להמחיש את צומת ואת צלחת Notochordal Gastrulating עוברי העכבר באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה כל הר Immunofluorescence

Summary

צומת וצלחת notochordal בארעיותם איתות המארגנים בפיתוח עוברי העכבר זה ניתן לאבחן באמצעות מספר טכניקות. כאן נתאר בפירוט כיצד לבצע את שתי הטכניקות כדי ללמוד את המבנה ואת מורפוגנזה: 1) סריקה מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM); ו- 2) כל הר immunofluorescence (WMIF).

Abstract

העובר שלאחר ההשתלה העכבר עובר שינויי הצורה הגדולות לאחר אתחול של gastrulation, מורפוגנזה. סימן היכר של מורפוגנזה היא היווצרות של המארגנים ארעי, הצומת ואת צלחת notochordal, התאים עברו הרצף השלילי פרימיטיבי. היווצרות נאותה של מרכזים אלה איתות חיוני להתפתחות של התוכנית הגוף, טכניקות כדי להמחיש להם עניין גבוהה ביולוגים התפתחותיים העכבר. צומת וצלחת notochordal לשכב על המשטח הגחון של עוברי gastrulating העכבר מתחלקים היום (ה) 7.5 של פיתוח. הצומת הוא מבנה דמוי ספל אשר התאים בעלי של יחיד ודק ריסי בכל. נאות לוקליזציה subcellular והסיבוב של cilia בבור הצומת קובע אסימטריה משמאל לימין. התאים notochordal צלחת גם מחזיקים cilia יחיד אמנם קצר יותר מאשר אלה של התאים צומת. הצלחת notochordal יוצרת את מיתר הגב אשר משמש מארגן איתות חשוב עבור somitogenesis והמתבנת עצבית. כי התאים של הצומת וצלחת notochordal transiently נמצאים על פני השטח ושולט cilia, הם להיות visualized באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים סריקה (SEM). בין טכניקות אחרות נהגו להמחיש את המבנים הללו ברמה התאית היא כל הר immunofluorescence (WMIF) באמצעות הנוגדנים נגד החלבונים מאוד הבאות לידי ביטוי צומת ואת צלחת notochordal. בדו ח זה, אנו מתארים שלנו פרוטוקולים ממוטבת כדי לבצע SEM ו- WMIF של הצומת וצלחת notochordal העוברים פיתוח העכבר כדי לסייע הערכה של רקמות הצורה והארגון הסלולר פראי-סוג, העוברים מוטציה gastrulation.

Introduction

Gastrulation התנועות morphogenetic הנלווים הם חיוניים לעיצוב של העובר העכבר¹. השינויים צורה התאית ובארגון במהלך מורפוגנזה להכתיב מידע לפי מיקום כדי לווסת את גורל ולאפשר גם המסלולים איתות שהתפתח לבצע בדיוק את הפונקציות שלהם כדי לגוון את שכבות הנבט שהוקם¹. היווצרות של ארגון מבנים ארעיים איתות מרכזי כגון צומת ו מיתר הגב חיוני עבור הביצוע של תוכנית התפתחותית². ביולוגים התפתחותיים השתמשו במגוון טכניקות כדי ללמוד את מורפוגנזה של מבנים אלה, הבולטים ביותר של אשר הוא השימוש של כתבים הסלולר, חיים שמחוץ הדמיה לעקוב אחר הדינמיקה בהתנהגות הסלולר, subcellular^{2 3, ,4}. בדו ח זה, אנו מתמקדים המתארת את הפרטים של פרוטוקולים ממוטבת שלנו עבור שתי הטכניקות הללו: סריקה מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM) ואת כל הר immunofluorescence (WMIF), אשר היו ואינם אינסטרומנטלי עדיין לומד את מורפוגנזה של הצומת הצלחת notochordal, מבשר של מיתר הגב.

