מאמר שיטה

חיתוך ושיטת צף בשביל לרקמות פרפין-מוטבע על חלוקתה

DOI:

10.3791/58288

⸱

5 בספטמבר 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Life Science, Nanchang University, 2Queen Mary School, Medical Department, Nanchang University, 3School of Life Science, Nanchang University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לשפר את חלוקתה פרפין. שיטה זו משלבת חיתוך צף באמצעות תא תרמוסטטי פשוטות כדי למנוע את תהליך ההעברה הנדרש על-ידי השיטה המקובלת. כתוצאה מכך, את היעילות ואת מספר קטעים שלמים פרפין היו השתפרה מאוד.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חלוקתה של הרקמה פרפין-מוטבע הוא בשימוש נרחב כיום מגוון של פתולוגיה. עם זאת, מייגע. כדי לשפר את שיטה זו, מספר חברות מסחריות פיתחו מערכות העברת מקטע מורכבים באמצעות מים נוזלים. כדי לפשט את הטכנולוגיה הזאת, יצרנו שיטה פשוטה באמצעות ציוד ביתי המשלב הביתור ועל צף בתוך תא תרמוסטטי פשוטה; לכן, הסעיפים להזין באופן אוטומטי את המים הרותחים על פני המים. ההיפוקמפוס מוח העכבר למבוגרים, העכבר למבוגרים כליות, מוח העכבר מתחלקים, עיניים למבוגרים דג זברה נחתכו באמצעות חלוקתה הפרפין קונבנציונליים והן בשיטת הציג להשוואה. ניתוח סטטיסטי מראה שיפור השיטה שלנו הזמן שנחסך המיוצר חלקים באיכות גבוהה יותר. בנוסף, פרפין חלוקתה של הדגימה כל תוך זמן קצר קל עבור מפעילי ג'וניור.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר מורפולוגי חשוב במחקר הביולוגי. למרות הטכנולוגיה החדשה אפשרה לחוקרים לבחון את המטרות שלהם ישירות מן כל רקמות או אורגניזמים1,2,3, חיתוך הדגימה למקטעים דק, ואחריו מכתים, נשאר הראשית מורפולוגיה של רקמות היחיד של שיטה ולא לקחת כסף אבל גם חלבון מיקוד ישירות בתוך הרקמה. מיקרוסקופ אור עושה שימוש בשלושה סוגי המקטעים: פרפין, מוקפאים, ולא semithin. למרות cryosectioning נפוץ להגנה על רקמות antigenicity, הכנת הדגימה היא פשוטה, המורפולוגיה רקמות יתרת הוא עני, מצוייה דק אופטים4,5. פרפין חלוקתה היא השיטה השכיחה בתערוכה מורפולוגיה השתמרה היטב. דגימות הן מיובשת לגמרי, המוטבעות שעווה, ניתן לאחסן את אבני פרפין ללא הגבלת זמן. בנוסף, פרפין חלוקתה מייצרת חלקים דקים לשפר את הגישה בדיקה ביולוגית בניסויים נוספים ולהפחית תא כיסוי שכבת בכיוון Z.

עם זאת, חלוקתה הפרפין קונבנציונליים הוא מייגע, דורש מיומנות מפעיל. פרפין מקטעים לעבור קיבוע התייבשות, הטבעה, חותכים, צף. חשוב, העברת סרטים סעיף מהמחזיק סכין לאמבט מים הוא הכרחי, אבל קשה עבור מפעילי ג'וניור. בעיקר אוויר יבש, הסרטים סעיף חשל עקב חשמל סטטי ולכן קשה נפרשים על פני מים חמים. כדי לשפר את סעיף איכות, הרטבה השטח חשוף רקמות בין מיקרוטום להב מעברים, קירור הבלוקים השעווה הטבעית אותם במי קרח, או העלאת הלחות עם מכשיר לחות ליד האזמל הקטן מומלץ6,7 . שיטות חדשות לשיפור פרפין חלוקתה כוללים היברידית הטבעה פרפין, cryosectioning8ו מחלקה מסחרית העברת מערכת סיוע9. למרות השיטות לשפר באופן חלקי פרפין חלוקתה מהירות ואיכות, הם גורמים חלוקתה הרבה יותר מסורבלת, מערכות העברת מקטע מסחריים יקרים.

