Method Article

יעיל ומדרגי הבידול בבימויו של קלינית הקרנית Limbal אפיתל תאי גזע מתאימים מתאי גזע Pluripotent אנושי

DOI:

10.3791/58279

⸱

October 24th, 2018

 ,  ,  ,  , 
1BioMediTech Institute, Faculty of Medicine and Life Sciences, University of Tampere, 2Department of Ophthalmology, SILK, Faculty of Medicine and Life Sciences, University of Tampere

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מציג שיטה פשוטה שני שלבים המבדילים הקרנית תאי גזע limbal אפיתל מתאי גזע pluripotent האנושי בתנאים ללא תא תרבות קסנו - ולא מזין. השיטות התרבות התא המוצג כאן מאפשרים חסכוניים, בקנה מידה גדול ייצור תאי איכות קליניים, החלים על שימוש טיפול תאי הקרנית.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קרנית limbal אפיתל תאי גזע (LESCs) אחראים באופן רציף חידוש האפיתל הקרנית, ובכך שמירה על הומאוסטזיס הקרנית ואת בהירות חזותית. תא גזע pluripotent אנושי (hPSC)-נגזר LESCs מספקים מקור תא מבטיח עבור טיפול בתחליפי תא הקרנית. לא מוגדר, xenogeneic תרבות ובידול תנאים לגרום וריאציה של תוצאות המחקר, לעכב את התרגום קליני של הרפוי נגזר hPSC. פרוטוקול זה מספק שיטה יעילה הדירים בידול hPSC-LESC בתנאים קסנו - ולא מזין נטול תאים. ראשית, טפט התרבות של hPSC מובחן laminin רקומביננטי-521 (LN-521) ו hPSC מוגדר בינוני משמש בסיס לייצור חומר המוצא באיכות גבוהה differentiations חזקים. שנית, שיטה בידול hPSC-LESC מהירה ופשוטה התשואות אוכלוסיות LESC ב- 24 יום בלבד. שיטה זו כוללת ארבעה ימים אינדוקציה ectodermal משטח ההשעיה עם מולקולות קטנות, ואחריו שלב חסיד התרבות על הרביעי LN-521/קולגן מטריקס שילוב במדיום מוגדר בידול אפיתל הקרנית. Cryostoring ובידול מורחב נוסף מטהרת את האוכלוסייה תא ומאפשר הבנקאות של התאים בכמויות גדולות עבור מוצרי טיפול תא. באיכות גבוהה וכתוצאה מכך hPSC-LESCs מספקים פוטנציאל טיפול חדשניים אסטרטגיה שיקום פני הקרנית לטפל מחסור בתאי גזע limbal (LSCD).

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הקרנית שקופה בפני השטח עינית מאפשר לאור להיכנס הרשתית ומספק את רוב כוח השבירה של העין. השכבה החיצונית ביותר, האפיתל הקרנית מרובדת, נוצר מחדש ללא הרף על ידי תאי גזע אפיתל limbal (LESCs). LESCs שוכנים לשכבת הבסיס של גומחות limbal ב corneoscleral צומת1,2. LESCs אין סמנים ייחודיים, אז את הזיהוי שלהם מחייב ניתוח מקיף יותר של ערכת סמנים בשם. P63 פקטור שעתוק אפיתל, במיוחד N-סופני קטום תעתיק איזופורם אלפא p63 (ΔNp63α), הוצע כפי רלוונטי חיובי LESC סמן3,4. חלוקה סימטרית של LESCs מאפשר להם לחדש את עצמי, אבל גם לייצר רומא זה להעביר את centripetally ואת anteriorly. כמו התאים התקדמות לעבר פני הקרנית הם בהדרגה לאבד את stemness שלהם, סוף סוף סופני להבדיל לתאים קשקשיים שטחית אובדות ברציפות ממשטח הקרנית.

נזק לאף אחד הרבדים קרניות יכולה להוביל לקות ראייה חמור, פגמים הקרנית ולפיכך הם אחד הגורמים המובילים של אובדן ראייה ברחבי העולם. במחסור בתאי גזע limbal (LSCD), לימבוס מושמד על ידי מחלה או טראומה מה שמוביל conjunctivalization ו- opacification של פני הקרנית ואובדן עוקבות של חזון5,6. תא החלפת טיפול באמצעות שתלים limbal עצמיים או allogeneic מציע אסטרטגיה לטיפול בחולים עם LSCD4,7,8,9. עם זאת, קצירת שתלים עצמיים נושא סיכון לסיבוכים בעין בריא, רקמה היא מחסור. האדם גזע pluripotent (hPSCs), במיוחד תאי גזע עובריים (hESCs) ואת האדם המושרה גזע pluripotent (hiPSCs), יכול לשמש כמקור בלתי מוגבל של סוגי תאים הרלוונטית קלינית, כולל תאים אפיתל הקרנית. לכן, נגזר hPSC LESCs (hPSC-LESCs) מייצגות מקור תא חדש אטרקטיבי לטיפול החלפת עינית התא.

באופן מסורתי, השיטות תרבות hPSC מובחן והן לפרוטוקולים שלהם בידול LESCs צריכים לסמוך על השימוש של תאים מזין לא מוגדר, סרה בעלי חיים, מדיה ממוזגים או קרום מי השפיר10,11, 12 , 13 , 14 , 15. לאחרונה, מאמצים לכיוון בטוח יותר מוצרי טיפול תא עוררו החיפוש אחר מספר מתוקנן ונטולת קסנו תרבות ובידול פרוטוקולים. כתוצאה מכך, מספר שיטות התרבות ארוכת טווח של hPSCs מובחן מוגדר ונטולת קסנו נמצאים כעת זמינים מסחרית16,17,18. כמו רצף, התמיינות מכוונת פרוטוקולים להסתמך על רמזים מולקולרית להנחות hPSCs הגורל אפיתל הקרנית היה לאחרונה הציג19,20,21,22, 23. עדיין רבים של פרוטוקולים אלה משמש גם hPSCs מזין המבוסס לא מוגדר, החל חומר, או מורכבים, xenogeneic פקטורי גדילה קוקטיילים על בידול.

