוא זניח (3.72 צד % בדוגמה).
  7. לשטוף את התאים עם 10 מ"ל של טרום ומחוממת (37 ° C) RPMI 1640 שיושלם עם FCS 10%, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, חומצות אמינו שאינן הכרחיות 100 מ מ, פירובט נתרן 1 מ מ, 50 מ מ β-mercaptoethanol עבור 5 דקות ב 200 x גרם ולהסיר את תגובת שיקוע על ידי השאיפה.
  8. התאם את התאים כדי 2 x 107 תאים למ"ל בשנת 1640 RPMI בתוספת 10% FCS, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, חומצות אמינו שאינן הכרחיות 100 מ מ, 1 מ מ נתרן פירובט ו-50 מ"מ β-mercaptoethanol (37 מעלות צלזיוס), מילוי 1 מ"ל של התליה תא לתוך צינור 5 מ.
    הערה: ß-mercaptoethanol הוא מועסק כדי לנטרל סטרס חמצוני.
  9. לגרות את התאים על-ידי הוספת 32.4 nM PMA ו ionomycin 1 מיקרומטר. ואז דגירה את התאים עבור h 16-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 עם המכסה של הצינור נפתח (כדי למנוע זיהום, סרט איטום חדיר לאוויר יכול לשמש).
    הערה: כדי להפחית את רמת הסטרס התאים יכולים להיות נחנו h 1-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 בחממה לפני ה 16 של גירוי.

3. קיבוע, פירוק תאים וכרומטין הטיה

הערה: דגימות החולה ותאים Jurkat קבוע, lysed עם ערכת השבבים זמינים מסחרית על פי הוראות היצרן עם שינויים כפי שתואר לעיל7. הקיבעון מתבצע תחת תא למינארי.

