אינטראקציה תא הדמיה ב רירית והכו אותי במהלך זיהום בנגיף שפעת באמצעות מיקרוסקופ שני הפוטונים Intravital

מיקרוסקופ שני הפוטונים intravital (P 2-IVM) היא טכניקה יעילה בזמן אמת הדמיה של אינטראקציות לתא כפי שהן מופיעות בתוך הסביבה הטבעית שלהם¹. אחד היתרונות העיקריים של שיטה זו הוא שהיא מאפשרת חקר תהליכים תאיים בעומק הדגימה גדולה יותר (500 מיקרומטר עד 1 מ מ) לעומת מסורתיות אחרות הדמיה טכניקות². במקביל, השימוש של שני פוטונים אנרגיה נמוכה שנוצר על ידי לייזר שני הפוטונים ממזער את צילום-הנזק לרקמות הקשורות בדרך כלל תהליך רכישת תמונה². במהלך העשור האחרון, P 2-IVM הוחל ללמוד סוגים שונים של תאים תאים אינטראקציות מספר דיסציפלינות^3,4,5. מחקרים אלו היו רלבנטיות במיוחד לחקור תאים חיסוניים, המאופיינים דינמיות גבוהה שלהם ואת היווצרות הקשר בולטת בעקבות את האותות שנוצר על ידי תאים אחרים ועל הסביבה. 2, P-IVM הוחל גם ללמוד את האינטראקציות בין פתוגניות וכן שורה⁶. ואכן, בעבר הוכח כי כמה פתוגנים ניתן לשנות את סוג ואת משך הקשר בין תאים חיסוניים, פוגעות, כתוצאה מכך, את התגובה החיסונית⁷.

רירית דרכי הנשימה הוא האתר הראשון שבו היא התגובה החיסונית נגד פתוגנים מוטס שנוצר⁸. לכן, אין ויוו ניתוח של פתוגן-פונדקאי אינטראקציות בתוך הרקמה הזו הוא קריטי להבין אתחול של מנגנוני ההגנה מארח במהלך זיהום. עם זאת, P 2-IVM של דרכי הנשימה הוא מאתגר בעיקר בשל הממצאים המיוצר על ידי מחזור נשימה של החיה, אשר פוגעת התהליך של ייבוא תמונות. לאחרונה, מודלים כירורגיים שונים תוארו עבור הדמיה מאתר את קנה הנשימה^9,10,11,12 ו הריאות^{13,14,15, 16}. P 2 בקנה הנשימה-IVM דגמים מייצגים של הגדרת מצוינת להמחיש את השלב הראשוני של התגובה החיסונית את דרכי הנשימה העליונות, ואילו הריאה-alveoli 2, P-IVM מודלים מתאימים יותר ללמוד לשלב מאוחר של זיהומים. הדגמים ריאות מפותחות להציג מגבלה הקשורים עם הנוכחות של alveoli מלא אוויר, אשר מגבילים את חדירת הלייזר אופטי, להפוך את שכבת הרירית של דרכי הנשימה intrapulmonary נגיש עבור ויוו הדמיה¹⁷ . לעומת זאת, המבנה של קנה הנשימה, שהוקמה על ידי האפיתל רציפה, מקלה על ייבוא תמונות.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול הכולל תיאור מפורט של כל השלבים הדרושים לביצוע שפעת זיהום, הכנה כירורגי של בעלי החיים, P 2-IVM של חוליות הצוואר. בנוסף, אנו מתארים את מלכודת ניסיוני ספציפי עבור הפריט החזותי של נויטרופילים, תאים דנדריטים (DC), שני סוגי תאים חיסוניים לשחק תפקיד חשוב בתור מגשרות של מנגנון ההגנה נגד שפעת וירוס^18,19 . לבסוף, אנו מתארים הליך ניתוח אינטראקציות נויטרופילים-DC. אנשי קשר אלה הוכחו לווסת DC הפעלה, ובהמשך, להשפיע על תגובות מערכת החיסון נגד פתוגנים²⁰.

כל ההליכים בבעלי חיים עכברים מעורבים בוצעו על פי הנחיות המשרד הווטרינרי הפדרלי השוויצרי ופרוטוקולים בעלי חיים אושרו על-ידי השלטונות הווטרינר המקומי.