הצומת עובריים בעכבר זה בצורת דמעה כוס תאים הנמצא על פני השטח הגחון של העובר העכבר מסביב המוקדמות כדי שהאח קיפול הראש במהלך gastrulation, מורפוגנזה (יום עובריים, E7.5-E8)^{2,5, 6,7}. הצלחת notochordal מורפולוגית נובע anteriorly צומת³. כל תא בצומת וצלחת notochordal מאופיינת ריסי אחת המגיחה החיצוני, שהוא ארוך בתאים צומת אך אורכו משתנה עם שלב התפתחותי². הרוטציה של cilia בבור צומת הוכח להיות חשוב עבור מערכת אזעקה הקובע משמאל אסימטריה⁴. הצלחת notochordal הוא מבשר של מיתר הגב, המרכז איתות כי חשוב המתבנת של somites הסמוך ו- שפופרת פגמים בתעלה שמעליה³.

בשל התכונות של מיקום (פני השטח), צורה (כוס), אחזקת מבנים הסלולר החיצוני ברורים (cilia), SEM באופן מסורתי שימש כדי להמחיש את צומת ואת צלחת notochordal וללמוד שלהם צורה ומבנה^{2, 7}. SEM משמש גם ללמוד את השינויים במבנה של הצומת עצמו או של cilia בתאי שלה במוטציות המשפיעות על gastrulation, מורפוגנזה, וכן cilia היווצרות^8,9,10. SEM היא טכניקה אשר מנצל קרן אלקטרונים לחקור את ultrastructure טופולוגי של המשטח החיצוני של חומרים כגון דגימות ביולוגיות¹¹ממוקד. המדגם היא בדרך כלל קבוע, מיובשים, ואז לרעוד. להוציא-מצופה מתכות להסתכלות במיקרוסקופ אלקטרונים סריקה כפי שנתאר בשלב 1.

WMIF היא טכניקה מכתימים להמחיש מוצרים ג'ין, כגון חלבונים, שלוש-מימד (3D). WMIF של רקמות, איברים או אורגניזם שלם אפילו מספק מידע מרחבי על ההתפלגות של האות ושל צורת המבנה שנוצר ב- 3D. הטכניקה מבוססת על תיקון המדגם ואז מכתימה את זה עם conjugates פלורסנט. עכבר עוברי ~ E7.5 הם קטנים ולא שקוף ולכן אידיאלי עבור WMIF פרוטוקולים להמחיש את צומת ואת צלחת notochordal. לדוגמה, הפקטור שעתוק Barchyury (T) מתבטאת הגרעינים של הצומת וצלחת notochordal, ובמידה פחותה ב רצף פרימיטיבי, סביב E7.5-E8 ושל התפתחות נוגדנים עבודה טובה נגד טי מאת WMIF הן מבחינה מסחרית זמין ולהפוך את ההליך מכתימים אפשרי. התאים של הצומת וצלחת notochordal מאופיינים גם מכווץ משטחים הפסגה, אשר פנים בחוץ, ולכן יכול להיות מוכתם Phalloidin מצומדת פלורסצנטיות לסימון F-אקטין-הפסגה constrictions. באמצעות נוגדנים אלה כדוגמאות, השילוב של T ו- F-אקטין צביעת על-ידי WMIF מספק ייצוג של הצומת וצלחת notochordal תלת-ממד gastrulating עוברי העכבר כמו נדגים שלב 2 ⁸. עם זאת, סמנים של cilia, כגון ARL13B או acetylated טובולין, כמו גם סמנים אחרים של הצומת וצלחת notochordal, כגון FOXA2, יכול לשמש גם כדי לבצע WMIF על פיתוח העכבר עוברי^3,4.

אנחנו הראו כי striatin-אינטראקציה חלבון 1 (STRIP1) חיונית עבור gastrulation רגיל ומורפוגנזה העובר העכבר⁸. STRIP1 הוא רכיב ליבה של phosphatases striatin-אינטראקציה, קומפלקסים kinases (STRIPAK), אשר אנחנו ואחרים לסבך^8,12הארגון שלד התא אקטין. פגם העיקריים העוברים מוטציה Strip1 הוא היווצרות והמזודרם צירית (צומת וצלחת notochordal) והסיומת של הציר גישה antero-אחוריים הגוף. השתמשנו SEM ו- WMIF כדי לנתח את צומת ואת צלחת notochordal פראי-סוג (WT), העוברים מוטציה Strip1 כפי שנראה נציג תוצאות , דמויות המתאימים.

Protocol

כל הניסויים מעורבים ניסויים בבעלי חיים אושרו על-ידי השלטונות אחראי צפון ריין ווסטפליה (LANUV-NRW).