המטרה של פרוטוקול זה נועד לספק חזקות, אופטימיזציה, קסנו-שיטת תרבות נטולת מזין hPSC ואת בידול עוקבות LESCs הקרנית. טפט תרבות של pluripotent hPSCs-laminin-521 מטריקס (LN-521) במדיום מוגדר, אלבומין ללא hPSC (במיוחד חיוני 8 Flex) מאפשר ייצור מהיר של חומר המוצא הומוגנית differentiations. לאחר מכן פשוט, אסטרטגיית בידול שני שלבים מנחה hPSCs לכיוון פני השטח ectodermal הגורל ההשעיה, ואחריו חסיד בידול כדי LESCs. אוכלוסיה התא שבו > 65% לבטא ΔNp63α מתקבל בתוך 24 ימים. פרוטוקול קסנו-מזין נטול נבדקו עם מספר קווי hPSC (hESCs וגם hiPSCs), ללא מקפידים על תא קו מסוים אופטימיזציה. הפרוטוקולים עבור סוף השבוע ללא תחזוקה, passaging, cryostoring, hPSC-LESC phenotyping המתוארים כאן לאפשר ייצור של קבוצות גדולות של LESCs באיכות גבוהה עבור קליני או למטרות מחקר.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אוניברסיטת טמפרה יש האישור של הרשות הלאומית לענייני הנושאים הקשורים מאת נייט פינלנד (Dnro 1426/32/300/05) כדי לערוך מחקר על עוברי אדם. המכון מציע גם הצהרות תומכת הוועדה האתית של רובע ח Pirkanmaa כדי להפיק, תרבות, וההבחנה קווים hESC (Skottman/R05116) וכדי להשתמש hiPSC קווים במחקר אופטלמולוגי (Skottman/R14023). אין שורות תאים חדשים נשאבו במחקר זה.

הערה: הפרוטוקול המתואר מבוססת על hPSC ספציפיים, זמינים מסחרית ומדיה בידול אפיתל הקרנית. עיין בטבלה של חומרים עבור מספרי מידע וקטלוג היצרן/ספק.