1. שפעת זיהום של CD11c-YFP עכברים

1. אבטחה
   הערה: המתח העכבר מותאם של שפעת H1N1 ריקו/8/34 A/Puerto (PR8) גדל בהביצים, מטוהרים, טיטרציה כפי שתואר לעיל²¹. כל השלבים הכרוכים חיות נגועות או דגימות ביולוגיות היו מתבצעות תחת אבטחה ארון לפי רמת אבטחה (BSL) 2 התנאים.
   1. לנקות את הארון אבטחה עם פתרון אתנול 70% לפני ואחרי ההליך זיהום.
   2. למחוק את כל פסולת חומרים המיוצרים במהלך הליך זה בעקבות נכונה מי הנחיות אבטחה (http://www.who.int/csr/resources/publications/biosafety/Biosafety7.pdf). להשליך פסולת מוצקה בסלי autoclavable ונוזלים מזוהמים בשקיות פלסטיק מלא 70% אתנול פתרון או חיטוי רפואי.
2. זיהום תוך-אפי שפעת
   הערה: B6. 1Mnz/J (CD11c-YFP) cg-Tg(Itgax-Venus)²² על רקע C57BL/6J השתמשו במחקר זה. עכברים היו מתוחזקים ספציפי פתוגן-חופשית במתקן במכון למחקר וההתערבות.
   1. מקום מקסימלית של 5 גיל - ו סקס-מתאימים (שישה בן שבוע 8) עכברים CD11c-YFP בכל כלוב. המתן לפחות יומיים עבור עכברים להתאקלמות לתנאי דיור לפני ההליך זיהום.
   2. הפשרה PR8 מניות ולהכין דילול המתאימים באמצעות קר x 1 מאגר פוספט תמיסת מלח של Dulbecco שונה ללא סידן כלוריד, מגנזיום כלוריד (PBS) בריכוז הסופי של 200 יחידות ויוצרים רובד (PFU) ב- 30 µL. לשמור על וירוס דילול על קרח במהלך כל התהליך.
      הערה: טיטור של כל אצווה של וירוס שפעת לפני השימוש בו מומלץ להבטיח מנה מדויקת זיהום.
   3. תזריק מנה של קטאמין (100 מ ג/ק ג), חריגות השירותים הווטרינריים (10 מ"ג/ק"ג) intraperitoneally (i.p.) בעזרת מזרק 1 מ"ל של המחט 26 גרם.
   4. המתן עד העכבר הוא מורדם לחלוטין (אובדן מוחלט של רפלקס הנסיגה שקמה בעצמה אחרי שמפילים והן פדלים). הרדמה עמוקה הוא הכרחי עבור דלקת אופטימלית, מאז עכברים מורדם לחלוטין לא לבלוע או לגרש את inoculum וירוס, שמוביל בווריאציות המינון זיהום.
   5. הנח את העכבר anesthetized במצב פרקדן. לאסוף את µL 15 של וירוס inoculum. מקם את הטיפ פיפטה קרוב בנחיר השמאלי בעכבר, לוותר על inoculum ויראלי טיפה על ידי ירידה. כפי חייב להיות בשאיפה טיפות, לא pipette אותם ישירות בתוך חלל האף.
   6. לחכות 2-5 דקות ומניחים את הטיפ פיפטה שמכילה את µL 15 הנותרים של וירוס inoculum של נחיר צד ימין.
      הערה: כדי למנוע חנק, לוותר על גודל קטן טיפות במרווחים s כ-20.
   7. בדוק העכבר הוא נושם כהלכה ולמקם אותו בכלוב לרוחב חמצן. לפקח על העכבר נשימה והרדמה השחזור (כ 60 דקות לאחר אינדוקציה).
      הערה: זה אפשרי להדביק את העכבר יותר 1 בו זמנית. במקרה זה, לנהל inoculum ויראלי בתוך הנחיר השמאלי של עכברים כל ברצף, המתן 2 – 5 דקות ולאחר מכן לנהל את הוירוס בכל נחיר צד ימין. כדי למנוע את השתנות בין אנשים, להדביק עכברים לא יותר מ 3 באותו זמן.
   8. לפקח על מצב בריאות בעלי חיים וירידה במשקל מדי יום.
   9. המתת חסד עכברים לפי נקודת הקצה הומאני שיקבע. להנחיות רשות. השיטה המתת חסד יאושר על-ידי השלטונות ניסויים בבעלי חיים, ויש לכבד תקנות אתיות מקומיות. לאחר ניסויים שני הפוטונים, המתת חסד עכברים על ידי הממשל של מנת יתר של קטמין/חריגות השירותים הווטרינריים ואחריו נקע בצוואר הרחם. בניסויים כל אחרים, ונשתמש באינהלציה₂ CO כשיטה על המתת חסד.
      הערה: כדי למדוד את titers ויראלי של קנה הנשימה נגוע, 50% תרביות רקמה זיהומיות מינון (TCID50) assay או בזמן אמת תגובת שרשרת פולימראזית (RT-PCR) assay יכול להתבצע כפי שתואר לעיל²³.