  1. היכונו צינור 1.5 מ עם 1 מ"ל של 37% פורמלדהיד, צינור 1.5 מ עם 1 מ"ל של 1.25 מ' גליצין, שפופרת 5 מ עם 4 מ של 1 x PBS קופסה עם קרח הקיבעון של התאים.
  2. לאחר גירוי של התאים עבור זמן הדגירה בהתאמה בשלב 1.5 או 2.9, לסובב את הצינורות 5 מ"ל ב x 200 גרם במשך 5 דקות, resuspend תאי µL 500 ל- PBS את החצוצרות שלה מ.
  3. הוסף מיקרומטר 340 פורמלדהיד (13.5 µL של 37% פורמלדהיד) לתאים. לאחר ערבוב קצר על ידי בקפידה pipetting למעלה ולמטה דגירה המתלה למשך 2.5 דקות (תאי Jurkat) או 5 דקות (החולה מדגם) בטמפרטורת החדר.
    הערה: קיבוע ממושך זמן נדרש עבור ראשי תאים להבטיח הטיה אופטימלית.
  4. להוסיף 125 מילימטר גליצין (57 µL של 1.25 מ' גליצין) לעצור את הקיבעון של תקופת דגירה של עוד 5 דק את התאים על קרח מייד לאחריו, צנטריפוגה ב 500 x g למשך 5 דקות ב 4 º C. הסר את תגובת שיקוע על ידי השאיפה.
  5. לשטוף את התאים פעמיים עם 1 מ"ל של PBS קר כקרח ב x 200 גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C ולהסיר את תגובת שיקוע בכל פעם על ידי השאיפה.
    הערה: לאחר הקיבעון, הפרוטוקול ניתן להשהות. תאים קבוע צריך להיות מאוחסן ב- 80 ° c כדי לבדוק, אם epitope של הנוגדן התכוונה להשתמש בפרוטוקול הבא לא מוסווה באמצעות קיבעון, דוגמאות נוספות יכול לשמש לצורך ניתוח דרך עמוד מרחביות בג'ל תספיג. פעולות אלה מבוצעות עם 100 µg של חלבון על פי הוראות היצרן. לכל הנוגדנים αNFAT2 משמשים לדילול 1:1000, הנוגדן GAPDH לדילול 1:10000. דמות המופת של קבוע דגימות תאים Jurkat עם נוגדנים המתאימים ולא הולמים מוצג באיור2.
  6. Resuspend בגדר תא ב 5 מ של פירוק זמינים מסחרית מאגר 1 על ידי pipetting למעלה ולמטה. לאחר מכן, מניחים את הדוגמאות על הקרח על מטרף, דגירה להם 10 דקות תוך כדי טלטול.
    הערה: לפני פירוק, התאים יכולים להיות התפוררה 10 s בחנקן נוזלי. זה שימושי עבור תאים Jurkat אך להימנע בדגימות החולה העיקרי. על התפוררות, מקום הצינורות מ ל 5 s ב- 5-10 מ של חנקן נוזלי במיכל ספציפיים. ללבוש בטיחות משקפיים וכפפות בבטיחות.
  7. לאחר מכן, centrifuge הצינורות ב x 500 g למשך 5 דקות ב 4 ° C, להסיר את תגובת שיקוע בקפידה על-ידי pipetting.
  8. Homogenize התאים 5 מ של מאגר זמין מסחרית פירוק 2 על-ידי pipetting למעלה ולמטה, תקופת דגירה של 10 דקות על הקרח תוך טלטול. לאחר מכן centrifuge הצינורות ב x 500 g למשך 5 דקות ב 4 ° C, להסיר את תגובת שיקוע בקפידה על-ידי pipetting.
  9. Resuspend בגדר תא ב- 500 µL (תאי Jurkat) או µL 140 (דוגמאות החולה) של הטיית מאגר 1 המכיל 1 x מעכב פרוטאז (5 µL או 1.4 µL, בהתאמה) דגירה את התערובת למשך 10 דקות על קרח.
  10. עבור כרומטין הגז, להעביר µL 140 של התא-התליה מהשלב 3.9 לתוך צינורות sonicator (למנוע בהפקת בועות אוויר, חזור על צעד זה במידת הצורך עקב נפח דגימה). מקום הצינורות האולטרה-sonicator ממוקד בטמפרטורה של 7 ° C ו הטיה 10 דקות (תאים בטור) או 7.5 דקות (דוגמאות החולה) עם כוח התקרית הממוצע של 9.375 W כדי לקבל 200-500 bp שברי DNA.
  11. לבסוף, צנטריפוגה ב x 15700 g 10 דקות ב 4 ° C בצנטריפוגה קטנה ולאסוף את תגובת שיקוע צינור 1.5 mL החדש.
  12. כדי לבדוק גודל המקטע המתאימה, לנתח µL 20 של כרומטין הוטו דרך בג'ל ב- 1.5% TBE agarose ג'ל. דמות המופת של כרומטין הוטו מתאי Jurkat של טוב ורע איכות מוצג באיור3. בשלב זה, הפרוטוקול ניתן באופן פוטנציאלי להשהות. כרומטין הוטו צריך להיות מאוחסן ב- 80 ° c

4. כרומטין Immunoprecipitation

הערה: immunoprecipitation כרומטין בוצעה עם ערכת השבבים זמינים מסחרית על פי הוראות היצרן עם שינויים7.

