לוקמיה לימפוציטית כרונית (CLL) הוא הלוקמיה הנפוץ ביותר בעולם המערבי. גורמי שעתוק NFAT הן הרגולטורים חשוב של פיתוח והפעלה סוגי תאים רבים. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול לשימוש של כרומטין immunoprecipitation (ChIP) בתאי CLL אדם לזיהוי גנים היעד הרומן של NFAT2.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
כרומטין Immunoprecipitation Assay לזיהוי NFAT2 הרומן גנים היעד בלוקמיה לימפוציטית כרונית
במאמר זה
סיכום
תקציר
לוקמיה לימפוציטית כרונית (CLL) מאופיין על-ידי ההרחבה של תא B ממאיר שיבוטים ומייצג הלוקמיה הנפוץ במדינות המערב. רוב החולים CLL הצג מסלול indolent של המחלה, כמו גם של פנוטיפ anergic של תאים לוקמיה שלהם, בהתייחסו קולטן תא B להגיב גירויים חיצוניים. אנחנו לאחרונה הראו כי הגורם שעתוק NFAT2 מווסת מכריע של anergy ב- CLL. האתגר העיקרי בניתוח של התפקיד של פקטור שעתוק במחלות שונות הוא הזיהוי של הגנים שלו ביעד מסוים. זה משמעות רבה עבור הבהרה של מנגנונים pathogenetic והתערבויות טיפוליות אפשריות. כרומטין immunoprecipitation (ChIP) היא טכניקה קלאסית להפגין אינטראקציות חלבון-DNA ו, לכן, ניתן להשתמש לזיהוי גנים היעד הישיר של גורמי שעתוק בתאי יונקים. כאן, שבב שימש כדי לזהות LCK גן היעד הישיר של NFAT2 בתאי CLL אדם. ה-DNA, חלבונים הקשורים תפור באמצעות פורמלין, לאחר מכן לכסנתם על ידי sonication לחלקים הדנ א של 200-500 בסיסי זוגות (bp). שברי DNA צולבים המשויך NFAT2 נארזים בצורה סלקטיבית immunoprecipitated של שאריות תאים באמצעות נוגדן αNFAT2. לאחר טיהור, שברי DNA המשויך מזוהים באמצעות PCR כמותי בזמן אמת (לרביעיית-PCR). רצפי DNA עם העשרה ניכר מייצגים אזורים בגנום אשר מיועדים על-ידי NFAT2 ויוו. ההטיה המתאימה של ה-DNA, הבחירה של הנוגדן נדרש מכריעים במיוחד עבור היישום המוצלח של שיטה זו. פרוטוקול זה הינו אידיאלי עבור ההדגמה של אינטראקציות ישיר של NFAT2 עם גנים היעד. הגבלה העיקרי שלה הוא הקושי להעסיק. את השבב של מבחני בקנה מידה גדול לנתח את הגנים היעד של מספר גורמי שעתוק אורגניזמים שלמים.
מבוא
לוקמיה לימפוציטית כרונית (CLL) מייצג הלוקמיה הנפוץ ביותר אצל מבוגרים במדינות המערב, מפגין ברורים הצטברות CD19 CD23, CD5 לבטא בוגרת B תאים1. רוב המטופלים התערוכה קורס מחלת indolent, אשר לא מחייבים טיפול מיוחד במשך שנים רבות. לעומת זאת, חלק מהחולים מראים התקדמות מהירה המחייבים התערבויות טיפוליות מיידית עם החיסון-כימותרפיה או טיפולים ממוקדים אחרים,2,3. גרעיני גורם של תאי T מופעל (NFAT) היא משפחה של גורמי שעתוק השליטה התפתחותיים שונים ותהליכים הפעלה5,4,סוגי תאים רבים6. אנחנו לאחרונה הפגינו ביטוי וה....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הניסויים שנערכו עם חומר אנושי אושרו על ידי ועדת האתיקה של אוניברסיטת טיבינגן, ממנו כל המטופלים אשר תרמו דגימות מחקר זה הושג בכתב הסכמה מדעת.
1. בידוד ותאי גירוי של Jurkat
הערה: כדי למטב את הפרוטוקול, השתמש בשורת תא Jurkat אשר ידוע לבטא רמות גבוהות של NFAT2. כל הצעדים מבוצעים תחת תא למינארי.