3. הערכה של נויטרופילים הגיוס בקנה הנשימה על ידי cytometry זרימה
   הערה: חלק זה של הפרוטוקול היא אופציונלית. מטרתו להעריך את גיוס נויטרופילים רירית והכו אותי בעקבות שפעת זיהום.
   1. המתת חסד נגוע ולא נגוע השליטה עכברים-יום 3 לאחר הפגיעה (חוקר פרטי) על ידי שאיפת₂ CO.
      הערה: כדי למנוע נזק בקנה הנשימה, הימנע משימוש נקע בצוואר הרחם לצורך המתת חסד של בעלי חיים. בנוסף, זלוף של עכברים לאללה מומלץ כדי למנוע זיהום של דם נויטרופילים.
   2. לרסס על הצוואר עכבר עם 70% אתנול פתרון ולבצע חתך בעור באמצעות מספריים כירורגיים מהחזה עד הסנטר.
   3. להפריד את בלוטות הרוק באמצעות מלקחיים ולחשוף את קנה הנשימה.
   4. לנתח את השרירים סביב קנה הנשימה באמצעות מלקחיים ומספריים.
      הערה: שלב זה חייב להתבצע בקפידה מאז קנה הנשימה יכולה להיפגע בקלות במהלך ההליך.
   5. . תחזיק את קנה הנשימה עם מלקחיים ולנתק בקפידה הוושט על ידי ניתוח.
   6. מחזיק את החלק intrathoracic של קנה הנשימה עם מלקחיים, לעשות חתך בתחילתו של עץ הסמפונות. לאחר מכן לנתק את קנה הנשימה של הגרון, הסר בזהירות את כל מערכת השרירים נשאר.
   7. מקם את האיבר צינור 1.5 mL המכיל RPMI 1640 + בינוני HEPES (RPMI) על קרח.
   8. להכין לתערובת אנזימים לעיכול קנה הנשימה, המכיל 0.26 יחידות/mL של collagenase (I ו- II) ו- 0.2 מ"ג/מ"ל של DNase אני ב RPMI.
   9. מקום קנה הנשימה ביתור צלחת 6-ובכן המכיל 1 מ"ל של תערובת אנזימים.
   10. חותכים את האיבר לחתיכות קטנות עם העזרה של מלקחיים ומספריים. לקחת את הצלחת על קרח במהלך שלב זה.
   11. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות. במהלך תקופה זו, לנער את הצלחת כל 15 דקות.
   12. לעצור את אנזים העיכול על-ידי הוספת 1 מ"ל FACS כביסה מאגר (2 מ מ EDTA ו- 2% חום-לא פעיל מחוטא-מסנן עוברית שור סרום (FBS)) ב- PBS.
   13. Resuspend הפתרון עם פיפטה 1 מ"ל לעזור כדי לבטל שיוך של החלקים מעוכל חלקית של רקמות.
   14. להעביר את הפתרון טוב אחר על-ידי העברת התוכן דרך מסננת מיקרומטר 40. ואז, בעדינות לרסק את החלקים הנותרים של האיבר לכוד על גבי מסננת בעזרת פומפה מזרק 2 מ"ל.
       הערה: הסמאשינג חתיכות מעוכל חלקית של קנה הנשימה מעל מסננת הוא שלב קריטי להשגת מספר אופטימלי של תאים במהלך ניתוח תזרים cytometric.
   15. לשטוף היטב, את מסננת עם FACS שטיפה מאגר והעברת ההשעיה בצינור מ ל שמר על קרח.
   16. Centrifuge הצינורות ב x 166 g למשך 5 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend תאי µL 100 FACS כביסה המאגר.
   17. להמשיך עם צביעת משטח נוגדנים עבור cytometry זרימה. בקצרה, לחסום קולטנים Fc של תאים מבודדים באמצעות נוגדן נגד CD16/32, ואחריו צביעת משטח. לזהות כראוי נויטרופילים, לוח cytometry זרימה צריך להכיל נוגדנים הבאות: αLy6G, αCD11b, αCD45, כמו גם את הכדאיות של לצבוע כדי לא לכלול תאים מתים.
   18. להפעיל את כל תכולת הדגימות cytometer זרימה ולנתח את הנתונים.
       1. כדי לקבל מספר אופטימלי של תאים חיסוניים, הפעל התליה תא בודד במהירות לא גבוה מ-3000 אירועים/s. פעולה זו תקטין את מספר האירועים לא נכלל במהלך הרכישה. באמצעות פרוטוקול זה, זה צריך להיות אפשרי להשיג 1 עד 2 מיליון תאים לכל קנה הנשימה.

