Method Article

ללא תווית זיהוי של לימפוציטים יחוברו באמצעות הדמיה תלת פאזה כמותית, מכונת למידה

DOI:

10.3791/58305

⸱

November 19th, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physics, University of Cambridge, 2Department of Physics, Korea Advanced Institute of Science and Technology, 3KAIST Institute for Health Science and Technology, Korea Advanced Institute of Science and Technology, 4Tomocube, Inc., 5Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Korea Advanced Institute of Science and Technology, 6Department of Biological Sciences, Korea Advanced Institute of Science and Technology, 7Department of Applied Physics, Stanford University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים פרוטוקול לצורך זיהוי ללא תווית לימפוציט יחוברו באמצעות הדמיה שלב כמותיים באלגוריתם למידה חישובית. מדידות של-tomograms השבירה תלת-ממד של לימפוציטים להציג נתוני תלת-ממד מורפולוגי וביוכימי לתאים בודדים, אשר לאחר מכן ניתוח עם מכונת-learning אלגוריתם זיהוי סוגי תאים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נתאר כאן פרוטוקול לצורך זיהוי ללא תווית לימפוציט יחוברו באמצעות הדמיה כמותיים שלב למידה חישובית. זיהוי של סוגי לימפוציטים חשוב בחקר ואימונולוגיה וכן אבחון וטיפול במחלות שונות. כיום, בשיטות הרגילות לסיווג סוגי לימפוציטים להסתמך על תיוג חלבונים קרום ספציפי באמצעות תגובות אנטיגן-נוגדן. עם זאת, שיטות אלה תיוג לשאת הסיכונים הפוטנציאליים של סירוס ועיקור תאיים. הפרוטוקול המתואר כאן מתגבר על האתגרים הללו על ידי ניצול מהותי ניגודים אופטי נמדד על ידי הדמיה תלת פאזה כמותיים באלגוריתם למידה חישובית. מדידה של תלת-ממד מקדם שבירה (RI) tomograms של לימפוציטים מספק מידע כמותי אודות פנוטיפים של תאים בודדים ומורפולוגיה תלת-ממד. הפרמטרים biophysical מופק את tomograms רי 3D נמדד מכן נותחו באופן כמותי עם מכונת למידה אלגוריתם, הפעלת ללא תווית זיהוי סוגי לימפוציטים ברמה תא בודד. אנחנו מודדים את tomograms רי תלת-ממד של לימפוציטים B, CD4 + T ו CD8 + T ומזוהה שלהם סוגי תאים עם למעלה מ- 80% דיוק. ב פרוטוקול זה, אנו מתארים את השלבים המפורטים לימפוציט בידוד, הדמיה תלת-ממד שלב כמותית של למידה חישובית לזיהוי סוגי לימפוציטים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לימפוציטים ניתן לסווג תת השונים לרבות B, המסייע (CD4 +) T, ציטוטוקסיות (CD8 +) T ו- T רגולטורי תאים. לכל סוג של לימפוציט יש תפקיד אחר במערכת החיסון מסתגלת; לדוגמה, B לימפוציטים לייצר נוגדנים, ואילו לימפוציטים מסוג T לזהות אנטיגנים ספציפיים, לחסל תאים חריגים, לווסת B לימפוציטים. לימפוציט פונקציית רגולציה בחוזקה בשליטת ויש הקשורים במחלות שונות, כולל סרטן1, מחלות אוטואימוניות2זיהומים נגיפיים3. לפיכך, זיהוי סוגי לימפוציטים חשוב להבין תפקידיהם pathophysiological במחלות כגון ועבור חיסוני במרפאות.

כיום, שיטות לסיווג סוגי לימפוציטים להסתמך על תגובות אנטיגן-נוגדן על ידי מיקוד חלבוני ממברנה משטח מסוים או סמני פני שטח4. פילוח סמני פני השטח היא שיטה מדויקת כדי לקבוע סוגי לימפוציטים. עם זאת, זה דורש ריאגנטים יקר ונהלים גוזלת זמן. יתר על כן, הוא נושא הסיכונים של השינוי של מבנה החלבונים ממברנה משינוי של פונקציות הסלולר.

