מאמר שיטה

בידוד של שלפוחית חוץ-תאי של נוזל שטיפה Bronchoalveolar מאתר באמצעות טכניקת צנטריפוגה אולטראפילטרציה

DOI:

10.3791/58310

⸱

9 בנובמבר 2018

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, Division of Pulmonary and Critical Care, Women's Guild Lung Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 2Department of Biomedical Sciences, Cedars-Sinai Medical Center, 3Department of Medicine, Smidt Heart Institute, Cedars-Sinai Medical Center

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מתארים שני שלפוחית חוץ-תאית בידוד םילוקוטורפ אולטראפילטרציה צנטריפוגה, ultracentrifugation עם צפיפות צנטריפוגה הדרגתיות, לבודד שלפוחית חוץ-תאית מדגימות נוזלים שטיפה bronchoalveolar מאתר. השלפוחיות המוגלתיות חוץ-תאית נגזר נוזל שטיפת מאתר bronchoalveolar על ידי שתי השיטות לכמת, מאופיין.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חוץ-תאית שלפוחית (EVs) הם מרכיבים subcellular שהתגלתה לשחק תפקידים חשובים רבים ביולוגית איתות פונקציות במהלך מצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים. בידודו של EVs ממשיכה להיות אתגר גדול בתחום זה, בשל מגבלות מהותי כל טכניקה. Ultracentrifugation דיפרנציאלי בשיטה צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות היא גישה נפוץ והוא נחשב להיות ההליך תקן הזהב לבידוד EV. עם זאת, הליך זה גוזלת זמן, עתירי עבודה, ותוצאות בדרך כלל מדרגיות נמוכה, אשר ייתכן שלא יתאים לדוגמאות בנפח מצומצם כמו נוזל שטיפה bronchoalveolar. נדגים שיטה בידוד אולטראפילטרציה צנטריפוגה היא פשוטה וזה ואת העבודה-היעילה עדיין מספקת תשואה גבוהה טוהר. אנו מציעים כי שיטה זו בידוד יכול להיות גישה חלופית מתאימה לבידוד EV, במיוחד עבור דגימות ביולוגיות בנפח מצומצם.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Exosomes המשנה הקטן ביותר של EVs, 50 – 200 ננומטר בקוטר, יש מספר תפקודים ביולוגיים על פני מערך מגוון של איתות תהליכים1,2,3,4,5. הם חלים על הומאוסטזיס הסלולר ורקמות בעיקר על ידי הקלת תקשורת המערכת באמצעות מטען מולקולות כמו שומנים, חלבונים וחומצות גרעין6,7,8,9 . צעד קריטי במחקר EV הוא תהליך בידוד. Ultracentrifugation דיפרנציאלית (UC), עם או בלי צפיפות הדרגתיות צנטריפוגה (DGC), נחשב הגישה תקן זהב, אך שיטה זו נושאת מגבלות הגדולות, כולל המחירים לא יעיל של שחזור EV, מדרגיות נמוכה10 , 11 , 12, זה להגביל את הניצול הטוב ביותר כדי דגימות נפח גדול יותר, כגון תא תרבות exosome supernatant או גבוהה ייצור דגימות. היתרונות והחסרונות של שיטות אחרות, כגון גודל הדרה אולטראפילטרציה או כרומטוגרפיה, בידוד immunoaffinity על-ידי חרוזים או עמודות ולאחר מיקרופלואידיקה, מתוארים היטב, נהלים משלימה המודרנית פותחו כדי להתגבר על ולצמצם את מגבלות טכניות כל גישה11,12,13,14,15. אחרים הראו כי צנטריפוגה אולטראפילטרציה (UFC) עם קרום nanoporous ביחידה מסנן הוא טכניקה חלופית המספק טוהר דומות ל UC שיטת16,17,18. טכניקה זו יכולה להיחשב באחת השיטות בידוד חלופי.