1. סריקה מיקרוסקופ אלקטרונים של הצומת עובריים בעכבר

1. להקריב את העכבר נקבה בהריון ~ E7.5 (שלב somite 2-4) מאת נקע בצוואר הרחם. הסבר מפורט עם דיאגרמות 1.1 שלבים - 1.7 זמין העכבר עובר מעבדה מדריכים¹³.
2. לפתוח את הבטן דרך העור, mesenteries ולהסיר את הרחם באמצעות מספריים ומלקחיים בסדר.
3. לשטוף את הרחם בקצרה במים מזוקקים ולמקם אותו בצלוחית קטנה נקייה (6 ס מ) המכיל 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS).
4. תחת לנתח מיקרוסקופ באמצעות מלקחיים בסדר, הסר את שרירי הרחם כדי לשחרר את deciduae בודדים או את ההשתלה.
5. להחזיק כל רותמי עם זוג מלקחיים ולהשתמש הזוג אחרים עושים חתך אורכי מלא-עובי בין החלק האדום (בעתיד השליה) לבין החלק הלבן (שבו העובר נמצא). לבצע ניקובים שטחית אנכית לאורך החלק הלבן של רותמי רציף עם החתך. להפריד את רותמי אופקית לשני חצאים, ולהוציא בזהירות העובר על החלק הלבן של רותמי.
6. להעביר את העובר חדש פטרי (35 מ מ) עם PBS סטרילי-מסוננים טריים. חזור על כל deciduae/העוברים.
7. הסר את הממברנה של רייכהרט, ממברנה אטומה יחסית שתבלע את העובר, מתוך כל העובר על ידי להקניט זה משם כמו גרב החל מ- קונוס ectoplacental (אתר ההשתלה אדמדם). עבור genotyping, לקחת חתיכה קטנה (~ 0.1 מ מ²) של שק החלמון בשלב זה.
8. תחת ברדס כימי ועונדת הגנה הולמת (כפפות), העברת העוברים EM כיתה מקבע המורכב גלוטראלדהיד 2.5% ב- PBS סטרילי-מסוננים צינור microcentrifuge (1.5 מ"ל) בטמפרטורת החדר. לתקן את העוברים בין לילה ב 4 º C.
9. בזהירות להסיר את מקבע גלוטראלדהיד מהצינור בלי לגעת העוברים וזורקים במיכל אשפה נאותה. לשטוף את העוברים שלוש פעמים ב- PBS סטרילי-מסוננים, למשך 15 דקות לכל בטמפרטורת החדר.
10. מייבשים את העוברים בסדרה אתנול למשך 5 דקות: 50%, 70%, 85% ושלוש פעמים ב 100% או אתנול מוחלטת. לאחסן את העוברים על −20 ° C אתנול או ישירות לשלב הבא.
11. העברת העוברים אתנול סלים עבור נקודה קריטית ייבוש (שיקגו) במכונת מייבש נקודה קריטית. למלא את התא עם אתנול כדי לכסות את הסלים לחלוטין.
12. חילופי האתנול על ידי בקפידה שטיפה עם נוזלי CO₂ עבור עשר פעמים ב 10 מעלות צלזיוס. לנקז את הנוזל CO₂ לאחר השלב האחרון עד החדר חצי מלאה. מחממים עד 40 ° צלזיוס עד הלחץ מגיע 80 ברים (נקודה קריטית) ומשנה נוזלי CO₂ לגז. לחכות 10 דקות ואז לאט לאט לפוצץ את הגז על פני כ- 45 דקות.
13. כחלופה קל רופאות לייבוש, להוסיף hexamethyldisilazane (HMDS) ביחס של 1:1 העוברים אתנול למשך 30 דקות. ואז להעביר העוברים HMDS טהורה במשך 30 דקות הסר העוברים מתוך הנוזל באמצעות פיפטה ולהשאיר אותם להתייבש למשך 30 דקות.
    הערה: שתי השיטות ייבוש עבד לא פחות טוב בידיים שלנו.
14. להשתמש במברשת בסדר כדי לעלות את העוברים מיובשים עם הצד הבטני (צומת) על ספח SEM עם קלטת צדדית כפולה.
15. הכנס את הספחים עם העוברים מכונה ציפוי לרעוד. להוציא לציפוי זהב חלקיקים, אשר מעדיפים להאשים את cilia דק ארוך. למרוח שכבה של 120-150; השעה היא תלויה הנוכחי, אשר משתנה בהתאם כל דגימה.
16. למקם את הספחים מצופה עם עוברי מיקרוסקופ SEM, להחיל ואקום ולבחון את צומת עובריים והתאים notochordal צלחת עם cilia-הגדלה ועד 1000 X 15, 000 X.