כדי להתגבר על האתגרים הללו, הפרוטוקול המתואר כאן מציג ללא תווית זיהוי סוגי לימפוציטים שלב כמותיים 3D הדמיה (ה-QPI) באמצעות מכונת למידה5. שיטה זו מאפשרת את סיווג סוגי לימפוציטים ברמה תא בודד בהתבסס על מידע מורפולוגי מופק ללא תווית הדמיה ממוחשבת של לימפוציטים בודדים. בניגוד קונבנציונאלי פלורסצנטיות טכניקות במיקרוסקופ, ה-QPI מנצל הפצות מקדם שבירה (RI) (מהותי התכונות האופטיות של תאים חיים ורקמות) כמו ניגודיות אופטי6,7. Tomograms רי של לימפוציטים בודדים מייצגים פנוטיפי מידע ספציפי יחוברו של לימפוציטים. במקרה זה, לנצל מערכתית tomograms רי תלת-ממד של לימפוציטים בודדים, אלגוריתם הלמידה המכונה תחת פיקוח היה מנוצל.

תוך שימוש בטכניקות שונות של ה-QPI, tomograms רי תלת-ממד של תאים באופן פעיל שימשו לחקר התא פתופסיולוגיה משום שהם מספקים ללא תווית, כמותיים הדמיה יכולת8,9,10, 11,12,13. בנוסף, חלוקות RI תלת-ממד של תאים בודדים יכול לספק מידע מורפולוגי, ביוכימי, ביו-מכני על תאי. Tomograms רי 3D כבר נעזרו בעבר בתחומי המטולוגיה14,15,16,17, מחלות זיהומיות18,19, 20, אימונולוגיה21, תא ביולוגיה22,23, דלקת24, סרטן25, מדעי המוח26,27, ביולוגיה התפתחותית28, טוקסיקולוגיה 29, מיקרוביולוגיה12,30,31,32.

למרות tomograms רי 3D לספק מידע מורפולוגי וביוכימי מפורט של תאים, הסיווג של לימפוציטים יחוברו קשה להשיג על-ידי פשוט הדמיה תלת-ממדית RI tomograms5. לנצל באופן שיטתי, באופן כמותי את tomograms רי 3D נמדד עבור סיווג סוג תא, אנחנו מנוצל באלגוריתם מכונת למידה. לאחרונה, יצירות אחדות דווח בשלב כמותיים אשר נותחו תמונות של תאים עם מכונת שונים לימוד אלגוריתמים33, כולל הגילוי של מיקרואורגניזמים34, סיווג של חיידקים סוג35 , 36, זיהוי מהיר, ללא תווית של נבגי אנתרקס37, אוטומטי ניתוח של תאי זרע38, ניתוח של סרטן תאים39,40, זיהוי של הפעלת מקרופאג41.

פרוטוקול זה מספק שלבים מפורטים לביצוע ללא תווית זיהוי סוגי לימפוציטים ברמת תא בודד באמצעות ה-QPI 3D ולמידה ממוחשבת. זה כולל: 1) לימפוציט בידוד מן העכבר דם, 2) לימפוציט מיון באמצעות זרימת cytometry, 3) תלת-ממד ה-QPI, 4) כמותית הדמיה של תלת-ממד tomograms רי ו 5) תחת פיקוח למידה לצורך זיהוי סוגי לימפוציטים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טיפול בבעלי חיים ונהלים ניסיוני בוצעו תחת האישור של הדאגה חיה מוסדיים שימוש הוועדה של KAIST (KA2010-21 KA2014-01, KA2015-03). כל הניסויים במחקר זה בוצעו בהתאם להנחיות שאושרו.