נוזל שטיפה Bronchoalveolar (BALF) מכיל EVs שקיימים מספר תפקודים ביולוגיים שונים מערכת הנשימה תנאים19,20,21,22. לומדת EVs BALF-derived כרוך כמה אתגרים בשל invasiveness של ההליך ברונכוסקופיה אצל בני אדם, כמו גם כמות מוגבלת של שחזור נוזל שטיפה. בחיות מעבדה קטנה כגון עכברים, רק כמה מיליליטר ניתן לשחזר בתנאי ריאות רגילה, אפילו פחות הריאות מודלק או שהותירה23. כתוצאה מכך, איסוף כמות מספקת של BALF EV בידוד על ידי ultracentrifugation דיפרנציאלי עבור יישומי הזרם לא יכול להיות ריאלי. אולם, בידוד אוכלוסיות EV הנכון הוא גורם מכריע ללמוד תפקודים ביולוגיים EV. האיזון העדין בין היעילות ומועילות ימשיך להיות אתגר בשיטות בידוד ומבוססת EV.

במחקר הנוכחי, נדגים כי בגישה אולטראפילטרציה צנטריפוגלי, ניצול 100 kDa משקל מולקולרי ניתוק (MWCO) nanomembrane מסנן יחידה, מתאים בנפח מצומצם דגימה ביולוגית כגון BALF. טכניקה זו פשוטה, יעילה, ומספק טוהר גבוהה ומדרגיות לתמוך המחקר של EVs נגזר BALF.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניצול בעלי החיים ואת כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ו שימוש ועדות (IACUC) בבית Cedars-Sinai רפואי במרכז (CSMC).

1. מאתר Bronchoalveolar שטיפה נוזל (BALF) אוסף והכנות

  1. אוסף BALF
    1. המתת חסד עכברים עם קוקטייל של קטאמין (300 מ"ג/ק"ג), חריגות השירותים הווטרינריים (30 מ"ג/ק"ג) דרך המסלול בקרום הבטן ואחריו נקע בצוואר הרחם.
    2. הכנס angiocatheter 22 גרם לתוך קנה הנשימה. צירוף של מזרק אינסולין המכיל 1 מיליליטר (מ"ל) מאגר פוספט תמיסת מלח הקר Dulbecco סטרילי של (DPBS), להחדיר 1 מ"ל של DBPS לתוך שתי הריאות דרך angiocatheter.
    3. לסגת לאט על הבוכנה מזרק כדי לאחזר BALF לוותר על BALF לתוך צינור חרוטי 50-mL. שמור את BALF על הקרח.
    4. חזור על שלבים 1.1.2 ו 1.1.3 3 x (4 x סה כ כל עכבר).
      הערה: כ 0.8 מ ל מאוחזר באופן כללי למיליליטר של החדרה. בנוסף, ניתן לבצע את הפעולות הבאות עבור עכברים בודדים (קרי, 3 מ"ל של BALF), אך צירוף מספר דוגמאות BALF יאפשר את הבידוד של אצווה גדול יותר של EVs עקביות בניסויים במורד הזרם.
  2. הכנה BALF
    1. הבריכה BALF של עכברים 25, מחלקים אותו שתי קבוצות שוות (~ 35 מ לכל aliquot).
    2. Centrifuge את BALF ב 400 x g, ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, כדי להסיר תאים ופסולת סלולר אחרות ולאסוף את תגובת שיקוע.
    3. Centrifuge את תגובת שיקוע ב g 1,500 x, ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, כדי להסיר שאריות תאים. לאסוף את תגובת שיקוע והמשך אל השלבים בידוד EV.

2. בידוד של שלפוחית חוץ-תאי של נוזל שטיפה Bronchoalveolar מאתר

הערה: במחקר זה, טכניקות בידוד 2 EV, כלומר UFC ultracentrifugation עם קליל להשתמש כדי לבודד EVs מן BALF. פרוטוקול מפורט של כל אחת מהשיטות המתוארות להלן.