ב פרוטוקול זה, נדגים כיצד ליצור פשוט, זול וגמיש ציוד צעד אחר צעד, אשר ניתן לחבר בעל להב מיקרוטום רוטרי. ציוד זה כולל ערוץ סעיף באמבט מים, תנור עם מתג זיהוי טמפרטורה. לאחר חיתוך, עשרות סעיפים לזרום לתוך הערוץ מדור והזן את המים הרותחים ישירות, ובכך התגלגלות באופן אוטומטי. זה משפר את היעילות של פרפין חלוקתה, הופך את הטכנולוגיה הזו נוחה יותר. שימוש זו שיטה, הבוגרים יותר בעכבר מקטעים בהיפוקמפוס, העכבר למבוגרים כליות מקטעים, עובריים 15.5 מיושן (E15.5) העכבר המוח, ומקטעים עין דג זברה בוגרת מקטעים היו קוצרים בפחות זמן, נשארה יותר מורפולוגית. שיטה זו יכולה לשמש גם עבור דגימות רקמה אחרים הדורשים פרפין מואצת חלוקתה תוך הימנעות איבוד ההבחנה סעיף.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי חיה על עצמך ועל שימוש הוועדה של אוניברסיטת נאנצ'אנג.

1. להרכיב את הציוד ולחבר את האזמל הקטן

  1. עיצוב הפרמטר לפי הדרישות (Supplementary איור 1).
  2. להגיש את הפרמטר במפעל מקומי לייצור לוחות אקריליק.
  3. להרכיב את כל החלקים ברצף: שימוש בכלורופורם לשילוב 7 לוחות אקריליק מסחריים לתוך טנק עם סעיף ערוץ ומים אמבטיה (איור 1).
    התראה: כלורופורם מייצר חומרים רעילים כאשר היא עונה אור וחמצן. להרכיב את המנגנון בשכונה fume.
  4. התקנת הרכיב חשמליים דרך החור בלוח אקריליק #1 (איור 2 א, ראש חץ).
  5. כדי להתקין את בקר טמפרטורה, ליצור חור קטן על הלוח אקריליק #2 באמצעות מקדחה חשמלית, ולהתקין גלאי טמפרטורה (איור 2 א, חץ). להתקין תרמוסטט דיגיטלית על הטנק (איור 2 א).
    הערה: גלאי טמפרטורה צריך להיות בתוך 1 ס מ מתחת לפני המים.
  6. כדי לספק גישה כוח, להתאים את המתח מתחת 24 V לפני הפעלת הציוד.
  7. הסר את המגש פסולת סעיף האזמל הקטן.
  8. קישור התעלה מקטעים עם בעל להב מיקרוטום עם איטום סיליקון ניטראלי (איור 2B).
    הערה: לא ימרחו כלשהו איטום סיליקון ניטראלי מעל החלק העליון של הלהב כך הלהב הישן מוחלף בקלות.
  9. יבש לילה כדי לאפשר את הכלורופורם ואת הזמן איטום סיליקון ניטראלי לגבש.
  10. התקן את הלהב בעל להב. יוצקים מים לאמבט המים (איור 2C). פני המים צריך רק לגעת העליון של הלהב (ראש חץבאיור 2D, ).

2. פרפין חלוקתה

הערה: פסולת לצבור לעיתים קרובות על הקצה העליון או התחתון של הרחוב שעווה, פני המים. יש לנקות את הלכלוך הזה באופן קבוע.