1. לימפוציט בידוד מהדם העכבר

  1. ברגע עכבר C57BL/6J הוא מורדמים באמצעות אינהלציה2 CO, להכניס מחט 26-G העכבר הלב ולאסוף 0.3 מ של דם. ישירות את הדם לתוך צינור עם 100 U/mL הפארין הפתרון מדולל עם 1 מ ל תמיסת באגירה פוספט (PBS).
    הערה: לחלופין, לימפוציטים מן הטחול יכול להיות מבודדים.
  2. Centrifuge את הצינור ב g x 400 דקות 5-4 מעלות צלזיוס.
  3. להוסיף 0.5 מ של מאגר lysing אמוניום כלוריד-אשלגן הצינור, בעדינות היפוך זה כמה פעמים כדי לערבב את הפתרון.
  4. דגירה הצינור בטמפרטורת החדר (RT) במשך 5 דקות.
  5. לשטוף את התאים על ידי הוספת 4.5 מ של PBS ו צריך שתוציאו ב g x 400 דקות 5-4 ° C, פעמיים.
  6. הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend בגדר תא ב- 100 µL בינוני RPMI-1640 טריים עם 10% סרום שור עוברית (FBS).
  7. להוסיף µg 0.1 של נוגדן CD16/32 (2.4G2) הצינורית לצורך חסימת.
  8. שמור את הצינורית על קרח.

2. לזרום Cytometry ומיון של לימפוציטים תת

הערה: מיון לימפוציטים בהתאם לסוג התא הוא הכרחי לביסוס התא הקרקע-האמת (קרי, הנכונה) הקלד תוויות הרכבת ולבדוק מסווג סוג התא בלמידה תחת פיקוח. Cytometry זרימה, שיטת תקן הזהב, משמש כדי לזהות ולהפריד בין לימפוציטים42.

  1. להכין תערובת של סמן משטח מכתים נוגדנים ב 100 µL בינוני RPMI-1640 טריים [עם 10% FBS, 0.1 µg של CD3e (17A2), CD8a (53-6.7), CD19 (ד 1 3), CD45R (B220, RA3-6B2), ו- NK1.1 (PK136)], µg 0.25 של נוגדנים יעד B, CD4 + T ו CD8 + T CD4 (GK1.5) לימפוציטים.
  2. להוסיף 100 µL של תערובת נוגדן התליה תא (שהושג בשלב 1.8).
  3. תקופת דגירה של 25 דקות על קרח.
  4. לשטוף את התאים על ידי הוספת 5 מ של PBS ו צריך שתוציאו ב g x 400 דקות 5-4 ° C, פעמיים.
  5. Resuspend בגדר תא ב 5 מ של טרי RPMI-1640 בינוני עם 10% FBS ו- 2.5 µg של דאפי (4', 6-diamidino-2-phenylindole).
  6. לאסוף את כל סוג של לימפוציט בנפרד עם cytometry זרימה באמצעות רמות קרינה פלואורסצנטית סמני שתוארו לעיל. במקביל לכלול תאים מתים באמצעות על דאפי האותות.
    הערה: פרוטוקולים מפורט לגבי זרימת מיון מבוססי cytometry תא היה שתואר לעיל42.