1. יצירת הטקטיקה קסנו-מזין נטול hPSC תרבות

  1. ההכנות
    1. מעיל טוב 24 צלחות עם האדם רקומביננטי laminin-521 (LN-521). למעבר הראשון ללא מזין (FF), השתמש LN-521-ריכוז של µg/ס"מ שוקל 1.092, ו- µg/cm 0.552 עבור המעברים הבאים. הריכוזים LN-521 הציע לשמש נקודת פתיחה מוצלחת תרבות FF אך ניתן להוריד.
      1. הפשרת LN-521 המבחנה לאט ב 4 ° C שהומלץ על ידי היצרן.
        הערה: פתרון LN-521 שטופלה כראוי ניתן לאחסן ב 4 ° C עד 3 חודשים לאחר מפשיר.
      2. כדי להכין את הפתרון ציפוי, לדלל הכמות המתאימה של LN-521 פתרון מניות עם Dulbecco x 1 Phosphate-Buffered מלוחים (DPBS) המכילה Ca2 + ו- Mg2 + את הנפח הכולל של µL 300 לכל טוב.
      3. Pipet הפתרון ציפוי הבארות, לאטום את הצלחת היטב עם מצלמות-מיקרוסקופים, דגירה בין לילה ב 4 º C. ניתן לאחסן צלחות מצופה ב 4 ° C עד 2 שבועות.
        (אופציונלי): לחילופין, עבור פרוטוקול ציפוי מהירה, דגירה צלחות היטב עם ציפוי פתרון עבור 2 h ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.
    2. הכן hPSC תרבות בינוני (במיוחד חיוני 8 Flex) על ידי שכשהם הבזליים בינוני עם תוספת שסופקו, שהומלץ על ידי היצרן. הוסף הפניצילין U/mL 50-סטרפטומיצין.... שימו לב כי ניסוח רגיש לטמפרטורות בהיר וגבוה. להפשיר את תוספת וחם התקשורת בטמפרטורת החדר (RT), מוגן מפני אור. השתמש המדיום שהושלם hPSC תוך שבועיים מתאריך תוספי.
  2. העברת את hPSC לתרבות FF ב- LN-521
    1. לחמם כל החומרים הדרושים, ריאגנטים RT בשכונה זרימה שכבתית.
    2. HPSCs המעבר ממערכת תרבות רגיל בשכבות מזין (למשל מוחלש האנושי העורלה (hFF) או העכבר מתחלקים fibroblasts), או מערכות אחרות תרבות FF באמצעות מתודולוגיה סטנדרטי. לדוגמה, מושבות hPSC תרבותי hFF מזין בתאים יכול להיות גזור חתיכות קטנות עם איזמל, החלקים ואז משפחתי עם טיפ המחט. מגירסה אנושית ותרבותית שימוש במערכות תרבות FF ניתן להעביר באמצעות אשכול passaging שיטה עם או בלי טיפול אנזים מוקדמת.
    3. להסיר את הפתרון ציפוי LN-521 מן הבארות 24 ולהוסיף 1 מ"ל בינוני hPSC מראש ומחוממת לכל טוב.
      הערה: אל תאפשר את הבארות להתייבש כמו LN-521 הפוך ללא פעיל בעת ייבוש.
    4. העברה האשכולות חתיכות תא המושבה LN-521 מצופה 24-ולס hPSC בינוני עם פיפטה. להעביר חלקים המושבה 20 – 30, ובכן, הימנעות צפיפות יתר הבארות.
    5. החלף את המדיום 1 מ"ל של מדיום hPSC היום לאחר העברת כל יומיים לאחר מכן. התרבויות מוכנים passaging 3-4 ימים מאוחר יותר, כדי hPSCs גדלו את המושבות עם מורפולוגיה חלקה, מובחן. לקבלת הפניה, ראה איור 1B (תמונה ראשונה). מעבר FF הראשון, המושבות אסור לגדול חד שכבתי מלא confluent, אבל צריך להיות passaged התרבויות כאשר המושבות להגיע בגודל המשוער של 1 מ מ.
  3. Passaging ותחזוקה של תרבות hPSC FF
    1. לחמם כל החומרים הדרושים, ריאגנטים RT בשכונה זרימה שכבתית.
    2. מן השני FF המעבר ואילך, המעבר של hPSCs FF כאשר התרבות הגיעה confluency 80-100%. המעבר hPSCs סס ל LN חדש-521 מצופה 24-ובכן צלחות באמצעות תא בודד passaging פעמיים בשבוע (בימי שני וחמישי) כדי לשמור על איכות גבוהה תרבויות עם מורפולוגיה מובחן ולהשיגו משטר האכלה ללא סופ ש. לפרטים, נא לפנות24,18,25.
      1. יש לשטוף את hPSCs FF פעמיים עם 1 מ"ל של x DPBS 1 ללא Ca2 + ו- Mg2 +.
      2. ניתוק hPSCs FF עם נטול קסנו טריפסין-EDTA (במיוחד TrypLE בחר אנזים) על ידי ומוכנסות µL 500 לכל טוב ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2. זמן הדגירה אופטימלית, לאפשר את התאים לכנס, אך לא להתנתק. זה בדרך כלל לוקח 3 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 (לא יעלה על 5 דקות).
      3. להסיר ללא קסנו טריפסין-EDTA ולהוסיף מיד µL 500 לכל טוב של מעכבי טריפסין מוגדרים.
      4. ניתוק FF hPSCs על ידי זהיר, עדיין יסודית pipetting כדי לקבל השעיה תא בודד. להעביר את המתלים hPSC FF דרך מסננת תא 40 µm לתוך שפופרת צנטרפוגה חרוט 15 מ"ל המכיל hPSC מראש ומחוממת בינוני.
      5. לשטוף את הבארות עם 1 מ"ל hPSC בינוני ומוסיפים כביסה בינוני הצינור צנטריפוגה חרוט 15 מ"ל.
      6. Centrifuge התליה תא בודד עבור 5 דקות ב 300 x g, תשאף בגדר תא, resuspend בינוני hPSC מראש ומחוממת 1 מ"ל.
      7. לספור את התאים עם hemocytometer או תא אוטומטיות מונה.
      8. להסיר הפתרון ציפוי LN-521 (0.55 µg/cm2) מן הבארות 24 ולהוסיף hPSC בינוני כמו 1.2.3.
      9. צלחת hPSCs FF אל µg 0.55/cm2 LN-521 מצופה 24-ולס-צפיפות התאים של 40,000 – 50,000 תאים/ס מ2.
      10. החלף בינוני בינוני hPSC טריים יום אחרי passaging, בכל יום לאחר מכן למעט בימי ראשון.
    3. התאים הם מוכנים לשימוש עבור בידול 3-4 ימים לאחר passaging, כאשר הגיעה התרבות > 85% confluency. להבטחת איכות גבוהה hPSCs, עיין שיטות אפיון תיאר בפירוט רב עבודות קודמות18,24,25. מומלץ רק תרבות hPSCs עד מעבר לרמה 15 במערכת FF באמצעות תא בודד passaging כדי למנוע שינויים karyotypic. השתמש רק באיכות גבוהה, מובחן hPSCs כמתחילה חומר differentiations.