2. כל הר Immunofluorescence של עכבר צומת ואת צלחת Notochordal

1. באמצעות PBS קר כקרח עם 0.05% Tween 20 (PBSTw), בצע שלבים 1.1-1.7 לעיל כדי להסיר את העוברים על E7.75 ומניחים אותם ב- PBSTw ב 35 מ מ פטרי על קרח.
2. תחת ברדס כימי ועונדת הגנה הולמת (כפפות), העברת העוברים פתרון לשבועיים של paraformaldehyde 4% ב- PBS צינור microcentrifuge. לתקן את העוברים בין לילה ב 4 º C.
3. בזהירות להסיר את paraformaldehyde לשבועיים מהצינור בלי לגעת העוברים וזורקים במיכל אשפה נאותה. לשטוף את העוברים שלוש פעמים ב- PBS המכיל 0.2% טריטון X-100 (PBSTr) למשך 5 דקות כל בטמפרטורת החדר. מבצע כל שטיפת ואת הצעדים הבאים הדגירה מטרף nutating.
4. להסיר בכביסה האחרונה ולהוסיף חסימה לאודנום PBSTr עם 10% לא פעיל חום סרום (מן המין המארח של הנוגדן משנית). בלוק של שעתיים עד לילה (או יותר) על nutator ב 4 º C.
5. להסיר את חסימת ולהוסיף ~ 1 מ"ל של נוגדן ראשוני מעורבבת עם חסימת פתרון, למשל נוגדן anti-T-שבערך דילול. דגירה ללילה (או יותר) על nutator ב 4 º C.
6. להסיר את הנוגדן הראשי ולשמור אותו לשימוש מאוחר יותר על-ידי הוספת אזיד הנתרן ריכוז סופי של 0.02% (1 µL של המניה 20% 1 מ"ל של נוגדן פתרון). הנוגדן חוזר ~ 10 פעמים. לשטוף את העוברים פעמיים עם PBSTr ולאחר מכן לשטוף אותם שלוש פעמים במשך 30 דקות כל אחד ב- nutator-4 מעלות צלזיוס.
7. החלף בכביסה קרינה פלואורסצנטית מצומדת משני נוגדן, נגד המין מארח נוגדן ראשוני, מדולל ב ~ 1:1000 לילה (או יותר) על nutator ב 4 º C.
8. להסיר את הנוגדן משני ולשטוף פעמיים עם PBSTr, ואז לשטוף שלוש פעמים במשך 30 דקות עם PBSTr.
9. החלף את השטיפה האחרונה PBSTr המכיל שבערך מצומדת זריחה phalloidin, כתם F-אקטין, ו 1:1000 דאפי, כתם גרעינים, לשעה בטמפרטורת החדר.
10. לשטוף פעמיים ב PBSTr, לשטוף פעם עם PBSTr למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
11. להחליף את PBSTr עם PBS ולהשאיר את העוברים על קרח. להכין שקופיות נקי מפרוטונים שמטענם (60 x 24 מ מ) ואת coverslips (24 x 24mm) ומדיה הרכבה מבוסס-גליצרול מימית, לדוגמה, גליצרול 90% ב- 1xPBS ' של ריאגנט antifade, כדי לטעון את העוברים.
12. לשים שני חלקי הסרט השקוף ממרחק של ~ 15 מ מ אחד מהשני על החלק ברורה של השקופית. פעולה זו תיצור די שטח תלת-ממדיים (בממד Z) שיאפשר שיטוח העוברים אבל לא לגמרי מועכים אותם.
13. תחת מיקרוסקופ ויבתר, הזז בזהירות את העוברים באמצעות פיפטה P200 לחתוך (כדי לאפשר די שטח עבור העובר להיות מועברים, לא ניזוק) לשקופית.
14. בעזרת מלקחיים בסדר, לעשות שני חתכים מלאה על הצד הלטראלי של שק החלמון להתגלות העובר. למקם את העובר עם הצד הבטני (צומת וצלחת notochordal) למעלה (הגבי של שפופרת פגמים בתעלה למטה על השקופית).
15. הוסף µL 50 הגוברת מדיה על העובר. מקום 4-5 העוברים לכל שקופית. להוסיף טיפה של הרכבה מדיה לצד של coverslip זה יהיה קודם לגעת השקופית (צד עליון או תחתון), ואז למקם אותו בפישוק על שתי חתיכות של הקלטת להוריד אותו באיטיות אל העוברים באמצעות מלקחיים בסדר או מחט בסדר כפופות תוך הימנעות יצירת בועות אוויר.
16. נקה התקשורת הרכבה עודף באמצעות של ניגוב סופג. יש להיזהר לא לעבור את coverslip בתהליך.
17. באמצעות כמות נדיבה של לק, חותם את צידי coverslip מבלי להזיזו.
18. להתבונן תחת מיקרוסקופ קונפוקלי סריקה.