- להכין 50 מ של RPMI 1640 בתוספת 10% FCS ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין מאת מהרהרת היא 37 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים.
- תרבות Jurkat תאים עבור 1-2 d בבקבוקון התרבות התא-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 ב- 20 מ של RPMI 1640 בתוספת 10% FCS ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין על צפיפות של 2 x 106 תאים למ"ל (תאים....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
איור 1 מציג ניתוח cytometry זרימה למופת של המטופל CLL לאחר צביעת עם נוגדנים CD19-FITC ו- CD5-PE. איור 1a מציג את דרך השער של לימפוציטים, המייצג את רוב תאי הדם של חולי CLL. איור 1b מציגה את הפרופורציה של CD19+/CD5+ CLL התאים, אשר מייצגים 89.03% לימפוציטים בדוגמה זו. חלקם של CD19+/CD5– B תאים הוא 3.72 צד % אצל המטופל בהתאמה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
השלבים הקריטיים של ביצוע וזמינותו שבב מוצלחת של הבחירה של נוגדן המתאים הינם אופטימיזציה של כרומטין הטיית תהליך25. הבחירה של הנוגדן αNFAT2 הוכיחה להיות מאתגרת במיוחד במהלך הפיתוח של פרוטוקול זה. אמנם ישנם מספר נוגדנים αNFAT2 זמינים מסחרית, רוב העבודות האלה בסדר גמור עבור סופג המערבי ויישומים אחרים, שיבוט 7A6 היה הנוגדן היחיד אשר יכול לשמש בהצלחה עבור השבב7. אפילו כביכול נוגדנים זהים 7A6 של יצרנים שונים הציג הבדלים משמעותיים לגבי הביצועים שלהם שבב. האתגר העיקרי הוא שיבוש epit.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי DFG הענק מו 3340/1-1 ו- Krebshilfe דויטשה את הענק 111134 (שניהם הוענק M.R.M.). אנו מודים אלקה Malenke לסיוע טכני מעולה).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 1 X PBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| 1.5 מ"ל שייקר צינור Themomixer נוחות | Eppendorf | 5355 000.011 | ניתן להחליף במכשירים דומים |
| 10X Bolt Sample Reduction | Agent Thermo Scientific | B0009 | |
| 20X Bolt MES SDS Running Buffer | Thermo Scientific | B0002 | |
| 37% פורמלדהיד p.a., ACS | Roth | 4979.1 | |
| 4X בורג LDS מאגר מדגם | תרמו מדעי | B0007 | |
| אנטי-NFAT2 נוגדן | Alexis | 1008505 | שיבוט 7A6 |
| אנטי-NFAT2 | איתות תאים | 8032S | שיבוט D15F1 |
| אנטי-NFAT2 נוגדן ChIP כיתה | Abcam | ab2796 | שיבוט 7A6 |
| צנטריפוגה גדולה | Eppendorf | 5804R | ניתן להחליף במכשירים דומים |
| עכבר CD19-FITC אנטי אנושי | BD Biosciences | 555412 | Clone HIB19 |
| CD5-PE עכבר אנטי אנושי CD5 | BD Biosciences | שיבוט | 555353 UCHT2 |
| שיפוע צפיפות בינוני Biocoll (צפיפות 1,077 גרם/מ"ל) | Merck | L 6115 | |
| DNA LoBind Tube 1.5 מ"ל | eppendorf | 22431021 | |
| FBS מעולה | Merck | S0615 | |
| זרימה ציטומטר | BD Biosciences | FACSניתן | במכשירים דומים |
| קוקטייל מעכב עצור פרוטאז ופוספטאז (100X) | Thermo Scientific | 78440 | |
| iBlot 2 מכשיר העברת ג'ל Thermo | Scientific | IB21001 | |
| iBlot 2 ערימות העברה, ניטרוצלולוז, גודל רגיל | Thermo Scientific | ||
| IB23001 iDeal ChIp-seq עבור היסטונים | דיאגנוד | C01010059 | |
| יונומיצין מלח סידן | סיגמא אולדריץ' | I3909 | |