2. מכוונת הבידול והיתרון הקפאה קריוגנית של נגזר hPSC LESCs

  1. ההכנות
    1. להכין אינדוקציה ללא קסנו הבזליים בינוני (אינדוקציה הבזליים בינוני): של תוספת Dulbecco שונה בינוני של הנשר (במיוחד DMEM נוק אאוט) עם החלפת סרום ללא קסנו 15% (spesifically CTS נוקאאוט SR XenoFree), 2 מ מגלוטמין, 0.1 מ מ 2 - mercaptoethanol 1% חומצות אמינו שאינן הכרחיות, פניצילין U/mL 50-סטרפטומיצין.... השתמש המדיום אינדוקציה הבזליים בתוך שבועיים.
    2. להכין מדיה אינדוקציה הקרנית בתרבות ההשעיה.
      1. יום 1: תוספת אינדוקציה הבזליים בינוני עם 5 μM blebbistatin.
      2. יום 2: תוספת אינדוקציה הבזליים בינוני עם 10 מיקרומטר SB-505124 ל-50 ננוגרם אנושי בסיסי פיברובלסט גורם גידול (bFGF).
      3. יום 3-4: תוספת אינדוקציה הבזליים בינוני עם 25 ng/mL עצם morphogenetic חלבון 4 (BMP-4).
    3. להתכונן אפיתל הקרנית בידול בינוני (בידול בינוני, במיוחד CnT-30) חסיד התרבות: להוסיף תוספי תזונה בינונית הבזליים לפי הוראות היצרן ומוסיפים פניצילין U/mL 50-סטרפטומיצין....
      הערה: ניסוח בינוני בידול הוא רגיש לאור. השתמש המדיום בידול שהושלם בתוך 6 שבועות של התאריך תוספי.
    4. מעיל 100 מ מ מנות תרביות רקמה עבור בידול חסיד (ראה שלב 2.3) עם תערובת של 5 של µg ס מ2 סוג הקולגן היפרדות האדם הרביעי (col IV) ו- 0.5 µg/cm2 LN-521 מעורבבת עם x DPBS 1 המכיל2 + Ca ו- Mg2 +, סך ציפוי נפח 5 מ לכל תבשיל. להכין ולאחסן את ציפוי עם col IV ו LN-521 כמתואר ב- 1.1.1.3.
  2. שלב i: אינדוקציה הקרנית בתרבות השעיה
    1. לחמם כל החומרים הדרושים, ריאגנטים RT בשכונה זרימה שכבתית.
    2. ניתוק FF hPSCs אל תא בודד הבולם עם נטול קסנו טריפסין-EDTA שהומלץ ב שלבים 1.3.2.1–1.3.2.6. לספור את התאים, ולפזר על 2-3 x 106 תאים לכל קובץ מצורף נמוך צלחת 6-ובכן, בנפח כולל של 3 מ"ל של מדיום אינדוקציה הבזליים בתוספת 5 blebbistatin μM לזירוז EB היווצרות לילה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 (יום 1).
    3. למחרת היום (יום 2), להסיר את המדיום והחלף 3 מ"ל של מדיום אינדוקציה הבזליים בתוספת 10 מיקרומטר SB-505124 ל-50 ננוגרם bFGF.
    4. ביום שלאחר מכן יומיים (ימים 3-4), להסיר את המדיום והחלף 3 מ"ל של מדיום אינדוקציה הבזליים בתוספת 25 ננוגרם למ"ל BMP-4.
  3. שלב II: בידול הקרנית בתרבות חסיד
    1. לחמם כל החומרים הדרושים, ריאגנטים RT בשכונה זרימה שכבתית.
    2. יום 5, צלחת את EBs למטה על מנות תרביות רקמה 100 מ מ מצופה 5 µg/cm2 col IV ו- 0.5 µg/cm2 LN-521.
      1. הסר את הפתרון ציפוי של מנות תרביות רקמה 100 מ מ ולהוסיף 10 מ"ל של בידול מראש ומחוממת בינוני לכל תבשיל.
        הערה: אל תאפשר את הכלים לייבוש כמו LN-521 הפוך ללא פעיל בעת ייבוש.
      2. להעביר את EBs לוח 6-ובכן אחד טוב שתיים שלוש מנות של תרביות רקמה 100 מ מ (כ-50 EBs לכל ס מ2) על ידי pipetting. פזר את EBs באופן שווה על ידי טלטול עדין.
    3. לשמור על התאים בתרבות חסיד ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, מחליף המדיום עם 10 מ"ל של בידול טרי בינוני 3 פעמים בשבוע (בימי שני, רביעי ושישי) למשך 2.5-3 השבועות. בדוק את התאים באופן קבוע עבור הופעתה של מורפולוגיה אפיתל הנכון באמצעות מיקרוסקופ לעומת זאת שלב.
  4. שלב III: הקפאה-בנקאות, נגזר hPSC LESCs
    1. לחמם כל החומרים הדרושים, ריאגנטים RT בשכונה זרימה שכבתית, חוץ המדיום הקפאה קריוגנית זה אמור להיות צונן מראש.
    2. ניתוק נגזר hPSC LESCs עם נטול קסנו טריפסין-EDTA ולספור את התאים, כפי שהורו על FF hPSCs 1.3.2.1–1.3.2.6 צעדים, אבל באמצעות בידול בינוני.
      הערה: עבור hPSC, נגזר LESCs, זמן הדגירה אופטימלית עם נטול קסנו טריפסין-EDTA הוא ארוך יותר (כ- 5 דקות). השתמש 3 מ"ל של טריפסין-EDTA קסנו-חופשית, מעכבי טריפסין מוגדר לכל מנה 100 מ מ.
    3. לאחר ספירת תאי, צנטריפוגה חוזר עבור 5 דקות ב g 300 x, תשאף בינוני, resuspend בגדר תא hPSC מראש צוננת, קסנו ללא הקפאה קריוגנית בינוני. Pipet הסינגל תא ההשעיה לתוך cryotubes כך כל cryotube מכיל 0.5-1 x 10 תאים6 1 מ"ל הקפאה קריוגנית בינוני.
    4. למקם את הצינורות הקפאה מיכל העברה מיידית (תוך 5 דקות) עד-80 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    5. למחרת, העברת הצינורות חנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך.
  5. שלב IV: מפשיר את hPSC-LESCs cryopreserved
    1. לפני מפשיר, מעיל צלחות מנות/טוב עם 5 µg/cm2 col IV ו- 0.5 µg/ס מ2 LN-521.
    2. לחמם כל החומרים הדרושים, ריאגנטים RT בשכונה זרימה שכבתית.
    3. הסר את הפתרון ציפוי מנות/בארות ומוסיפים נפח מתאים של בידול מראש ומחוממת בינוני.
      הערה: אל תאפשר את הכלים לייבוש כמו LN-521 הפוך ללא פעיל בעת ייבוש.
    4. להפשיר את התאים במהירות ב RT ולהעביר מיד התליה תא שפופרת צנטרפוגה חרוט 15 מ"ל המכיל 5 מ של בידול מראש ומחוממת בינוני.
    5. Centrifuge התליה תא עבור 5 דקות ב 300 x g, מחוק לגמרי, resuspend בגדר אמצעי בידול כדי להסיר כל מדיום הקפאה קריוגנית.
    6. צלחת התאים אל מצופה 5 µg/cm2 col IV ו- 0.5 µg/cm2 LN-521, בידול בינוני-צפיפות של 40,000 – 50,000 תאים/cm2מנות/בארות. לשמור על התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, מחליף המדיום בידול שלוש פעמים בשבוע.