  1. לחשב את מספר immunoprecipitations (70 µL (תאי Jurkat) או µL 15 (דוגמאות החולה) של כרומטין הוטו בתוספת נוגדן אחד) והכן 20 µL של חלבון A מצופה חרוזים לכל המשקעים צינור 1.5 מ. לשטוף את החרוזים ב 40 µL 1 x מאגר שבב 1 לכל המשקעים על-ידי pipetting למעלה ולמטה, תן את החרוזים לנוח על מתלה מגנטי עבור 1 דקות ולהסיר את תגובת שיקוע על-ידי pipetting. לבצע שלב זה ארבע פעמים בסך הכל. בסופו של דבר, resuspend את החרוזים באמצעי האחסון המקורי עם מאגר שבב 1 x 1.
  2. עבור immunoprecipitation עצמה, השתמש µg 10 של הנוגדן αNFAT2 (7A6) כדי ללכוד NFAT2 עם רצפי מאוגד היעד שלה. השתמש µg 2.5 של נוגדנים IgG הארנב (DA1E) כפקד של IgG. הכינו את התגובות mL 1.5 טריים צינורות כמצוין בטבלה1.
    הערה: חשוב להשתמש נוגדן חד שבטי עם זיקה גבוהה של מי epitope מוסווה לא במהלך קיבוע עבור פרוטוקול זה. נוגדנים polyclonal מציגים רמה נוספת של וריאציה באופן משמעותי יותר מאשר בפלומה לפרש כראוי את התוצאות שהתקבלו.
  3. דגירה התערובת מהשלב 4.2 בן לילה ב 4 ° C על גלגל מסתובב במהירות של 6 סל ד.
  4. הבא יום ספין הצינורות עבור 5 s ב 7,000 x g בצנטריפוגה קטן, דגירה אותם בארון תקשורת מגנטי עבור 1 דקות ולהסיר את תגובת שיקוע על ידי השאיפה. לשטוף את החרוזים פעם אחת עם כל אחד המאגרים שטיפת 1, 2, 3 ו- 4 ברציפות.
  5. כדי לעשות זאת, resuspend את החרוזים ב 350 µL שטיפת המאגר, דגירה אותם למשך 5 דקות ב 4 ° C על גלגל מסתובב במהירות של 6 סל ד.
  6. לאחר מכן, לסובב את הצינורות עבור 5 s ב x 7000 g בצנטריפוגה קטן. . ואז, למקם אותם עבור 1 דקות במתלה מגנטי, להסיר את תגובת שיקוע והוסף המאגר שטיפת הבא.
  7. לאחר השלב האחרון כביסה, להסיר את תגובת שיקוע על-ידי pipetting, תופסים את החרוזים ב 100 µL מאגר • תנאי 1, דגירה אותם למשך 30 דקות על גלגל מסתובב במהירות של 6 סל ד.
  8. לסובב את הצינורות זמן קצר (5 s ב x 7000 g בצנטריפוגה קטן) ומניחים אותם על מתלה מגנטי עבור 1 דקות.
  9. ואז להעביר את תגובת שיקוע על-ידי pipetting אל צינור 1.5 מ"ל ולהוסיף 4 µL מאגר • תנאי 2.
  10. כדי ליצור את הפקד קלט, לערבב 1 µL של כרומטין הוטו עם 99 µL של µL מאגר 1 ו- 4 • תנאי מאגר • תנאי 2 (תוכנית התקנה זו, ישנם שלושה צינורות לכל מטופל: קלט אחד IgG אחד-שליטה ובקרה, דוגמא αNFAT2 אחת).
  11. דגירה בדגימות במשך 4 שעות ב 65 ° C ו- 1300 סל ד ב שייקר צינור 1.5 מ. להוסיף 100 µL 100% אלכוהול איזופרופיל, מערבולת, ספין הדגימות עבור 5 s ב x 7000 g בצנטריפוגה קטן.
  12. Resuspend את החרוזים מגנטי זמין על-ידי ביסודיות vortexing, להוסיף 10 µL של החרוזים בכל דגימה, תקופת דגירה של h 1 בטמפרטורת החדר על גלגל מסתובב במהירות של 6 סל ד.
  13. לאחר הדגירה, לסובב את הצינורות עבור 5 s ב x 7000 g הקטן צנטריפוגה. ומניחים אותם על 1 דקות במתלה מגנטי. הסר את תגובת שיקוע על ידי השאיפה.
  14. Resuspend את החרוזים ב 100 µL שטיפת מאגר 1. היפוך הצינורות כדי לערבב תקופת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר על גלגל מסתובב במהירות של 6 סל ד.
  15. לסובב את הצינורות עבור 5 s ב 7000 x g בצנטריפוגה קטן, למקם אותם עבור 1 דקות במתלה מגנטי ולהסיר את תגובת שיקוע על-ידי pipetting. חזור על השלבים 4.13-4.14 עם שטיפת מאגר 2.
  16. לאחר מכן, להסיר את המאגר שטיפת על ידי השאיפה, resuspend את החרוזים ב µL 55 • תנאי המאגר, תקופת דגירה של 15 דקות בטמפרטורת החדר על ההגה מסתובב 6 סל ד כדי elute את ה-DNA precipitated. לבסוף, לסובב את הצינורות עבור 5 s ב 7000 x g בצנטריפוגה קטן, למקם אותם עבור 1 דקות במתלה מגנטי ולהעביר את תגובת שיקוע לתוך צינורות 1.5 mL החדש.
    הערה: כאן הפרוטוקול ניתן באופן פוטנציאלי להשהות. ה-DNA eluted ואז צריך להיות מאוחסן ב-20 ° C.