  1. לבצע הפרפין קונבנציונליים חלוקתה10.
    1. תהדק את הדגימה פרפין-מוטבע על מיקרוטום סיבוביים ולמקם את הלהב בעל להב.
    2. להפוך את handwheel, סעיף הדגימה.
    3. העברת הכלים פרפין למחלקה לאמבט מים חמים 38.5 מעלות צלזיוס.
    4. לאסוף שהסעיפים אל המיקרוסקופ שקופית של פני המים לאחר התגלגלות.
    5. יבש את השקופיות בתנור ב 42 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  2. פרפין משופרת חלוקתה (איור 3)
    1. הפעל את הציוד.
    2. לפתוח את התנור עם מתג זיהוי טמפרטורה ולהגדיר את הטמפרטורה יישוב בין C º 38.0 40.0 מעלות לשעה מראש לחמם את המים.
    3. לשנות לבלוק פראפין שרכשה פרפין להטביע; אז במקום לבלוק פראפין על המלחציים קלטת של מיקרוטום ונעל אותה.
      הערה: גבולות לכוחו של הרחוב פרפין צריך להיות שונה בצורה אופקית כדי למנוע רצועת סעיף מ ויוצרים קשת ולהיות מסוגלים לזרום דרך ערוץ קטעים צרים.
    4. במהירות הגישה המדגם על ידי חיתוך להקשיה.
    5. התאם בעובי סעיף מתאים (10 מיקרומטר מוח העכבר למבוגרים, למבוגרים העכבר הכליות של העובר מוח העכבר, 4 מיקרומטר לעיניים דג זברה). להפוך את handwheel ואת הסעיפים יזין באופן אוטומטי את המקטעים ערוץ ואמבט.
    6. בסעיף הדגימה במשיחה חיתוך איטית ואחידה (איור 3 א).
      הערה: Thethickness של המקטע הראשון תשונה לאחר handwheel הופסק למשך מספר דקות. יש להחליף את הלהבים חד פעמי כאשר הסעיפים יש שריטות רצופים.
    7. מדריך הסעיפים לחדר אמבטיה לצוף בקו (איור 3B, ג 3).
      הערה: אם שבאזור head לאנאפוליס הקיר קאמרית, השתמש מדריך מברשת לשמור אותו צף.
    8. דבקים סעיפים על גבי שקופיות מיקרוסקופ. לאחר הסעיפים לחלוטין נפרשים באמבט מים, מספר מקטעים נפרדים עם פינצטה. אז להרים מהאמבטיה מים על גבי שקופיות מיקרוסקופ (דמות תלת-ממד).
      הערה: סעיפים יש לאסוף מן הצד האחורי של האמבט במים, כמו אלה בערוץ חלקים, החלק הפנימי. של האמבטיה מים לא עדיין יהיה מלא פרש.
    9. יבש את השקופיות על-ידי הצבתם בתנור 42 º C למשך הלילה. השקופיות ואז ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר ללא הגבלת זמן.
  3. השתמש Hematoxylin-אאוזין (HE) צביעת לצורך הערכה של שיטה משופרת8.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השיטה משופרת גדל מספר קטעים שלמים פרפין. בדקנו שיטה חדשה על רקמות בהיפוקמפוס העכבר למבוגרים, העכבר למבוגרים כליות, מוח העכבר מתחלקים עיני דג זברה. מים נוסף למיכל, טמפרטורת המים נשמר בין 38.0 ° C עד 40.0 מעלות צלזיוס. לאחר באופן סדרתי הכנת את דגימות הרקמות, היו למחלקה, בהשוואה חלוקתה קונבנציונלי. השיטה החדשה נמנע מקטע הפסד והגדילה את הפרופורציה של מקטעים שלמים העכבר למבוגרים ההיפוקמפוס, העכבר למבוגרים כליות, מוח העכבר E15.5, ובעיניים דג זברה למבוגרים (איור 4A<...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי לשפר מורפולוגיה סעיף פרפין לפתור את הבעיה של זמן מבוזבז במהלך הפרפין קונבנציונליים חלוקתה, יצרנו של פרפין משופרת חלוקתה שיטה המשלבת חיתוך התגלגלות. שיטה משופרת זו מסתמכת על ציוד פשוטה שכוללת ערוץ סעיף, אמבט מים, תנור עם מתג זיהוי טמפרטורה. הכלים סעיף נכנס לאמבט מים דרך ערוץ סעיף, מתגלה באופן אוטומטי בעת גזירה. לכן, בשיטה זו משפרת את הפרפין חלוקתה איכות ויעילות, אשר אומתה באמצעות פרפין חלוקתה של העכבר למבוגרים ההיפוקמפוס, העכבר למבוגרים כליות, מוח העכבר E15.5, והעיניים דג זברה למבוגרים.