| IRDye 680LT חמור אנטי ארנב IgG (H + L), 0.5 מ"ג | LI-COR Biosciences | 926-68023 | |
| IRDye 800CW עיזים נגד עכבר IgG (H + L), 0.1 מ"ג | LI-COR Biosciences | 925-32210 | |
| מערכת הדמיה אינפרא אדום LI-COR Odyssey | LI-COR Biosciences | B446 | |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 96, לבן | Roche | 4729692001 | ניתן להחליף בלוחות אחרים במכשירי PCR שונים בזמן אמת |
| Lysing Solution OptiLyse B | Beckman Coulter | IM1400 | |
| M220 קובאריס מים בדרגת AFA | 520101 | ||
| M220 מתלה מגנטי ממוקד אולטרה-סאונד | Covaris | 500295 | |
| DynaMag-15 מגנט | Thermo Scientific | 12301D | ניתן להחליף במכשירים דומים |
| MEM תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות 100X | Thermo Scientific | 11140050 | |
| מיקרוסקופ Axiovert 25 | Zeiss | 451200 | ניתן להחליף במכשירים |
| דומיםmicroTUBE AFA סיבים מראש חריץ Snap-Cap 6x16 מ"מ | Covaris | 520045 | |
| Neubauer תא ספירה משופר | Karl Hecht GmbH & ניתן להחליף את Co KG | 40442012 | במכשירים דומים |
| NH4 Heparin Monovette | Sarstedt | 02.1064 | |
| מים ללא נוקלאז | Promega | P1193 | |
| NuPAGE 4-12% ג'ל חלבון ביס-טריס, 1.0 מ"מ, 15 בארות | Thermo Scientific | NP0323BOX | |
| Odyssey® מאגר חוסם (TBS) 500 מ"ל | LI-COR Biosciences | 927-50000 | |
| פניצילין/סטרפטומיצין 100X | Merck | A2213 | |
| PerfeCTa SYBR Green FastMix | Quanta Bio | 95072-012 | |
| PMA | Sigma Aldrich | P1585 | |
| פריימר CD40L פרומוטור אזור קדימה | סיגמא אולדריץ' | 5'- ACTCGGTGTTAGTAGCCAGG-3' | |
| פריימר CD40L אזור פרומוטור הפוך | סיגמא אולדריץ' | 5'-GGGCTCTTGGGTGCTATTGT -3' | |
| פריימר IL-2 פורוורד אזור מקדם | סיגמא אולדריץ' | 5'-TCCAAAGAGTCATCAGAAGAG-3' | |
| פריימר IL-2 אזור פרומוטור הפוך | סיגמא אולדריץ' | 5'-GGCAGGAGTTGAGGTTACTGT-3' | |
| פריימר LCK פורוורד אזור מקדם | סיגמא אולדריץ' | 5'-CAGGCAAAACAGGCACAT-3' | |
| פריימר LCK אזור פרומוטור הפוך | סיגמא אולדריץ' | 5'-CCTCCAGTGACTCTGTTGGC-3' | |
| ארנב mAb IgG XP | איתות תא | # 3900S | שיבוט DA1E |
| מכשיר PCR בזמן אמת | Roche | LightCycler 480 | ניתן להחליף במכשירים דומים |
| מיקסרים רולר | פניקס RS-TR 5 | ||
| RPMI 1640 בינוני, תוסף GlutaMAX | תרמו מדעי | 61870010 | |
| בטיחות-מחט מרובת זבובים 21G | Sarstedt | 851638235 | |
| SeeBlue Plus2 חלבון מוכתם מראש סטנדרטי | Thermo Scientific | LC5925 | |
| Shaker Duomax 1030 | Heidolph Instruments | 543-32205-00 | ניתן להחליף במכשירים דומים |
| צנטריפוגה קטנה | Thermo Scientific | Heraeus Fresco 17 | ניתן להחליף במכשירים דומים |
| נתרן פירובט | תרמו Scientific | 11360070 | |
| ß-Mercaptoethanol | Thermo Scientific | 21985023 | |
| Tris Buffered Saline (TBS-10X) | איתות תאים | #12498 | |
| תמיסת טריפאן כחולה | סיגמא אולדריץ' | 93595-50 מ"ל |
מקורות
- Byrd, J. C., Jones, J. J., Woyach, J. A., Johnson, A. J., Flynn, J. M. Entering the Era of Targeted Therapy for Chronic Lymphocytic Leukemia: Impact on the Practicing Clinician. Journal of Clinical Oncology. 32 (27), 3039-3047 (2014).
- Woyach, J. A.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