5. זיהוי גנים היעד NFAT תאים CLL.

  1. לנהל את התגובה לרביעיית-PCR של כפילויות עבור כל דגימה כמצוין בטבלה מס ' 2.
    הערה: איתור היעד גנים PCR כמותי בזמן אמת (לרביעיית-PCR) מתבצע באמצעות שילוב לרביעיית זמינים מסחרית-PCR עם מכשיר PCR בזמן אמת.
  2. השתמש לבן 96-ובכן התגובה צלחות התגובות לבין הכלי RT-PCR. התנאים אופניים הם כדלקמן: 95 ° C ל 30 s, [95 ° C 5 s, 60 ° C ל 30 s] x 40 מחזורי.
    הערה: לדילול טורי של הקלט (מדולל או מדולל 1:10, בטחונות, 1:1000 במים נטולי נוקלאז) משמש כדי לחשב את העשרת יחסי. בתאים Jurkat, il-2 שימש לשלוט בגודל32. CD40L, מטרה ידועים של NFAT2 בתאי B, שימש פקד חיובי תאים CLL ו LCK כדוגמה עבור גן המטרה הרומן של NFAT2 ב CLL33,34. צבעי יסוד האזור יזם CD40L, il-2 , LCK מתוארים בטבלה של ריאגנטים ספציפיים וציוד.

6. נורמליזציה וניתוח נתונים

הערה: העשרה היחסי עבור אזורים יזם עניין (il-2, CD40L או מזל) מחושבת באמצעות הפקד IgG עבור נרמול.

  1. ראשית, קבע Ct (סף מחזור) ערכים עבור קלט טורי דילול, את il-2, CD40L את האזור יזם LCK דרך התוכנה הערכה מנתונים לרביעיית-PCR.
  2. הגדרת עיקול רגיל עבור הריכוזים באמצעות דילול טורי של הקלט. עם זה עיקול רגיל לחשב את הריכוז il-2, CD40L האזור יזם LCK עבור כל שכפול של כל דגימה.
  3. בשלב הבא, לחשב את הממוצע של הכפילויות. לאחר מכן, הגדר את הדגימה immunoprecipitation IgG כנקודת התייחסות. מגדירים את העשרת יחסי עבור הדוגמה 1.0 והשווה אחרות לדוגמה (מ- immunoprecipitation NFAT2) כדי הפניה זו.
  4. לבסוף, לחשב את העשרת יחסי על-ידי חלוקת הריכוז של הדגימות על ידי הריכוז של ההפניה IgG.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