כדי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים יש פטנט על התקן זה והצהר אין אינטרסים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי נבחרת מדעי הטבע קרן של סין (מענק מס 31400936, 31460260), את מדעי הטבע קרן של ג'יאנגשי פרובינציה של סין (20171BAB215020). אנו מודים גם את תוכנית משותפת בין אוניברסיטת נאנצ'אנג המלכה מרי אוניברסיטת לונדון לתמיכה עבודה זו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
חממתBoekel Scientific133000-2
אתנול סינופארם ריאגנט כימי ושות', מכסה64-17-5
קסילן Sinopharm Chemical Reagent Co., מכסה1330-20-7
ParaplastLeica39601006
מודול הטמעת פרפין מחומםLeica
לוח
TrichloromethaneSinopharm Chemical Reagent Co., מכסה67-66-3
גוף חימום חשמלי צינורי (12 V 200 W)
בקר טמפרטורה (12 וולט 120 וואט)MingsuoXH-W3002
מיקרוטום סיבובי של Leica
קשר את תעלת המים עם מחזיק סכין המיקרוטום
BA-4025
אאוזין בסו דיאגנוסטיקס בע"מBA-4025
MicroslideSail Brand7105
ניטרלי BalsamSinopharm Chemical Reagent Co., מכסה10004160
Coverslip Citoglas10212424C
מיקרוסקופCarl Zeiss
חומצה הידרוכלוריתXilong Chemical7647-01-0
אמבט מים לקטעי פרפיןLeica
HistoCore Arcadia C - תרסיסLeica
 תרמו סיינטיפיק9990420
אקרילי מסחריאיטום סיליקון ניטרלי שנאי מתח Dearll S-250-12 להב חד פעמי Accu-Edge 4689 Hematoxylin Baso Diagnostics Inc. דוחה פרפין Plate

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
  2. Fujita, S. Analysis of neuron differentiation in the central nervous system by tritiated thymidine autoradiography. Journal of Comparative Neurology. 122 (3), 311-327 (1964).
  3. Mironov, V., Boland, T., Trusk, T., Forgacs, G., Markwald, R. R. Organ printing: Computer-aided jet-based 3D tissue engineering. Trends in Biotechnology. 21 (4), 157-161 (2003).
  4. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Cryosectioning tissues. Cold Spring Harbor Protocols. 3 (8), (2008).
  5. Viebahn, C., Luttenberg, H. P. A modified anti-roll plate as a remedy for the ill-effects of electrical charge during cryosectioning. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 37 (7), 1157-1160 (1989).
  6. Onozato, M. L., Hammond, S., Merren, M., Yagi, Y. Evaluation of a completely automated tissue-sectioning machine for paraffin blocks. Journal of Clinical Pathology. 66 (2), 151-154 (2013).
  7. Sabaliauskas, N. A., et al. High-throughput zebrafish histology. Methods. 39 (3), 246-254 (2006).
  8. Chen, T. K., et al. Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples. Journal of Visualized Experiments. (117), e54754(2016).
  9. Kucherenko, M. M., et al. Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles. Journal of Visualized Experiments. (46), e2438(2010).
  10. Cornell, W. C., et al. Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis. Journal of Visualized Experiments. (133), e57196(2018).
  11. Whiteland, J. L., et al. Immunohistochemical detection of T-cell subsets and other leukocytes in paraffin-embedded rat and mouse tissues with monoclonal antibodies. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (3), 313-320 (1995).
  12. Tucker, D. K., Foley, J. F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification. Journal of Visualized Experiments. (125), e55796(2017).
  13. Venegas-Pino, D. E., Banko, N., Khan, M. I., Shi, Y., Werstuck, G. H. Quantitative Analysis and Characterization of Atherosclerotic Lesions in the Murine Aortic Sinus. Journal of Visualized Experiments. (82), e50933(2013).
  14. Lau, S. K., Chu, P. G., Weiss, L. M. CD163: A specific marker of macrophages in paraffin-embedded tissue samples. American Journal of Clinical Pathology. 122 (5), 794-801 (2004).
  15. Campbell-Thompson, M. L., Heiple, T., Montgomery, E., Zhang, L., Schneider, L. Staining Protocols for Human Pancreatic Islets. Journal of Visualized Experiments. (63), e4068(2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Paraffin SectioningTissue SectioningCutting Floating MethodWater Bath SectioningMicrotome SectioningSection Transfer SystemThermostatic ChamberSection Quality AnalysisHematoxylin Eosin StainingWhole Specimen Sectioning

מאמרים קשורים