3. תלת פאזה כמותיים הדמיה

  1. שמור לימפוציטים הממוינים על קרח לאורך כל ההליכים הדמיה, אשר אמורה להסתיים בתוך 5 שעות (מאז לימפוציט בידוד מן העכבר) כדי למנוע נזק לתאים והשינויים הביוכימי.
  2. בחר סוג תאים ממוינים (בין לימפוציטים B, CD4 + T ו CD8 + T) ו לדלל את הדגימה (שהושג בשלב 2.6) כדי 180 תאים µL RPMI בינונית למצב הדמיה אופטימלית (קרי, תא אחד לכל יחידה שדה-of-view).
  3. לטעון μL 120 המדגם מדולל לתוך חדר הדמיה באמצעות הזרקת איטי. בדוק ביסודיות על הנוכחות של בועות בבית הבליעה הדמיה עם הדוגמה. אם יש בועות, בזהירות להסיר אותם, כפי שהם תסכן את האיכות של המדידות.
  4. רוכשים 3D tomograms רי שימוש מסחרי 3D כמותיים שלב מיקרוסקופ, או holotomography, והתוכנה ההדמיה שלה.
    הערה: ניתן למצוא מידע מפורט אודות הגדרת הניסוי כתב היד המקורי5.
    1. המקום טיפה של מים מזוקקים על גבי העדשה המטרה של המיקרוסקופ.
    2. במקום לחדר ההדמיה עם הדגימה על השלב תרגום של המיקרוסקופ ולהתאים את מיקומו כך המדגם יתיישר עם העדשה המטרה.
    3. להתאים את העמדות צירית של עדשות אובייקטיבית, מעבה על-ידי לחיצה על המוקד של פני השטח, בהתאמה, בכרטיסיה "כיול" המבט "מיקרוסקופ" של תוכנת הדמיה.
    4. יישר את העדשות אובייקטיבית, מעבה בלחיצה על מצב אוטומטי. לחלופין, השתמש במצב סריקה ולאחר להתאים ידנית את העדשות כך הדפוסים תאורה מותאמים על האזור המרכזי של השדה-of-view.
    5. לחזור למצב רגיל ולהתאים את הבמה תרגום לאתר תא השדה-of-view.
    6. למצוא את המטוס מוקד על ידי התאמת המיקום צירית של העדשה אובייקטיבי. התמקדות מושלם הופך לגבול מדגם דמיינו במסך כמעט בלתי נראה.
    7. התאם את הבמה תרגום למצוא במיקום ללא תא.
    8. לחץ על כיול למדוד הולוגרמות 2D מרובים עם זוויות שונות של תאורה.
    9. התאם את הבמה תרגום לאתר תא במרכזו של השדה-of-view.
    10. לעבור ללשונית "רכישת" ולחץ על תמונת תלת-ממד כדי למדוד את הולוגרמות של התא עם הזוויות תאורה זהים כפי שנעשה צעד 3.4.8.
    11. כאשר הנתונים שהושגו מוצג בלוח 'ניהול נתונים', לחץ לחיצה ימנית על הנתונים שהושגו ולחץ על תהליך לבנייה מחדש של tomogram רי 3D מ הולוגרמות נמדד בשלבים 3.4.8 ו 3.4.10, באמצעות האלגוריתם טומוגרפיה עקיפה 9 , 10 מיושמת בתוכנת הדמיה.
    12. חזור על צעדים 3.4.5-3.4.11 למדוד יותר מ-100 תאים כדי להבטיח עוצמה סטטיסטית עבור למידה חישובית.
    13. כל התמונות המעובדות דרך השלב 3.4.11. ניתן לאבחן. בלוח "ניהול נתונים", לחץ לחיצה ימנית את הנתונים, לחץ על פתח כדי להמחיש את הנתונים. לחץ על רי Tomogram על הלוח "נתוני מנהל". בכרטיסיה "מראש", לחץ על טען, לחץ פעמיים על "lymphocyte.xml", אשר היא פונקציה העברה מראש הניתנים על ידי תוכנת הדמיה כדי להמחיש את tomogram על פי חלוקות RI תלת-ממד.
  5. חזור על שלבים 3.2-3.4 למדוד 3D RI tomograms של כל סוגי לימפוציטים.

4. כמותיים מורפולוגי וביוכימי הדמיה של רי 3D Tomograms

  1. מקם כל הנתונים טומוגרפי נמדד מעל בתיקיה אחת. לפצל את סוגי תאים בתיקיות המשנה של תיקיה זו. להכין את כל tomogram להיות קובץ יחיד .mat .
  2. פתח את קובץ משלים 1 - הדמיה (שנכתב עבור תמונה בתוכנת עיבוד).
  3. ערוך קו 14 כדי לייעד את התיקייה tomogram מוכן בשלב 4.1.
  4. ערוך קו 15 כדי לייעד תיקיה כדי לשמור את הנתונים שחולצו תכונה.
  5. לחלופין, ערוך קו 17 כדי להתאים את הפרמטרים הסף RI עבור הדמיה. אפשרות ברירת המחדל היא 20 ספי רי מ 1.378 1.340, עם תוספת קבועה של 0.002 כפי שתואר לעיל5.
  6. הפעל את הקוד. עבור כל tomogram ב- dataset, הקוד מחשבת חמש תכונות: פני שטח (SA), תאי אחסון (CV), sphericity (SI), חלבון צפיפות (PD) ו יבש מסה (DM), לכל סף RI. האלגוריתמים מפורט לחילוץ תכונה מתוארים במקום5.
  7. על מנת לפקח על הדמיה, במהלך הביצוע בדוק על המסך להמחיש פילוח המבוסס על הסף תא רי.
  8. לבדוק הנתונים שחולצו תכונה, כמו קובץ .mat לכל tomogram, נשמר בתיקיה המיועד בשלב 4.4.