איור 1 מציג ניתוח cytometry זרימה למופת של המטופל CLL לאחר צביעת עם נוגדנים CD19-FITC ו- CD5-PE. איור 1a מציג את דרך השער של לימפוציטים, המייצג את רוב תאי הדם של חולי CLL. איור 1b מציגה את הפרופורציה של CD19+/CD5+ CLL התאים, אשר מייצגים 89.03% לימפוציטים בדוגמה זו. חלקם של CD19+/CD5– B תאים הוא 3.72 צד % אצל המטופל בהתאמה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

השלבים הקריטיים של ביצוע וזמינותו שבב מוצלחת של הבחירה של נוגדן המתאים הינם אופטימיזציה של כרומטין הטיית תהליך25. הבחירה של הנוגדן αNFAT2 הוכיחה להיות מאתגרת במיוחד במהלך הפיתוח של פרוטוקול זה. אמנם ישנם מספר נוגדנים αNFAT2 זמינים מסחרית, רוב העבודות האלה בסדר גמור עבור סופג המערבי ויישומים אחרים, שיבוט 7A6 היה הנוגדן היחיד אשר יכול לשמש בהצלחה עבור השבב7. אפילו כביכול נוגדנים זהים 7A6 של יצרנים שונים הציג הבדלים משמעותיים לגבי הביצועים שלהם שבב. האתגר העיקרי הוא שיבוש epit...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי DFG הענק מו 3340/1-1 ו- Krebshilfe דויטשה את הענק 111134 (שניהם הוענק M.R.M.). אנו מודים אלקה Malenke לסיוע טכני מעולה).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1 X PBSSigma AldrichD8537
1.5 מ"ל שייקר צינור Themomixer נוחותEppendorf5355 000.011ניתן להחליף במכשירים דומים
10X Bolt Sample ReductionAgent Thermo ScientificB0009
20X Bolt MES SDS Running BufferThermo ScientificB0002
37% פורמלדהיד p.a., ACSRoth4979.1
4X בורג LDS מאגר מדגםתרמו מדעיB0007
אנטי-NFAT2 נוגדןAlexis1008505שיבוט 7A6
אנטי-NFAT2איתות תאים8032Sשיבוט D15F1
אנטי-NFAT2 נוגדן ChIP כיתהAbcamab2796שיבוט 7A6
צנטריפוגה גדולהEppendorf5804Rניתן להחליף במכשירים דומים
עכבר CD19-FITC אנטי אנושיBD Biosciences555412Clone HIB19
CD5-PE עכבר אנטי אנושי CD5BD Biosciencesשיבוט555353 UCHT2
שיפוע צפיפות בינוני Biocoll (צפיפות 1,077 גרם/מ"ל)MerckL 6115
DNA LoBind Tube 1.5 מ"לeppendorf22431021
FBS מעולהMerckS0615
זרימה ציטומטרBD BiosciencesFACSניתןבמכשירים דומים
קוקטייל מעכב עצור פרוטאז ופוספטאז (100X)Thermo Scientific78440
iBlot 2 מכשיר העברת ג'ל ThermoScientificIB21001
iBlot 2 ערימות העברה, ניטרוצלולוז, גודל רגילThermo Scientific
IB23001 iDeal ChIp-seq עבור היסטוניםדיאגנודC01010059
יונומיצין מלח סידןסיגמא אולדריץ'I3909
IRDye 680LT חמור אנטי ארנב IgG (H + L), 0.5 מ"גLI-COR Biosciences926-68023