  1. שיטת העשרה צנטריפוגה (UFC) אולטראפילטרציה
    הערה: שיטה זו שונה מן הפרוטוקול שתואר לעיל10.
    1. לסנן את תגובת שיקוע מהשלב 1.2.3 דרך מסנן סטרילי מזרק μm 0.2 ולשמור את BALF מסוננים על קרח.
      הערה: זהו צעד אי-הכללה של גודל לפיה רק שלפוחית קטנה יותר 200 ננומטר נאספים.
    2. Equilibrate יחידת צנטריפוגלי מסנן 100 kDa MWCO עם DPBS סטרילי עבור 10 דקות צנטריפוגה יחידת צנטריפוגלי ב g 1,500 x 10 דקות ב 4 ° C כדי למחוק את DPBS.
      התראה: ברגע הקרום במכשיר מסנן הוא equilibrated עם DPBS, הקרום חייב להישמר רטובה כל הזמן עד המכשיר משמש.
    3. תמלא את יחידת מסנן עם 15 מ"ל מדגם BALF מהשלב 2.1.1 צנטריפוגה ב 3,000 x g למשך 30 דקות ב 4 º C. BALF זרימה דרך יכולה להיות שנמחקו או נאספים לתוך צינור הקנוני נפרד ומאוחסנים ב-80 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי.
    4. חזור על צעד 2.1.3 BALF הנותרים מיקרומטר-מסוננים 0.2.
      הערה: זה לקח שלוש חזרות של centrifugations להתרכז מספיק של EVs BALF מאמצעי האחסון המוצא המקורי של 35 מ. כתוצאה מכך 1 – 1.5 מ ל retentate.
    5. לשטוף את retentate עם 14 מ של DPBS סטרילי מאת בעדינות pipetting שוב ושוב. Centrifuge יחידת מסנן ב g x 3000, ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, כדי להסיר את DPBS וכדי לרכז את retentate EV.
    6. לאסוף את EVs BALF-derived מרוכז המכשיר מסנן על-ידי הוספה של pipettor לתוך החלק התחתון של המכשיר מסנן פורש את הדגימה באמצעות תנועה גורף מצד לצד כדי להבטיח התאוששות מוחלטת.
    7. Aliquot EVs BALF-derived ואחסן אותם ב- 80 ° C עבור עוד חלקיק כימות ואפיון (ראה שלב 3).
  2. Ultracentrifugation (UC) עם צפיפות קליל הדרגתיות צנטריפוגה (DGC)
    הערה: להלן כללי התנהגות שונה מן הפרוטוקול שתואר לעיל24.
    1. להעביר את תגובת שיקוע מהשלב 2.1.1 לתוך צינור ultracentrifuge 37-mL, centrifuge את הדגימה ב g 10,000 x למשך 30 דקות ב 4 ° C באמצעות ultracentrifuge. לאסוף את תגובת שיקוע צנטריפוגה ב 100,000 g x, ב 4 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. בעוד כדורי EV הם centrifuged, להתכונן צעד 2.2.3 ריכוזים שונים של מאגרי הדרגתיות צפיפות קליל (טבלה 1).
    2. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend כדורי EV ב 200 μL של DPBS.
    3. לערבב את המתלים EV עם 300 μL של הפתרון עובד 50% iodixanol (טבלה 1), להעביר אותו הצינור ultracentrifuge 15 mL. מעל 50% iodixanol-EV תערובת ההשעיה, ברצף שכבה של בופר הבאים לפי הסדר מלמטה למעלה: 30% iodixanol (4.5 מ ל), 25% של iodixanol (3 מ ל), iodixanol 15% (2.5 מ ל) iodixanol 5% (6 מ"ל). צנטריפוגה ב 100,000 g x, ב 4 ° C 230 דקות.
      הערה: מעבר הצבע צפיפות קליל מבוסס על אחוז iodixanol קנה מידה עם הריכוז הגבוה ביותר (50%) בתחתית כדי הריכוז הנמוך ביותר (5%) בחלק העליון. ליצירת ריכוזים שונים של iodixanol, כמויות שונות של המגון בינוני (טבלה 1) היו מעורבים עם הפתרון עובד (50% iodixanol).
    4. לאסוף את השבר 15% ו- 25% ו לדלל אותם ב DPBS סטרילי כדי להביא את הווליום עד 15 מ"ל. מעבירים צינור קטן ultracentrifuge חדש, צנטריפוגה ב 100,000 g x, ב 4 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות.
    5. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend EV כדורי ב- 50 μL של DPBS סטרילי עבור אפיון נוסף.

3. חוץ-תאית שלפוחית כמת

הערה: התשואה שחזור EVs BALF, נגזר quantitated עם שני מדדים.