5. פיקוח למידה וזיהוי

  1. באופן אקראי ולפצל את הנתונים בתכונה שהושג בערכות צעד 4.8 הדרכה (70%) ובדיקה (30%) עם תיקיות נפרדות.
  2. פתוח 2 הקבצים המשלימים - הרכבת (נכתב עבור תמונה בתוכנת עיבוד).
  3. ערוך קו 14 כדי לייעד את ערכת הדרכה מוכן בשלב 5.1.
  4. ערוך קו 16 כדי לייעד תיקיה לשמור את המסווג מיומן.
  5. ערוך קו 17 כדי להגדיר שם קובץ עבור המסווג.
  6. לחלופין, ערוך קו 19 כדי לבחור את התכונות לאימונים. אפשרות ברירת המחדל, כפי שצוין קודם לכן5, נעשה שימוש כדי להשיג את התוצאות נציג להלן.
  7. הפעל את הקוד. באמצעות תכונות נבחרות של ערכת הדרכה, הקוד רכבות מסווג עם k-הקרוב שכן אלגוריתם (k -NN; ג = 4) ושומר את המסווג (כמו בשם בשלב 5.5) בתיקיה המיועד בשלב 5.4.
  8. בדוק על המסך להמחיש את הביצועים המסווג ודיוק קרוס-אימות.
  9. באופן אופציונלי, הרכבת מסווגים מרובים עם שילובים תכונה שונה על-ידי חזרה על צעדים 5.5-5.7. לאחר מכן, בחר את המסווג עם הצלב-אימות הדיוק הגבוה ביותר.
  10. פתח את 3 הקבצים המשלימים - מבחן (נכתב עבור תמונה בתוכנת עיבוד).
  11. ערוך שורות 14-15 כדי לייעד את המסווג מיומן להיבדק.
  12. ערוך קו 17 כדי לייעד את ערכת המבחן מוכן בשלב 5.1.
  13. הפעל את הקוד. המסווג שתוארו לעיל מזהה את סוגי תאים לימפוציטים בודדים בערכת הבדיקה.
  14. בדוק על המסך להמחיש את ביצועי זיהוי ודיוק הבדיקה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור 1 מראה תהליך סכמטי של פרוטוקול כולו. באמצעות ההליך המובאת כאן, בודדנו B (n = 149), CD4 + T (n = 95), ו CD8 + T (n = 112) לימפוציטים. לקבלת מידע שלב ו משרעת בזוויות שונות של תאורה, הולוגרמות 2D מרובים של לימפוציטים כל נמדדו על ידי שינוי זווית תאורה (מ-60 ° עד 60 ° צלזיוס). בדרך כלל, הולוגרמות 50 יכול לשמש לבנייה מחדש של tomogram רי תלת-ממד, אך המספר של הולוגרמות 2D ניתן להתאים בהתחשב על המהירות והאיכות הדמיה. משרעת ומידע שלב הולוגרמות נמדד מאוחזרות מש...