IRDye 800CW עיזים נגד עכבר IgG (H + L), 0.1 מ"גLI-COR Biosciences925-32210
מערכת הדמיה אינפרא אדום LI-COR OdysseyLI-COR BiosciencesB446
LightCycler 480 Multiwell Plate 96, לבןRoche4729692001ניתן להחליף בלוחות אחרים במכשירי PCR שונים בזמן אמת
Lysing Solution OptiLyse BBeckman CoulterIM1400
M220 קובאריס מים בדרגת AFA520101
M220 מתלה מגנטי ממוקד אולטרה-סאונדCovaris500295
DynaMag-15 מגנטThermo Scientific12301Dניתן להחליף במכשירים דומים
MEM תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות 100XThermo Scientific11140050
מיקרוסקופ Axiovert 25Zeiss451200ניתן להחליף במכשירים
דומיםmicroTUBE AFA סיבים מראש חריץ Snap-Cap 6x16 מ"מCovaris520045
Neubauer תא ספירה משופרKarl Hecht GmbH &                       ניתן להחליף את Co KG40442012במכשירים דומים
NH4 Heparin MonovetteSarstedt02.1064
מים ללא נוקלאזPromegaP1193
NuPAGE 4-12% ג'ל חלבון ביס-טריס, 1.0 מ"מ, 15 בארותThermo ScientificNP0323BOX
Odyssey® מאגר חוסם (TBS) 500 מ"לLI-COR Biosciences927-50000
פניצילין/סטרפטומיצין 100XMerckA2213
PerfeCTa SYBR Green FastMixQuanta Bio95072-012
PMASigma AldrichP1585
פריימר CD40L פרומוטור אזור קדימהסיגמא אולדריץ'5'- ACTCGGTGTTAGTAGCCAGG-3'
פריימר CD40L אזור פרומוטור הפוךסיגמא אולדריץ'5'-GGGCTCTTGGGTGCTATTGT -3'
פריימר IL-2 פורוורד אזור מקדםסיגמא אולדריץ'5'-TCCAAAGAGTCATCAGAAGAG-3'
פריימר IL-2 אזור פרומוטור הפוךסיגמא אולדריץ'5'-GGCAGGAGTTGAGGTTACTGT-3'
פריימר LCK פורוורד אזור מקדםסיגמא אולדריץ'5'-CAGGCAAAACAGGCACAT-3'
פריימר LCK אזור פרומוטור הפוךסיגמא אולדריץ'5'-CCTCCAGTGACTCTGTTGGC-3'
ארנב mAb IgG XPאיתות תא# 3900Sשיבוט DA1E
מכשיר PCR בזמן אמתRocheLightCycler 480ניתן להחליף במכשירים דומים
מיקסרים רולרפניקס RS-TR 5
RPMI 1640 בינוני, תוסף GlutaMAXתרמו מדעי61870010
בטיחות-מחט מרובת זבובים 21GSarstedt851638235
SeeBlue Plus2 חלבון מוכתם מראש סטנדרטיThermo ScientificLC5925
Shaker Duomax 1030Heidolph Instruments543-32205-00ניתן להחליף במכשירים דומים
צנטריפוגה קטנהThermo ScientificHeraeus Fresco 17ניתן להחליף במכשירים דומים
נתרן פירובטתרמו Scientific11360070
ß-MercaptoethanolThermo Scientific21985023
Tris Buffered Saline (TBS-10X)איתות תאים#12498
תמיסת טריפאן כחולהסיגמא אולדריץ'93595-50 מ"ל
להחליף את הקליבור ערכת, בקרת איזוטיפ מכשיר