3. phenotyping של LESCs hPSC, נגזר

  1. ניתוח איכותי immunofluorescence
    1. עבור immunofluorescence, מעיל 24 או 12-ובכן בארות צלחת עם 5 µg/cm2 col הרביעי ו 0.5 µg/cm2 LN-521, צלחת/ההפשרה hPSC-LESCs בידול בינוני-צפיפות של 40 000 000 – 50 תאים/ס מ2.
    2. כאשר התרבויות הגיעו confluency, לתקן את התאים עם 4% paraformaldehyde (PFA): דגירה 15-20 דקות עם 4% וקונטה הבארות פעמיים עם x DPBS 1 ללא Ca2 + ו- Mg2 +מחברים ב- RT. לאחר מכן, לשטוף פעמיים עם x DPBS 1 כדי להסיר שאריות כל כדורגלן. שימוש 0.5-1 מ של פתרונות לכל טוב.
      הערה: תאים קבוע ניתן לאחסן ב- x DPBS 1-4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע לפני צביעת.
      התראה: PFA הוא רעיל, מאכל. להתמודד עם כדורגלן בשכונה fume וללבוש בגדי מגן הגנה העין, כפפות.
    3. האחות 1 x DPBS, permeabilize את קרום התא על ידי המקננת למשך 10-15 דקות עם 0.1% טריטון X-100 ב 1 x DPBS.
    4. האחות 0.1% טריטון X-100 של רחוב נוגדן ספציפי אתרי קישור על-ידי המקננת לשעה עם 3% שור אלבומין (BSA) ב- x DPBS 1-הכן RT. דילולים נוגדן ראשוני ב- 0.5% BSA ב 1 x DPBS.
      הערה: ראה טבלה 1 נוגדנים העיקרית המומלצת.
    5. האחות BSA 3%, דגירה עם נוגדן העיקרי מדולל כראוי בין לילה ב 4 º C.
    6. לשטוף את הבארות 3 x עבור 5 דקות עם 1 x DPBS. להכין נוגדן משני דילולים ב- 0.5% BSA ב 1 x DPBS.
      הערה: ראה טבלה 1 מומלץ נוגדנים משניים.
    7. האחות 1 x DPBS, דגירה עם נוגדנים משניים מתאים, מדולל כראוי עבור h 1-RT, מוגן מפני אור.
      הערה: מהשלב הזה על, שומרים את הדגימות מוגן מפני אור כדי למנוע דהייה של צבעי פלורסנט.
    8. לשטוף את הבארות 3 x עבור חמש דקות עם 1 x DPBS, ולבסוף counterstain גרעינים עם 4' 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי), הר עם פלורסצנטיות הרכבה מדיה. דאפי ניתן להשתמש בנפרד בהתאם להוראות היצרן או כלול המדיום הרכבה. המקום לעגל coverslips (בקוטר 19 מ מ ו- 13 מ מ במשך 12-24 טוב צלחות, בהתאמה) כל היטב. בצע הוראות היצרן לגבי ייבוש והאחסון של הדגימות הנטען.
    9. תמונה התאים ויטראז'ים עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
  2. ניתוח כמותי immunofluorescence
    1. להכין דוגמאות cytospin של LESCs hPSC, נגזר על אובייקט משקפיים.
      1. ניתוק נגזר hPSC LESCs עם נטול קסנו טריפסין-EDTA ולספור את התאים, כפי שהורה בשלב 2.4.2.
      2. לאחר ספירת, להוסיף x DPBS 1 טרום מקורר, צנטריפוגה למשך 5 דקות ב x 300 ג' התאם האחסון מדגם וריכוז תא לפי הוראות היצרן של cytocentrifuge נתון, למשל 50,000 – 100,000 תאים נפח דגימה של 150 µL.
      3. לסובב תאים אל אובייקט משקפיים עם cytocentrifuge למשל 5 דקות בגיל 28 x g ותיקון מיידי עבור 15-20 דקות עם 4% מחברים ב- x DPBS 1-RT. על הזמן המומלץ ספינינג ועל מהירות, להפנות ספר ההדרכה של cytocentrifuge נתון.