  1. ננו-חלקיק מעקב מדידה ניתוח (נ)
    1. לדלל את הדגימה EV-1:200 – שבערך ב 1 מ"ל של DPBS, טען המדגם לתוך מזרק אינסולין. לצרף מזרק מדגם מזרק משאבה ולהתחיל למדוד את מספרי החלקיקים ואת גודל (ראה טבלה של חומרים).
    2. הגדר את רמת המצלמה-14 והסף זיהוי של כל המדידות לדוגמה ב- 1. חמש מדידות חוזרות עם מסגרות 1,500 ב 30 s הוקלטו כל דגימה, באיחור של 20 s בין פעולות הקריאה. לשלב, הנתונים עבור ריכוז סופי ודוחות בגודל ממוצע.
      הערה: עבור לכידת מדויק של כל החלקיקים, להתאים את רמת המצלמה לפי הצורך לדמיין כל החלקיקים הגדרות דומות ולהשתמש למדידות מדגם כל ניסוי.
  2. חלבון כמת
    הערה: חומצה bicinchoninic (BCA) וזמינותו חלבון שימש כדי למדוד את ריכוז חלבון EVs נגזר BALF.
    1. Solubilize הדגימות EV במאגר פירוק x 1.
    2. לכמת את כמות חלבון EVs BALF-derived לכל פרוטוקול סטנדרטי BCA באמצעות זיהוי ערכי צבע מוחלטים על ידי מדידה של ספיגת-560 nm, קורא את הצלחת.

4. זיהוי של BALF, נגזר שלפוחית חוץ-תאית

הערה: חלבונים סמן משטח מה שנקרא exosome (TSG101, CD63, CD81 ו CD9) שימשו כדי לוודא EV ושחזורים מרחביות-דף ולאחר immunoblotting הזרימה cytometry וניתוח.

  1. מרחביות-דף ו- immunoblotting
    1. להמיס כמות שווה של EV חלבונים של כל דגימה עם טעינת מאגר (ליתיום dodecyl סולפט) ו- 50 מ מ dithiothreitol (DTT) צינור 1.6 mL סופג. מחממים את הדגימות-70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    2. לטעון את הדגימות מהשלב 4.1.1 לתוך 4 – 12% Bis-טריס פלוס אקרילאמיד ג'ל ולהפעיל אלקטרופורזה (150 וולט, 35 mA) למשך 35 דקות.
    3. העברת החלבונים קרום ניטרוצלולוזה באמצעות שיטת העברה יבש.
    4. לחסום את הקרום עם 5% חלב כחוש במשך 60 דקות, נדנדה בטמפרטורת החדר (RT).
    5. דגירה הקרום עם נוגדן ל סמן חלבון משטח EV, הגידול הרגישות ג'ין 101 (TSG101), בדילול שבערך ב- BSA 5% ב באגירה טריס מלוחים Tween-20 (TBST) ב 4 ° C, מתנדנד בין לילה.
    6. למחרת, לשטוף את הקרום 3 x, 10 דקות כל אחד, מאגר TBST, וקונטה דגירה זה עם הארנב אנטי איג, נוגדן HRP-מקושרים, ב 1:5,000 דילול עבור 60 דקות ב- RT.
    7. לשטוף את הקרום 3 x, 10 דקות כל אחד לשטוף, במאגר TBST. לפתח הקרום עם chemiluminescent ריאגנט לזיהוי נוגדנים HRP ותמונה (ראה טבלה של חומרים עבור מערכת הדמיה).
  2. Cytometry זרימה
    1. לדלל נגזר BALF EVs ב 49 μL של PEB מכתים מאגר (PBS + EDTA 5 מ מ + 0.5% BSA, מסונן דרך קרום מסנן מזרק 0.1 μm).
    2. להוסיף את כל הנוגדנים הבאים לתוך כל דגימה בודדת: 1) עכבר עכבר אנטי PE CD63 נוגדנים (100 ng לכל תגובה); 2) עכבר עכבר אנטי PE CD81 (500 ng); 3) עכבר אנטי-עכבר FITC CD9 (200 ng). דגירה ב 4 ° C, נדנדה עבור 60 דקות בחושך.
    3. לדלל את הדגימות עם 450 μL של ממברנה-מסוננים PEB מכתים מאגר ונושא את הדגימות לניתוח cytometry זרימה (ראה טבלה של חומרים)25.
    4. התאם את ההגדרות cytometer תזרים כדלקמן: 1) להגדיר את כל הערוצים ב- hyper יומן (hlog); 2) שוכן על ההדק על האס-4; 3) לבטל את הגורם המשני. הפעל את הדגימות באווירה במהירות נמוכה של רכוש לפחות 10,000 אירועים בכל מדגם.
    5. לבצע ניתוח נתונים cytometry נמוך בכל מדגם באמצעות ניתוח תוכנה (ראה טבלה של חומרים).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ביצענו EV בידוד מן העכבר BALF באמצעות שיטות בידוד UFC, UC-DGC באותו יום. השיטה UFC נדרש כ 2.5-3 h, ואילו הטכניקה UC-DGC נדרש 8 שעות של זמן העיבוד. זה לא כללו buffers וריאגנט זמן הכנה. יצוין, כי היתה אפשרות לבצע מספר משימות אחרות בתקופות ארוכות צנטריפוגה. ובכל זאת, כל ההליך נמשך כמעט יום שלם UC-DGC בידוד הטכניקה.