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים פרוטוקול המאפשר זיהוי סוגי לימפוציטים ניצול הדמיה תלת פאזה כמותי ולימוד מכונה ללא תווית. השלבים הקריטיים של פרוטוקול זה הם הדמיה שלב כמותיים ובחירת תכונה. עבור ההדמיה הולוגרפית אופטימלית, הצפיפות של תאים צריכה להיות נשלטת כפי שתואר לעיל. יציבות מכנית של התאים חשוב גם להשיג התפלגות RI 3D מדויק כי תנועות צף או הרטט הסלולר יפריע מדידות הולוגרמה על שינויים זווית תאורה. לכן חיכינו כמה דקות עד המדגם הפך סטטי ויציב בבית הבליעה הדמיה לפני מדידה הולוגרמות. לבסוף, בועות בתוך החדר הדמיה בעייתיים כאשר מדידת הולוגרמות עקב ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרופסור י' פארק, ג'ו י', י' ס קים ולי ס יש אינטרסים כלכליים של Tomocube, inc., חברה commercializes טומוגרפיה אופטית עקיפה ושלב כמותיים הדמיה מכשירים, היא אחת של נותני החסות של העבודה.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי את KAIST BK21 + תוכנית, Tomocube, inc., ו את נבחרת מחקר קרן של קוריאה (2015R1A3A2066550, 2017M3C1A3013923, 2018K 000396). י' ג'ו מאשר תמיכה מן אחוות לנשיאות KAIST אסאן קרן המלגות מדע הביו-רפואית.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
עכברעכברי Daehan BiolinkC57BL/6J התאמת מין וגיל, 6 – 8 שבועות
צינור צנטריפוגה חרוטי פלקוןThermoFisher Scientific14-959-53A15 מ"ל
מי מלח חוצץ פוספט סיגמא-אולדריץ'806544-500 מ"ל
אמוניום-כלוריד-אשלגן ליסינג מאגר ThermoFisher ScientificA1049201
RPMI-1640 בינוניSigma-AldrichR8758
סרום בקר עובריThermoFisher Scientific10438018
נוגדןBD Biosciences553140 (RRID:AB_394655)CD16/32 (שיבוט 2.4G2)
נוגדןBD Biosciences555275 (RRID:AB_395699)CD3ε (שיבוט 17A2)
נוגדןBiolegnd100734 (RRID:AB_2075238)CD8 ואלפא; (שיבוט 53-6.7)
נוגדןBD Biosciences557655 (RRID:AB_396770)CD19 (שיבוט 1D3)
נוגדןBD Biosciences557683 (RRID:AB_396793)CD45R/B220 (שיבוט RA3-6B2)
נוגדןBD Biosciences552878 (RRID:AB_394507)NK1.1 (שיבוט PK136)
נוגדןeBioscience11-0041-85 (RRID:AB_464893)CD4 (שיבוט GK1.5)
DAPI רוש102362760014,6-דיאמידינו-2-פנילינדול
ציטומטריית זרימה BD BiosciencesAria II או III 
תא הדמיהTomocube, Inc.TomoDish
HolotomographyTomocube, Inc.HT-1H
Tomocube, Inc.TomoStudio
תוכנה מקצועית לתמונהMathWorksMatlab R2017b
תוכנת הדמיית הולוטומוגרפיה