    2. המשך מכתימה את הדגימות cytospin כפי שמתואר צעדים 3.1.3–3.1.8 שימוש בעט חוסם נוזלי כדי להקיף את הדגימות עם מעגל הידרופובי ולנהל ההכתמה ב- droplet לאימון חסכוני. ניתן לבצע שוטף במיכליות עם מחזיקי שקופיות, על מנת להבטיח הסרת יעיל של עודף נוגדנים, צביעת רקע מינימלי. Counterstain גרעינים עם דאפי והר הדגימות ויטראז'ים עם פלורסצנטיות הרכבה מדיה, כיסוי עם coverslips. בצע את הוראות היצרן לגבי ייבוש והאחסון של הדגימות הנטען.
    3. לכידת תמונות 5 – 10 לכל דגימה ממיקומים שנבחרו באקראי באמצעות למשל 10 X ההגדלה של מיקרוסקופ זריחה.
    4. להעריך את אחוז כדוריות מוכתם באופן חיובי ביחס הכולל (דאפי חיובי) למשל עם כלי תוכנה (https://imagej.nih.gov/ij/) ImageJ עיבוד תמונה, ניתוח. רצוי לנתח > 500 תאים עבור דגימה.
      1. פתחו את התמונה כדי להיות מנותח בתוכנת ImageJ. לשכפל את התמונה ואת מסנן עם טשטוש לפי עקומת גאוס ברירת המחדל כדי להסיר את הרעש.
      2. צור סף. התאימו את ערכי סף לבחירה אופטימלית של גרעין התא מוכתם באופן חיובי, ולהחיל. עכשיו מומר לתמונה המשוכפלת מנוף הבינאריים.
      3. תהליך תמונה בינארי עם עיבוד בינארי כלי "מילוי חורים" ו- "פרשת", אשר באופן אוטומטי יפריד באזורים הממוזגים המייצג גרעינים יחיד.
      4. השתמש בכלי 'ניתוח חלקיקים' באופן אוטומטי רשימת אזורים תיירותיים (ROIs) אל חלון מנהל רועי, יפתח על החלת הפקודה ' '. סגור את התמונה בינארי.
      5. דמיינו את ROIs בתמונה המקורית באמצעות בחירה באפשרות 'הצג כל' במנהל ROI. לאשר את הבחירה הנכונה של גרעין התא מוכתם, במידת הצורך, באופן ידני להסיר ולהוסיף בחירות הפרט.
  3. ניתוח cytometry זרימה
    1. כדי לאשר את רמות ביטוי p63α, מכתים את התאים עבור cytometry זרימה.
      1. ניתוק נגזר hPSC LESCs עם נטול קסנו טריפסין-EDTA ולספור את התאים, כפי שהורה בשלב 2.4.2.
      2. שטיפת התאים פעמיים עם 1 מ"ל טרום מקורר 1 x DPBS צנטריפוגה למשך 5 דקות ב x 300 ג תיקון ו permeabilize עם פתרון מוכן לשימוש פיקסציה/permeabilization עבור 20 דקות ב 4 º C. לאחר מכן תשטוף התאים פעמיים עם 1 מ"ל מראש צונן 1 x permeabilizing מאגר לשטוף.
        הערה: מהשלב הזה על, שמור את התאים ב 4 ° C או על קרח, אלא אם צוין אחרת.
      3. התראה: פתרון פיקסציה/permeabilization מכילה פורמלדהיד 4.2%. להתמודד עם הפתרון מסוכנים בשכונה fume וללבוש בגדי מגן הגנה העין, כפפות.
      4. לחלק דוגמיות צינורות פוליפרופילן 5 מ. כל מדגם צריך להכיל 100,000 – 200,000 תאים, האחסון מדגם צריך להתאימו כך כ 100 µL 1 x מאגר לשטוף.
      5. להוסיף 2 µL של fluorochrome מצומדת p63-α FACS נוגדנים (נוגדן המומלצת, ראו טבלה של ציוד וחומרים) לתוך הצינורות הדגימה. להשאיר דוגמא אחת מוכתם לשמש בקרה שלילית. מערבולת הדגימות ואת תקופת דגירה של h 1-RT, מוגן מפני אור.
      6. רוחצים את התאים פעמיים עם 1 מ"ל של טרום מקורר 1 x מאגר לשטוף את לבסוף, resuspend כדורי עם 300 µL של המאגר. מאחסנים הצינורות בקרח, מוגן מפני אור.
    2. לנתח את הדגימות עם cytometer זרימה. להשתמש המדגם מוכתם בקרה שלילית עבור gating מהאוכלוסייה התא הנכון, למעט האות רקע פלורסנט. לנתח למינימום של 10,000 p63-α-צבעונית תאים. לצורך יישום טכני מפורט, נא עיין במדריך המשתמש של cytometer זרימה נתונה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מ hPSCs ל hPSC-LESCs