EVs BALF, נגזר מן עכברים רגילה מבודדים בשיטת UFC מוצג גודל קטן יותר, התפלגות גודל אחיד (148.8 ± 1.1 ננומטר,

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ב העשורים האחרונים, מדענים יש פרם את חשיבות של EVs בהומאוסטזיס הסלולר. וחשוב מכך, EVs לשחק תפקידים עיקריים בתהליכים רבים של המחלה על ידי להתכוונן תאים שכנים ומרוחק דרך שלהם מטען ביואקטיביות מולקולות1,21,22,26,27 , 28 , 29 , 30. העתיד בפיתוח וקידום בתחום זה ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

העבודה נתמכת על ידי את NHLBI/NIH מענקים HL103868 (P.C.) ו HL137076 (כדי P.C.), את האמריקאי הלב האגודה מענק הסיוע (כדי P.C.) את פרס מחקר סמואל Oschin מקיף סרטן המכון (SOCCI) סרטן ריאות (כדי P.C.). ברצוננו להביע הערכה גדולה מכון הלב Smidt במרכז הרפואי Cedars-Sinai המספק לנו מכונה Nanosight EV nanoparticle מעקב ניתוח.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>חומר
Amicon מסננים צנטריפוגליים אולטרה-15 Ultracel-100KSigma-Millipore, סנט לואיס, מיזוריUFC910024
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)Corning Cellgro, Manassas, VA21-031-CV
SucroseSigma-Millipore, סנט לואיס, MOEMD8550
HEPESמוצרי מחקר בינלאומיים, פרוספקט, IL75277-39-3
EDTACorning Cellgro, Manassas, VA46-034-CI
נתרן כלוריסיגמא-מיליפופר, סנט לואיס, MOS3014-1KG
OptiPrepSigma-Millipore, סנט לואיס, MOMKCD9753שיפוע צפיפות קטמין בינוני
VetOne, בויסי, מזהה13985-702-10
XylazineAkorn Animal Health, Lake Forest, IL59399-110-20
מזרק 1 מ"לBD, פרנקלין לייקס, ניו ג'רזי309656
מזרק אנגיוקטטר 20 גרםBD, פרנקלין לייקס, ניו ג'רזי381703
צינורות צנטריפוגה 15 מ"לVWR, Radnor, PA89039-666
צינורות צנטריפוגה 50 מ"לCorning Cellgro, Manassas, VA430828
בדיקת חלבון חומצה ביצינצ'ונית (BCA)פירס, תרמו פישר סיינטיפיק, רוקפורד, IL23235
ארנב נגד עכבר TSG101 נוגדןAbCam, קיימברידג', MAAB125011
חולדה נגד עכבר PE-CD63 נוגדןBiolegend, סן דייגו, קליפורניה143904
CD81
CD9
IgG נגד ארנב, טכנולוגיית איתות תאים המקושרת לנוגדנים HRP, דנברס, MA7074S
4x LDS
10x חומר הפחתה (בורג)
10x מאגר ליזה (בורג)טכנולוגיית איתות תאים, דנברס, MA
בורג 4-12% ביס-טריס פלוס ג'ל אקרילאמידInvitrogen, תרמו פישר סיינטיפיק, וולת'אם, MANW04120
iBlot 2 ערימות מיני ניטרוצלולוזInvitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MAIB23002
מגיב לזיהוי נוגדנים Chemiluminescent HRP HyGLODenville Scientific, Holliston, MAE2400
צינורות אולטרה-צנטריפוגה 17 מ"לבקמן קולטר, פסדינה, קליפורניה337986
צינורות אולטרה-צנטריפוגה 38.5 מ"לבקמן קולטר, פסדינה, קליפורניה326823
מסנני מזרק קורנינג SFCA 0.2 ומיקרו; m נקבוביותתרמו פישר סיינטיפיק, וולת'אם, MA09-754-13
<חזק>ציוד
צנטריפוגהאפנדורף, המבורג,
בקמן קולטר, פסדינה, קליפורניה-ננוסייט
(NS300)מלברן, ווסטרשייר, בריטניה- למדידת התפלגות גודל החלקיקים ו ריכוז חלקיקים
MACSQuant Analyzer 10 זרימה ציטומטרMiltenyi Biotec, Bergisch Gladbach,גרמניה-iBlot
Transfer ApparatusThermo Fischer Scientific, Waltham, MA-Bio-Rad
ChemiDoc MP Imaging SystemBio-Rad, Hercules, CA
FlowJo v. 10תוכנת ניתוח
גרמניה-אולטרה-צנטריפוגה