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alizadeh, A. A., et al. Distinct types of diffuse large B-cell lymphoma identified by gene expression profiling. Nature. 403 (6769), 503(2000).
  2. Von Boehmer, H., Melchers, F. Checkpoints in lymphocyte development and autoimmune disease. Nature Immunology. 11 (1), 14(2010).
  3. Sáez-Cirión, A., et al. HIV controllers exhibit potent CD8 T cell capacity to suppress HIV infection ex vivo and peculiar cytotoxic T lymphocyte activation phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (16), 6776-6781 (2007).
  4. Fischer, K., et al. Isolation and characterization of human antigen-specific TCRαβ+ CD4-CD8-double-negative regulatory T cells. Blood. 105 (7), 2828-2835 (2005).
  5. Yoon, J., et al. Identification of non-activated lymphocytes using three-dimensional refractive index tomography and machine learning. Scientific Reports. 7 (1), 6654(2017).
  6. Popescu, G. Quantitative phase imaging of cells and tissues. , McGraw Hill Professional. (2011).
  7. Lee, K., et al. Quantitative phase imaging techniques for the study of cell pathophysiology: from principles to applications. Sensors. 13 (4), 4170-4191 (2013).
  8. Kim, D., et al. Refractive index as an intrinsic imaging contrast for 3-D label-free live cell imaging. bioRxiv. , 106328(2017).
  9. Kim, K., et al. Optical diffraction tomography techniques for the study of cell pathophysiology. Journal of Biomedical Photonics & Engineering. 2 (2), (2016).
  10. Wolf, E. Three-dimensional structure determination of semi-transparent objects from holographic data. Optics Communications. 1 (4), 153-156 (1969).
  11. Kus, A., Dudek, M., Kemper, B., Kujawinska, M., Vollmer, A. Tomographic phase microscopy of living three-dimensional cell cultures. Journal of Biomedical Optics. 19 (4), 046009(2014).
  12. Kim, T., et al. White-light diffraction tomography of unlabelled live cells. Nature Photonics. 8 (3), 256(2014).
  13. Simon, B., et al. Tomographic diffractive microscopy with isotropic resolution. Optica. 4 (4), 460-463 (2017).
  14. Kim, Y., et al. Profiling individual human red blood cells using common-path diffraction optical tomography. Scientific Reports. 4, (2014).
  15. Park, H., et al. Measuring cell surface area and deformability of individual human red blood cells over blood storage using quantitative phase imaging. Scientific Reports. 6, (2016).
  16. Lee, S., et al. Refractive index tomograms and dynamic membrane fluctuations of red blood cells from patients with diabetes mellitus. Scientific Reports. 7, (2017).
  17. Merola, F., et al. Tomographic flow cytometry by digital holography. Light-Science & Applications. 6, (2017).
  18. Park, Y., et al. Refractive index maps and membrane dynamics of human red blood cells parasitized by Plasmodium falciparum. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 13730-13735 (2008).
  19. Park, H., et al. Characterizations of individual mouse red blood cells parasitized by Babesia microti using 3-D holographic microscopy. Scientific Reports. 5, 10827(2015).
  20. Chandramohanadas, R., et al. Biophysics of malarial parasite exit from infected erythrocytes. Public Library of Science ONE. 6 (6), 20869(2011).
  21. Yoon, J., et al. Label-free characterization of white blood cells by measuring 3D refractive index maps. Biomedical Optics Express. 6 (10), 3865-3875 (2015).
  22. Kim, K., et al. Three-dimensional label-free imaging and quantification of lipid droplets in live hepatocytes. Scientific Reports. 6, 36815(2016).
  23. Kim, D., et al. Label-free high-resolution 3-D imaging of gold nanoparticles inside live cells using optical diffraction tomography. Methods. , (2017).
  24. Lenz, P., et al. Multimodal Quantitative Phase Imaging with Digital Holographic Microscopy Accurately Assesses Intestinal Inflammation and Epithelial Wound Healing. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
  25. Huang, J., Guo, P., Moses, M. A. A Time-lapse, Label-free, Quantitative Phase Imaging Study of Dormant and Active Human Cancer Cells. Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).
  26. Yang, S. A., Yoon, J., Kim, K., Park, Y. Measurements of morphological and biochemical alterations in individual neuron cells associated with early neurotoxic effects in Parkinson's disease. Cytometry Part A. 91 (5), 510-518 (2017).
  27. Cotte, Y., et al. Marker-free phase nanoscopy. Nature Photonics. 7 (2), 113-117 (2013).