מקורות

  1. Byrd, J. C., Jones, J. J., Woyach, J. A., Johnson, A. J., Flynn, J. M. Entering the Era of Targeted Therapy for Chronic Lymphocytic Leukemia: Impact on the Practicing Clinician. Journal of Clinical Oncology. 32 (27), 3039-3047 (2014).
  2. Woyach, J. A. Survival of the weak (signalers): anergy in CLL. Blood. 121 (19), 3781-3783 (2013).
  3. Hallek, M., et al. Guidelines for diagnosis, indications for treatment, response assessment and supportive management of chronic lymphocytic. Blood. , (2018).
  4. Hogan, P. G., Chen, L., Nardone, J., Rao, A. Transcriptional regulation by calcium, calcineurin, and NFAT. Genes and Development. 17 (18), 2205-2232 (2003).
  5. Macian, F. NFAT proteins: key regulators of T-cell development and function. Nature Reviews Immunology. 5 (6), 472-484 (2005).
  6. Muller, M. R., Rao, A. NFAT, immunity and cancer: a transcription factor comes of age. Nature Reviews Immunology. 10 (9), 645-656 (2010).
  7. Marklin, M., et al. NFAT2 is a critical regulator of the anergic phenotype in chronic lymphocytic leukaemia. Nature Communications. 8 (1), 755(2017).
  8. Geertz, M., Maerkl, S. J. Experimental strategies for studying transcription factor-DNA binding specificities. Briefings in Functional Genomics. 9 (5-6), 362-373 (2010).
  9. Slattery, M., et al. Absence of a simple code: how transcription factors read the genome. Trends in Biochemical Sciences. 39 (9), 381-399 (2014).
  10. Cumbo, F., Vergni, D., Santoni, D. Investigating transcription factor synergism in humans. DNA Research. , (2017).
  11. Gade, P., Kalvakolanu, D. V. Chromatin Immunoprecipitation Assay as a Tool for Analyzing Transcription Factor Activity. Methods in molecular biology. 809, Clifton, N.J. 85-104 (2012).
  12. Mundade, R., Ozer, H. G., Wei, H., Prabhu, L., Lu, T. Role of ChIP-seq in the discovery of transcription factor binding sites, differential gene regulation mechanism, epigenetic marks and beyond. Cell Cycle. 13 (18), 2847-2852 (2014).
  13. Flores, E., Picossi, S., Valladares, A., Herrero, A. Transcriptional regulation of development in heterocyst-forming cyanobacteria. Biochimica et Biophysica Acta. , (2018).
  14. Callens, C., Tucker, M. R., Zhang, D., Wilson, Z. A. Dissecting the role of MADS-box genes in monocot floral development and diversity. Journal of Experimental Botany. 69 (10), 2435-2459 (2018).
  15. Shen, Q., Toulabi, L. B., Shi, H., Nicklow, E. E., Liu, J. The forkhead transcription factor UNC-130/FOXD integrates both BMP and Notch signaling to regulate dorsoventral patterning of the C. elegans postembryonic mesoderm. Developmental Biology. 433 (1), 75-83 (2018).
  16. Tang, X., Zhao, Y., Buchon, N., Engstrom, Y. The POU/Oct Transcription Factor Nubbin Controls the Balance of Intestinal Stem Cell Maintenance and Differentiation by Isoform-Specific Regulation. Stem Cell Reports. , (2018).
  17. Bertacchi, M., Parisot, J., Studer, M. The pleiotropic transcriptional regulator coup-tfi plays multiple roles in neural development and disease. Brain Research. , (2018).
  18. Aronson, B. E., Stapleton, K. A., Krasinski, S. D. Role of GATA factors in development, differentiation, and homeostasis of the small intestinal epithelium. American Journal of Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 306 (6), G474-G490 (2014).
  19. Fernandez, L. P., Lopez-Marquez, A., Santisteban, P. Thyroid transcription factors in development, differentiation and disease. Nature Reviews: Endocrinology. 11 (1), 29-42 (2015).
  20. Jiang, S., et al. Novel role of Forkhead box O 4 transcription factor in cancer: bringing out the good or the bad. Seminars in Cancer Biology. , (2018).
  21. Daniel, P. M., et al. PI3K Activation in Neural Stem Cells Drives Tumorigenesis which can be Ameliorated by Targeting the cAMP Response Element Binding (CREB) Protein. Neuro-Oncology. , (2018).