התהליך כולו של גרימת הבידול של FF hPSCs כדי cryostoring hPSC-LESCs לוקח בסביבות 3.5 שבועות. סקירה סכמטי של השיטה בידול המדגיש את השלבים החשובים שלה מוצג איור 1A. איור 1B מראה אופייני מורפולוגיות של אוכלוסיות תאים בשלבים שונים של הפרוטוקול. הנתונים המוצגים מתקבלים עם Regea08/017 hESC קו וקו UTA.04607.WT hiPSC, נגזר והן מאופיין ב אוניברסיטת טמפרה, פינלנד...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התוצאה הצפויה של פרוטוקול זה הוא מוצלח וחזק הדור של LESCs של השעיה תא בודד של FF hPSC בתוך כ- 3.5 שבועות. ככל אפיתל הקרנית מתפתח מן השטח האאקטודרם29, השלב הראשון של הפרוטוקול שמטרתה היגוי hPSCs לכיוון הזה השושלת. אינדוקציה קצר 24 שעות ביממה עם הפיכת גורם הגדילה בטא (TGF-β) אנטגוניסט SB-505124, bFGF משמשים כדי ליצור בידול ectodermal, ואחריו הסימן BMP-4 mesodermal 48 שעות כדי לדחוף את התאים לכיוון האאקטודרם משטח. השלב הבא בידול חסיד ב- col IV/LN-521 שילוב מטריקס יחד עם בידול מוגדרים כימי בינוני משמש...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחקר נתמך על ידי האקדמיה של פינלנד (מענק מס ' 297886), התוכנית חלקי חילוף של Tekes, הסוכנות קרנות פינית עבור טכנולוגיה וחדשנות, העין פינית, קרן בנק רקמות, קרן התרבות הפינית. המחברים תודה את טכנאי מעבדות ביו Outi Melin, חנה Pekkanen, אמה Vikstedt ו- Outi Heikkilä עבור תרומה תרבית תאים וסיוע טכני מעולה. פרופסור Katriina אלטו-Setälä הוא הודה למתן להשתמש hiPSC קו של BioMediTech הדמיה הליבה מתקן לאספקת ציוד הדמיה זריחה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<חזק>חומר/מגיב
1x DPBS המכיל Ca2+ ו-Mg2+Gibco#14040-091
1x DPBS ללא Ca2+ ו-Mg2+Lonza#17-512F/12
צלחת תרבית תאים 100 מ"מCorningCellBIND#3296פורמט כלי תרבית ל-hPSC-LESC דבק בידול
צלחת 12 בארותCorningCellBIND#3336פורמט כלי תרבות עבור דגימות IF
צלחת 24 בארותCorning CellBIND#3337פורמט כלי תרבות עבור דגימות IF
2-mercaptoethanolGibco#31350-010
צלחת 6 בארות, חיבור נמוך במיוחדCorning Costar#3471פורמט כלי תרבות לאינדוקציה בהשעיה תרבות
Alexa Fluor 488 נגד עכבר IgThermoFisher Scientific#A-21202נוגדן משני ל-IF
Alexa Fluor 488 אנטי-ארנב IgThermoFisher Scientific#A-21206נוגדן משני ל-IF
Alexa Fluor 568 אנטי-עז IgThermoFisher Scientific#A-11057נוגדן משני ל-IF
Alexa Fluor 568 אנטי-עכבר IgThermoFisher Scientific#A-10037נוגדן משני
לגורם גדילה פיברובלסטים בסיסי (bFGF, אנושי)PeproTech Inc.#AF-100-18BFGF אנושי רקומביננטי ללא בעלי חיים (154 a.a.)
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization SolutionBD Biosciences#554722פתרון קיבוע וחדירה לזרימה ציטומטריית
BD Perm/Wash BufferBD Biosciences#554723מאגר כביסה לזרימה ציטומטריה
BlebbistatinSigma-Aldrich#B0560
חלבון מורפוגנטי בעצם 4 (BMP-4)PeproTech Inc.#120-05A
אלבומין בסרום בקר (BSA)Sigma-Aldrich#A8022-100G
נוגדן ציטוקרטין 12Cruz Biotechnology#SC-17099נוגדן ראשוני ל-IF
Cytokeratin 14 נוגדןR& D Systems#MAB3164נוגדן ראשוני
לנוגדני IF Cytokeratin 15ThermoFisher Scientific#MS-1068-Pנוגדן ראשוני ל-IF
CnT-30CELLnTEC Advanced Cell Systems AG#Cnt-30מדיום תרבית להתמיינות hPSC-LESC דבק
קולגן מסוג IV (אנושי)סיגמא-אולדריץ'#C5533קולגן שליה אנושית מסוג IV
CoolCell LX מיכל הקפאהSigma-Aldrich#BCS-405
צינורות CryoPureSarsted#72.3801.6 מ"ל Cryotube לשימור הקפאה hPSC-LESC
מעכב טריפסין מוגדרGibco#R-007-100
Essential 8 Flex Medium KitThermo Fisher Scientific#A2858501
GlutaMAXGibco#35050061
למינין 521ביולמינה#Ln521למינין רקומביננטי אנושי 521
ודלתא; Np63 ואלפא; נוגדןBioCare Medical#4892נוגדן ראשוני לנוגדנים IF
OCT3/4R& D Systems#AF1759נוגדן ראשוני ל-IF
p63 ואלפא; טכנולוגייתאיתות תאי#ACI3066Aנוגדן ראשוני ל-IF
p63-ואלפא; (D2K8X) XP ארנב mAb (מצומד PE)טכנולוגיית איתות תאים#56687p63-α נוגדן מצומד PE לזרימה ציטומטרית
נוגדן PAX6סיגמא-אולדריץ'#HPA030775נוגדן ראשוני ל-IF
פניצילין/סטרפטומיציןלונזה#17-602E
פרפורמלדהיד (PFA)סיגמא-אולדריץ'#158127קיבוע תאים ל-IF
ProLong Gold Antifade Mountant עם DAPIThermo Fisher Scientific#P36931תושבת DAPI לקשיח הרכבה לערכת
שימור הקפאה IF PSCThermo Fisher Scientific#A2644601
TrypLE Select EnzymeGibco#12563-011
KnockOut Dulbecco' s שונה Eagle' s mediumGibco#10829018
KnockOut SR XenoFree CTSGibco#10828028
MEM חומצות אמינו לא חיוניותGibco#11140050
SB-505124Sigma-Aldrich#S4696
Triton X-100Sigma-Aldrich#T8787חומר חדירות עבור IF
VectaShieldVector Laboratories#H-1200DAPI תושבת להרכבה נוזלית עבור IF
strong>שם<strong>חברהCatalog NumberComments
Equipment
Cytocentrifuge, e. CellSpin IITharmac
ציטומטר זרימה, למשל BD Accuri C6BD Biosciences
מיקרוסקופ פלואורסצנטי, e.g.Olympus IX 51Olympus
Santa נוגדנים<