  28. Nguyen, T. H., Kandel, M. E., Rubessa, M., Wheeler, M. B., Popescu, G. Gradient light interference microscopy for 3D imaging of unlabeled specimens. Nature Communications. 8 (1), 210(2017).
  29. Kwon, S., et al. Mitochondria-targeting indolizino [3, 2-c] quinolines as novel class of photosensitizers for photodynamic anticancer activity. European Journal of Medicinal Chemistry. 148, 116-127 (2018).
  30. Bennet, M., Gur, D., Yoon, J., Park, Y., Faivre, D. A Bacteria-Based Remotely Tunable Photonic Device. Advanced Optical Materials. , (2016).
  31. Kim, T. I., et al. Antibacterial Activities of Graphene Oxide-Molybdenum Disulfide Nanocomposite Films. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (9), 7908-7917 (2017).
  32. Bedrossian, M., Barr, C., Lindensmith, C. A., Nealson, K., Nadeau, J. L. Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy (DHM). Journal of Visualized Experiments. (129), (2017).
  33. Jo, Y., et al. Quantitative Phase Imaging and Artificial Intelligence: A Review. arXiv preprint. , arXiv:1806.03982 (2018).
  34. Javidi, B., Moon, I., Yeom, S., Carapezza, E. Three-dimensional imaging and recognition of microorganism using single-exposure on-line (SEOL) digital holography. Optics Express. 13 (12), 4492-4506 (2005).
  35. Jo, Y., et al. Label-free identification of individual bacteria using Fourier transform light scattering. Optics Express. 23 (12), 15792-15805 (2015).
  36. Jo, Y., et al. Angle-resolved light scattering of individual rod-shaped bacteria based on Fourier transform light scattering. Scientific Reports. 4, 5090(2014).
  37. Jo, Y., et al. Holographic deep learning for rapid optical screening of anthrax spores. Science Advances. 3 (8), 1700606(2017).
  38. Mirsky, S. K., Barnea, I., Levi, M., Greenspan, H., Shaked, N. T. Automated analysis of individual sperm cells using stain-free interferometric phase microscopy and machine learning. Cytometry Part A. 91 (9), 893-900 (2017).
  39. Roitshtain, D., et al. Quantitative phase microscopy spatial signatures of cancer cells. Cytometry Part A. 91 (5), 482-493 (2017).
  40. Lam, V. K., Nguyen, T. C., Chung, B. M., Nehmetallah, G., Raub, C. B. Quantitative assessment of cancer cell morphology and motility using telecentric digital holographic microscopy and machine learning. Cytometry Part A. , (2017).
  41. Pavillon, N., Hobro, A. J., Akira, S., Smith, N. I. Noninvasive detection of macrophage activation with single-cell resolution through machine learning. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2018).
  42. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments. (41), e1546(2010).
  43. Takeda, M., Ina, H., Kobayashi, S. Fourier-transform method of fringe-pattern analysis for computer-based topography and interferometry. Journal of the Optical Society of America. 72 (1), 156-160 (1982).
  44. Debnath, S. K., Park, Y. Real-time quantitative phase imaging with a spatial phase-shifting algorithm. Optics Letters. 36 (23), 4677-4679 (2011).
  45. Kim, K., et al. High-resolution three-dimensional imaging of red blood cells parasitized by Plasmodium falciparum and in situ hemozoin crystals using optical diffraction tomography. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 011005(2013).
  46. Vercruysse, D., et al. Three-part differential of unlabeled leukocytes with a compact lens-free imaging flow cytometer. Lab on a Chip. 15 (4), 1123-1132 (2015).
  47. Kim, K., et al. Correlative three-dimensional fluorescence and refractive index tomography: bridging the gap between molecular specificity and quantitative bioimaging. Biomedical Optics Express. 8 (12), 5688-5697 (2017).
  48. Shin, S., Kim, D., Kim, K., Park, Y. Super-resolution three-dimensional fluorescence and optical diffraction tomography of live cells using structured illumination generated by a digital micromirror device. arXiv preprint. , arXiv:1801.00854 (2018).
  49. Chowdhury, S., Eldridge, W. J., Wax, A., Izatt, J. A. Structured illumination multimodal 3D-resolved quantitative phase and fluorescence sub-diffraction microscopy. Biomedical Optics Express. 8 (5), 2496-2518 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Lymphocyte SubtypesQuantitative Phase ImagingMachine Learning3D Refractive IndexLabel Free IdentificationLymphocyte IsolationFeature ExtractionK Nearest NeighborSingle Cell AnalysisCell Classification

Related Articles