  22. Chen, W. T., Chen, Y. K., Lin, S. S., Hsu, F. T. Hyperforin Suppresses Tumor Growth and NF-kappaB-mediated Anti-apoptotic and Invasive Potential of Non-small Cell Lung Cancer. Anticancer Research. 38 (4), 2161-2167 (2018).
  23. Ausubel, F. M. Current protocols in molecular biology. , Wiley & sons. (1994).
  24. Garner, M. M., Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Research. 9 (13), 3047-3060 (1981).
  25. Fujita, T., Fujii, H. Biochemical Analysis of Genome Functions Using Locus-Specific Chromatin Immunoprecipitation Technologies. Gene Regulation and Systems Biology. 10 (Suppl 1), 1-9 (2016).
  26. O'Neill, L. P., Turner, B. M. Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP. Methods. 31 (1), 76-82 (2003).
  27. Gilmour, D. S., Lis, J. T. Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (14), 4275-4279 (1984).
  28. Gilmour, D. S., Lis, J. T. In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster. Molecular and Cellular Biology. 5 (8), 2009-2018 (1985).
  29. Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: evidence that histone H4 is retained on a highly transcribed gene. Cell. 53 (6), 937-947 (1988).
  30. Varshavsky, A. Discovery of cellular regulation by protein degradation. Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34469-34489 (2008).
  31. Hebbes, T. R., Thorne, A. W., Crane-Robinson, C. A direct link between core histone acetylation and transcriptionally active chromatin. EMBO Journal. 7 (5), 1395-1402 (1988).
  32. Decker, E. L., Skerka, C., Zipfel, P. F. The early growth response protein (EGR-1) regulates interleukin-2 transcription by synergistic interaction with the nuclear factor of activated T cells. Journal of Biological Chemistry. 273 (41), 26923-26930 (1998).
  33. Grammer, A. C., et al. The CD40 ligand expressed by human B cells costimulates B cell responses. Journal of Immunology. 154 (10), 4996-5010 (1995).
  34. Pham, L. V., Tamayo, A. T., Yoshimura, L. C., Lin-Lee, Y. C., Ford, R. J. Constitutive NF-kappaB and NFAT activation in aggressive B-cell lymphomas synergistically activates the CD154 gene and maintains lymphoma cell survival. Blood. 106 (12), 3940-3947 (2005).
  35. Zhou, Z. H., et al. The acid-sensing ion channel, ASIC2, promotes invasion and metastasis of colorectal cancer under acidosis by activating the calcineurin/NFAT1 axis. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 36 (1), 130(2017).
  36. Estrada-Aviles, R., Rodriguez, G., Zarain-Herzberg, A. The cardiac calsequestrin gene transcription is modulated at the promoter by NFAT and MEF-2 transcription factors. PloS One. 12 (9), e0184724(2017).
  37. Kadziolka, B., Lesniak, W., Filipek, A. Regulation of CacyBP/SIP expression by NFAT1 transcription factor. Immunobiology. 222 (8-9), 872-877 (2017).
  38. Lieb, J. D., Liu, X., Botstein, D., Brown, P. O. Promoter-specific binding of Rap1 revealed by genome-wide maps of protein-DNA association. Nature Genetics. 28 (4), 327-334 (2001).
  39. Ren, B., et al. Genome-wide location and function of DNA binding proteins. Science. 290 (5500), 2306-2309 (2000).
  40. Iyer, V. R., et al. Genomic binding sites of the yeast cell-cycle transcription factors SBF and MBF. Nature. 409 (6819), 533-538 (2001).
  41. Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).
  42. Robertson, G., et al. Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing. Nature Methods. 4 (8), 651-657 (2007).
  43. Schmid, C. D., Bucher, P. ChIP-Seq data reveal nucleosome architecture of human promoters. Cell. 131 (5), author reply 832-833 831-832 (2007).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

ניתוח גורמי שעתוקאינטראקציות חלבון-DNAPCR כמותי בזמן אמתגזירה באמצעות סוניקציהנוגדן Anti-NFAT2זיהוי הגן LCKקיבוע בפורמלהיד
כרומטין Immunoprecipitation Assay לזיהוי NFAT2 הרומן גנים היעד בלוקמיה לימפוציטית כרונית
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.