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews Immunology. 2, 569-579 (2002).
  2. Kosaka, N., et al. Secretory Mechanisms and Intercellular Transfer of MicroRNAs in Living Cells. Journal of Biological Chemistry. 285 (23), 17442-17452 (2010).
  3. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
  4. Fujita, Y., Kosaka, N., Araya, J., Kuwano, K., Ochiya, T. Extracellular vesicles in lung microenvironment and pathogenesis. Trends in Molecular Medicine. 21 (9), 533-542 (2015).
  5. Kalluri, R. The biology and function of exosomes in cancer. Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1208-1215 (2016).
  6. Janowska-Wieczorek, A., et al. Microvesicles derived from activated platelets induce metastasis and angiogenesis in lung cancer. International Journal of Cancer. 113 (5), 752-760 (2005).
  7. Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nature Cell Biology. 9 (6), 654-659 (2007).
  8. Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Biogenesis, Secretion, and Intercellular Interactions of Exosomes and Other Extracellular Vesicles. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30 (1), 255-289 (2014).
  9. Rocco, G. D., Baldari, S., Toietta, G. Exosomes and other extracellular vesicles-mediated microRNA delivery for cancer therapy. Translational Cancer Research. 6 (Supplement 8), S1321-S1330 (2017).
  10. Peterson, M. F., Otoc, N., Sethi, J. K., Gupta, A., Antes, T. J. Integrated systems for exosome investigation. Methods. 87 (1), 31-45 (2015).
  11. Xu, R., Greening, D. W., Zhu, H. J., Takahashi, N., Simpson, R. J. Extracellular vesicle isolation and characterization: toward clinical application. Journal of Clinical Investigation. 126, 1152-1162 (2016).
  12. Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. Journal of Extracellular Vesicles. 5 (1), 32945(2016).
  13. Inglis, H. C., et al. Techniques to improve detection and analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. Cytometry Part A. 87 (11), 1052-1063 (2015).
  14. Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in Exosome Isolation Techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
  15. Willis, G. R., Kourembanas, S., Mitsialis, S. A. Toward Exosome-Based Therapeutics: Isolation, Heterogeneity, and Fit-for-Purpose Potency. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 20389(2017).
  16. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 27031(2015).
  17. Benedikter, B. J., et al. Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies. Scientific Reports. 7 (1), 15297(2017).
  18. Vergauwen, G., et al. Confounding factors of ultrafiltration and protein analysis in extracellular vesicle research. Scientific Reports. 7 (1), 2704(2017).
  19. Kesimer, M., et al. Characterization of exosome-like vesicles released from human tracheobronchial ciliated epithelium: a possible role in innate defense. The FASEB Journal. 23 (6), 1858-1868 (2009).
  20. Torregrosa Paredes, P., et al. Bronchoalveolar lavage fluid exosomes contribute to cytokine and leukotriene production in allergic asthma. Allergy. 67 (7), 911-919 (2012).
  21. Alipoor, S. D., et al. Exosomes and Exosomal miRNA in Respiratory Diseases. Mediators of Inflammation. 2016, 5628404(2016).
  22. Hough, K. P., Chanda, D., Duncan, S. R., Thannickal, V. J., Deshane, J. S. Exosomes in Immunoregulation of Chronic Lung Diseases. Allergy. 72 (4), 534-544 (2017).