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dua, H. S., Shanmuganathan, V. A., Powell-Richards, A. O., Tighe, P. J., Joseph, A. Limbal epithelial crypts: a novel anatomical structure and a putative limbal stem cell niche. The British Journal of Ophthalmology. 89 (5), 529-532 (2005).
  2. Yazdanpanah, G., Jabbehdari, S., Djalilian, A. R. Limbal and corneal epithelial homeostasis. Current Opinion in Ophthalmology. 28 (4), 348-354 (2017).
  3. Di Iorio, E., Barbaro, V., Ruzza, A., Ponzin, D., Pellegrini, G., De Luca, M. Isoforms of DeltaNp63 and the migration of ocular limbal cells in human corneal regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 9523-9528 (2005).
  4. Rama, P., Matuska, S., Paganoni, G., Spinelli, A., De Luca, M., Pellegrini, G. Limbal stem-cell therapy and long-term corneal regeneration. The New England Journal of Medicine. 363 (2), 147-155 (2010).
  5. Notara, M., et al. In sickness and in health: Corneal epithelial stem cell biology, pathology and therapy. Experimental Eye Research. 90 (2), 188-195 (2010).
  6. Osei-Bempong, C., Figueiredo, F. C., Lako, M. The limbal epithelium of the eye--a review of limbal stem cell biology, disease and treatment. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 35 (3), 211-219 (2013).
  7. Kolli, S., Ahmad, S., Lako, M., Figueiredo, F. Successful clinical implementation of corneal epithelial stem cell therapy for treatment of unilateral limbal stem cell deficiency. Stem Cells. 28 (3), 597-610 (2010).
  8. Sangwan, V. S., et al. Clinical outcomes of xeno-free autologous cultivated limbal epithelial transplantation: a 10-year study. The British Journal of Ophthalmology. 95 (11), 1525-1529 (2011).
  9. Basu, S., Mohan, S., Bhalekar, S., Singh, V., Sangwan, V. Simple limbal epithelial transplantation (SLET) in failed cultivated limbal epithelial transplantation (CLET) for unilateral chronic ocular burns. The British Journal of Ophthalmology. , (2018).
  10. Ahmad, S., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into corneal epithelial-like cells by in vitro replication of the corneal epithelial stem cell niche. Stem Cells. 25 (5), 1145-1155 (2007).
  11. Hanson, C., et al. Transplantation of human embryonic stem cells onto a partially wounded human cornea in vitro. Acta Ophthalmologica. 91 (2), 127-130 (2013).
  12. Hayashi, R., et al. Generation of corneal epithelial cells from induced pluripotent stem cells derived from human dermal fibroblast and corneal limbal epithelium. PLoS ONE. 7 (9), e45435(2012).
  13. Hewitt, K. J., Shamis, Y., Carlson, M. W., Aberdam, E., Aberdam, D., Garlick, J. A. Three-dimensional epithelial tissues generated from human embryonic stem cells. Tissue Engineering. Part A. 15 (11), 3417-3426 (2009).
  14. Shalom-Feuerstein, R., et al. Pluripotent stem cell model reveals essential roles for miR-450b-5p and miR-184 in embryonic corneal lineage specification. Stem Cells. 30 (5), 898-909 (2012).
  15. Cieslar-Pobuda, A., et al. Human induced pluripotent stem cell differentiation and direct transdifferentiation into corneal epithelial-like cells. Oncotarget. 7 (27), 42314-42329 (2016).
  16. Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nature Biotechnology. 24 (2), 185-187 (2006).
  17. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  18. Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521-based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nature Protocols. 9 (10), 2354-2368 (2014).
  19. Mikhailova, A., Ilmarinen, T., Uusitalo, H., Skottman, H. Small-molecule induction promotes corneal epithelial cell differentiation from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 2 (2), 219-231 (2014).
  20. Martinez Garcia de la Torre, R. A., Nieto-Nicolau, N., Morales-Pastor, A., Casaroli-Marano, R. P. Determination of the Culture Time Point to Induce Corneal Epithelial Differentiation in Induced Pluripotent Stem Cells. Transplantation Proceedings. 49 (10), 2292-2295 (2017).
  21. Zhang, C., Du, L., Pang, K., Wu, X. Differentiation of human embryonic stem cells into corneal epithelial progenitor cells under defined conditions. PLoS One. 12 (8), e0183303(2017).
  22. Aberdam, E., Petit, I., Sangari, L., Aberdam, D. Induced pluripotent stem cell-derived limbal epithelial cells (LiPSC) as a cellular alternative for in vitro ocular toxicity testing. PLoS One. 12 (6), e0179913(2017).
  23. Kamarudin, T. A., et al. Differences in the Activity of Endogenous Bone Morphogenetic Protein Signaling Impact on the Ability of Induced Pluripotent Stem Cells to Differentiate to Corneal Epithelial-Like Cells. Stem Cells. 36 (3), 337-348 (2018).
  24. Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nature Communications. 5, 3195(2014).
  25. Hongisto, H., Ilmarinen, T., Vattulainen, M., Mikhailova, A., Skottman, H. Xeno- and feeder-free differentiation of human pluripotent stem cells to two distinct ocular epithelial cell types using simple modifications of one method. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 4(2017).
  26. Skottman, H. Derivation and characterization of three new human embryonic stem cell lines in Finland. In vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 46 (3-4), 206-209 (2010).
  27. Ahola, A., Kiviaho, A. L., Larsson, K., Honkanen, M., Aalto-Setälä, K., Hyttinen, J. Video image-based analysis of single human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocyte beating dynamics using digital image correlation. Biomedical Engineering Online. 13, 39(2014).
  28. Ojala, M., et al. Mutation-Specific Phenotypes in hiPSC-Derived Cardiomyocytes Carrying Either Myosin-Binding Protein C Or α-Tropomyosin Mutation for Hypertrophic Cardiomyopathy. Stem Cells International. 2016, 1684792(2016).
  29. Ali, R. R., Sowden, J. C. Regenerative medicine: DIY eye. Nature. 472 (7341), 42-43 (2011).
  30. International Stem Cell Initiative,, et al. Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage. Nature Biotechnology. 29 (12), 1132-1144 (2011).
  31. Foster, J. W., Wahlin, K., Adams, S. M., Birk, D. E., Zack, D. J., Chakravarti, S. Cornea organoids from human induced pluripotent stem cells. Scientific Reports. 7, 41286(2017).
  32. Susaimanickam, P. J., et al. Generating minicorneal organoids from human induced pluripotent stem cells. Development. 144 (13), 2338-2351 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Corneal Limbal Epithelial Stem CellsHuman Pluripotent Stem CellsDirected DifferentiationXeno Free CultureFeeder Cell FreeLaminin 521 Collagen IVEmbryoid Body FormationSurface Ectodermal InductionAdherent DifferentiationCryopreservation

Related Articles