Results

כדי לבחון את היווצרות הצומת של WT ו Strip1 עוברי מוטציה ב ~ E7.5, השתמשנו SEM כפי שמתואר בשלב 1 באיור איור 1⁸. הפרטים ultrastructural של הטופולוגיה החיצוני באמצעות SEM היו די אינפורמטיבי, היה ברור כי בניגוד הצומת בצורת בור ב WT עוברי, העוברים המוטציות היה צומת שעברו שיטוח ולא סדירות. הגדלה גבוהה יותר של העוברים הראה את cilia אופיינית על תאים צומת זיהה אותם חד משמעית. הצפיפות נמוכה יותר לעין של cilia ב החשבונאי ייתכן המיוחס אובדן מבנה בור צומת, עקמומיות או מספר נמוך יותר של צומת תאים. הצלחת notochordal המופיע emanating מהצומת היה גם לא-סדירה העוברים מוטציה. הם היו לזיהוי עם cilia שלהם קצר יותר. לכן, SEM היה חשוב לחשוף את הליקויים מורפוגנזה צומת מוטציות Strip1 ⁸. גם השתמשנו SEM במחקרים קודמים כדי להראות העדר cilia הצומת עובריים של מוטציות חסר centrioles, המספקים את התבנית cilia⁹.

ללמוד את והמזודרם צירית היווצרות פגמים Strip1 עוברי מוטציה ברמה התאית, השתמשנו WMIF כפי שמתואר בשלב 2, המוצגת באיור2. בעזרת טכניקה זו, הצומת ואת צלחת notochordal בקלות אותרו על ידי F-אקטין ו T מכתים. צומת WT ותאים צלחת notochordal יש לכודים תחומים הפסגה שבו הועשר F-אקטין, צביעת T הגרעין היה ברור. הצלחת notochordal מורחב rostrally ב WT אבל היה קצר, לא-סדירה החשבונאי. הנתונים הראו כי הארגון F-אקטין היא חריגה בשכבות נבט שונים של העוברים המוטציות כולל מפוח והמזודרם⁸. לפיכך, WMIF היה תפקיד חשוב ללמוד את הליקויים בצומת ו צלחת notochordal-צורה Strip1 עוברי מוטציה.

איור 1 . מיקרוסקופ אלקטרונים סורק חושף את הליקויים בעבודת צומת מורפוגנזה ב Strip1 בעכבר מוטנט עוברי. (למעלה) SEM ניתוחים של WT ו Strip1 הגחוני מוטציה עובריים צמתים, צלחות notochordal (Noto)⁸. דוגמה של תמונת הגדלה נמוכה של העובר WT המוצג בצד השמאל. (למטה) הגדלה גבוהה יותר של מרכז הצמתים המוצג על גבי חושף את monocilia זמן מקרין התאים צומת. קדמי, נמצאת כל החלוניות. גודל ברים: 30 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2 . הר שלמה immunofluorescence מציג את צומת חריג וצלחת notochordal ברמה התאית עוברי מוטציה Strip1 . (למעלה) הגחון 3עיבוד (התוכנה Volocity) של WMIF על העוברים מוטציה WT ו Strip1 באמצעות שילוב של phalloidin מצומדת קרינה פלואורסצנטית (F-אקטין, אדום) ו- T מכתים נוגדנים (ירוק). (למטה) דוגמאות נוספות ההכתמה המוצגות לעיל התמקדות הצומת עם זום גבוה יותר, כולל דאפי. קדמי, נמצאת כל החלוניות. גודל ברים: 30 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