  23. Van Hoecke, L., Job, E. R., Saelens, X., Roose, K. Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration. Journal of Visualized Experiments. (123), e55398(2017).
  24. Minciacchi, V. R., et al. MYC Mediates Large Oncosome-Induced Fibroblast Reprogramming in Prostate Cancer. Cancer Research. 77 (9), 2306-2317 (2017).
  25. Koliha, N., et al. Melanoma Affects the Composition of Blood Cell-Derived Extracellular Vesicles. Frontiers in Immunology. 7, 581(2016).
  26. Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nature Reviews Immunology. 9, 581-593 (2009).
  27. Camussi, G., Deregibus, M. C., Bruno, S., Cantaluppi, V., Biancone, L. Exosomes/microvesicles as a mechanism of cell-to-cell communication. Kidney International. 78 (9), 838-848 (2010).
  28. Lee, Y., El Andaloussi, S., Wood, M. J. Exosomes and microvesicles: extracellular vesicles for genetic information transfer and gene therapy. Human Molecular Genetics. 21, R125-R134 (2012).
  29. Villarroya-Beltri, C., Baixauli, F., Gutiérrez-Vázquez, C., Sánchez-Madrid, F., Mittelbrunn, M. Sorting it out: Regulation of exosome loading. Seminars in Cancer Biology. 28, 3-13 (2014).
  30. Hoshino, A. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527, 329-335 (2015).
  31. Liu, F., et al. The Exosome Total Isolation Chip. ACS Nano. 11 (11), 10712-10723 (2017).
  32. Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (5), F1657-F1661 (2007).
  33. Zhao, Z., Yang, Y., Zeng, Y., He, M. A Microfluidic ExoSearch Chip for Multiplexed Exosome Detection Towards Blood-based Ovarian Cancer Diagnosis. Lab on a Chip. 16 (3), 489-496 (2016).
  34. Fang, S., et al. Clinical application of a microfluidic chip for immunocapture and quantification of circulating exosomes to assist breast cancer diagnosis and molecular classification. PloS ONE. 12 (4), e0175050(2017).
  35. Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. American Journal Physiology-Renal Physiology. 292 (5), F1657-F1661 (2007).
  36. Kornilov, R., et al. Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1422674(2018).
  37. Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Kanchi Ravi, R., DiStefano, J. K. Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers. Kidney International. 82 (9), 1024-1032 (2012).
  38. Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Scientific Reports. 6 (1), 329(2016).
  39. Xiao, J., et al. Cardiac progenitor cell-derived exosomes prevent cardiomyocytes apoptosis through exosomal miR-21 by targeting PDCD4. Cell Death & Disease. 7 (6), e2277(2016).
  40. Agarwal, U., et al. Experimental, Systems and Computational Approaches to Understanding the MicroRNA-Mediated Reparative Potential of Cardiac Progenitor Cell-Derived Exosomes From Pediatric Patients. Circulation Research. 120 (4), 701-712 (2017).
  41. Merchant, M. L., et al. Microfiltration isolation of human urinary exosomes for characterization by MS. PROTEOMICS - Clinical Applications. 4 (1), 84-96 (2010).
  42. Gouin, K., et al. A comprehensive method for identification of suitable reference genes in extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1347019(2017).
  43. Betsuyaku, T., et al. Neutrophil Granule Proteins in Bronchoalveolar Lavage Fluid from Subjects with Subclinical Emphysema. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 159 (6), 1985-1991 (1999).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

regentEVCD63 CD9 CD81BAL

מאמרים קשורים