בעבודה זאת, נדגים כיצד לבצע SEM, WMIF כדי להמחיש את הצומת עובריים בעכבר וצלחת notochordal. גודל קטן של עוברי העכבר gastrulating ~ E7.5 ואת נוכחותם של מבנים אלה על פני להפוך אותם אידיאלי ללמוד באמצעות טכניקות תיאר^2,7,8. הזמינות של נוגדנים טובים, כגון סמני T ו- cilia, נותן מצוינים נתוני תלת-ממד באמצעות WMIF על מבנה, ארגון היווצרות אלה חיוניים המארגנים עובריים⁸.

בגלל התפתחות עובריים בעכבר מתקדם בקצב מהיר מאוד ולא צומת ואת צלחת notochordal נמצאים רק transiently על פני השטח של העובר, תזמון חיוני להצלחה של ניסויים אלה,^2,3. לדוגמה, 2-4 somite עוברי טובים לניתוח SEM של בור צומת בוגרת עם cilia ארוך. ב הרבה מוקדמות או מאוחרות יותר עוברי (לדוגמה, 12 שעות לפני או אחרי), הצומת לא יהיה נוכח על פני השטח. WMIF קצת יותר גמיש בהקשר זה אבל המבנים עצמם הם גם חולף במהלך הפיתוח, העיתוי תלוי במקרה זה על האינטרסים החוקרים.

הטוהר של ריאגנטים היא חיונית להצלחת שיטות אלה, ובמיוחד בודק את ultrastructure על ידי זיהומים זעירה ב- SEM. זה מקל העוברים בדרך כלל לגרום חפצים ענק.

בדקנו את שתי שיטות שונות של העובר קיבוע עבור SEM אחד באמצעות לשבועיים של חצי Karnovsky (2.5% גלוטראלדהיד, מאגר cacodylate paraformaldehyde ו- 0.1 M 2%) וגלוטראלדהיד פשוטים יותר של 2.5% ב- 1 x PBS. אנו מעדיפים להשתמש גלוטראלדהיד מקבע PBS כפי שמתואר בשלב 1, עם זאת, אנחנו ואחרים יש להשתמש גם לשבועיים של Karnovsky חצי בהצלחה ב- SEM.

לנו יש גם בהשוואה שתי שיטות של מייבש את העוברים SEM ולא מצאו שום הבדל באיכות הדגימה באמצעות נקודה קריטית מייבש או HMDS כפי שמתואר בשלב 1 ודיווח במקום אחר¹⁴.

שלב 2, בדקנו הטבעה העוברים לאחר כביסה סופי בשלבים 1% agarose ההיתוך נמוכה רכוב על צלחת זכוכית-התחתון 35 מ מ, ואז ציפוי עם ~ 10 µL של הרכבה בינונית. שיטה זו ההטבעה עובד ושומר את המבנה התלת-ממד המקורי של העובר מבנים הקשורים; עם זאת, מיקרוסקופ multiphoton נדרשת תמונה הדגימה כי מיקרוסקופ קונפוקלי הרגיל לא יכול להגיע עמוק לתוך העוברים תקין (~ 1 מ"מ).

אנו מאמינים כי שיטות אלה שני נותן משלימים מידע על המבנה של הצומת, את הצלחת notochordal במהלך התפתחות נורמלי מוטציות שמראים פגמים על היווצרות מבנים אלה.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,1,1,3,3,3,3 Hexamethyldisilazane (HMDS)	Carl Roth	3840
נוגדן Anti-T	R& D Systems	AF2058
בלייזרים	למייבש נקודה קריטית	Union CPD 020
DAPI	AppliChem	A4099,0005
תמיסת גלוטרדיאלדהיד 25%	Merck	1042390250
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100-100ML
Tween 20	AppliChem	A4974,0500
יחידת ציפוי SEM עזרי אגר	PS3 למיקרוסקופ אלקטרונים	מיקרוסקופ PS3
SEM קוונטי FEG 250	ThermoFisher Scientific (FEI)	קוונטי FEG 250