2. בידוד, הזרקה של נויטרופילים

הערה: בהליך זה, B6.129 (ICR)-Tg (חטיבתי-ECFP) CK6Nagy/J עכברים (CK6-ECFP) היו בשימוש²⁴. בעלי חיים אלה מבטאים CFP כל סוגי תאים תחת האמרגן β אנושי-אקטין. לחלופין, זה גם ניתן להשתמש C57BL/6J עכברים כדי לבודד תאים תכתים אותם לפי הפרוטוקול המתואר בשלב 2.6... לטיהור ודה -מניפולציה של נויטרופילים עשוי להגדיל את מצב ההפעלה שלהם, שעשוי להיות שינוי מאפייניהם נודדות ופונקציונליים.

1. להרדימו באמצעות אינהלציה₂ CO.
2. להסיר את עצמות הירך והן tibias ולנקות אותם בעדינות באמצעות מלקחיים.
3. לחתוך עצם epiphyses ותוציאו את מח העצם באמצעות מזרק 1 מ"ל מלא PBS קר סטרילי, צינור 50 מ ל שמר על קרח.
4. Resuspend התאים עם מחט 18 גרם ולסנן את המתלים תא עם מסננת 40 μm. לשטוף פעם עם PBS ב 110 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C, resuspend בתאים 2 מ של PBS קר.
5. לדלל 100% Percoll 9:1 ב- 10 x PBS ולהכין פתרונות הדרגתי של percoll 72%, 64% ו- 52% באמצעות 1 x PBS. בזהירות שכבה 2 מ ל כל אחד שלושה מעברי הצבע בשפופרת 15 מ"ל, החל מהכי מרוכז אחד.
   1. להוסיף בזהירות 2 מ"ל של התליה תא מח עצם על גבי מעברי צבע ואת צנטריפוגה ב x 1,100 g למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT) ללא האצה בלם.
6. בזהירות להסיר את הלהקה על הממשק בין 64% ל- 72% ולשטוף אותו פעם ב 200 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C עם PBS קר. Resuspend בתאים נפח של 100 μL ל- PBS ולשמור אותם על קרח. הטוהר של נויטרופילים צפוי להיות גבוה מ- 90%.
7. באופן אופציונלי, תווית נויטרופילים עם ערכת התפשטות תאים באמצעות הפרוטוקול של היצרן. להוסיף את צבען התליה תא כדי ריכוז סופי של μM 10 בנפח של 1 מ"ל, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, לשטוף (166 x g, 5 דקות).
8. הערכת הריכוז התא באמצעות hemocytometer של, להזריק לווריד 5 x 10 תאים⁶ באמצעי אחסון מרבי של 100 μL בעכברים CD11c-YFP⁺ נגוע בעבר באמצעות מזרק 1 מ"ל המחט 26 G, h 12 לפני הדמיה.

3. מכינים את העכבר עבור הדמיה

1. הרדמה
   1. עזים ומתנגד עכברים נגועים CD11c-YFP⁺ -יום 3 חוקר פרטי לפי שלב 1.2.3.
   2. ברגע עכברים הם מרדימים עמוקות, להכין צנתר בהרדמה מינון מחדש.
      1. הסר את מחט 30 גרם של מזרק באמצעות מלקחיים.
      2. הכנס את המחט כדי חתיכה 20 ס מ של צינורות סיליקון רפואיות PE-10.
      3. הכנס מזרק המחט 30 גרם מלא קטמין/חריגות השירותים הווטרינריים תערובת בצד השני של הצינור.
      4. הסר את האוויר בתוך הצינור.
   3. להכין צנתר 20 גרם מחובר צינור ממכונת insufflating החמצן כדי לשמור על אוורור אוטומטיים (איור 1Aאני). . תפעיל את יחס נשימה של 130 פעימות לדקה (b.p.m.) עם נפח ענק של 0.2 מ"ל באמצעות ספק גז חמצן 100%.
2. להכין את העכבר לניתוח
   1. להשאיר את העכבר על לוח כירורגי המותאם אישית ספציפית (איור 1Aii-iii) מעל צלחת מחוממת או ספסל כירורגי מחוממת להגדיר ב 37 ° C עבור כל הזמן של הניתוח.
   2. לגלח את השיער מהצוואר של העכבר באמצעות מכונת גילוח, קרם depilatory (איור 1Bאני).
   3. הצב את העכבר מעל העכבר פלסטיק לפי מיקום (איור 1Aii-a), לשמור את בעלי החיים מחוץ מיקום (איור 1Bii) כדי ליצור זווית המאפשרת את צנרור של חוליות הצוואר.
   4. לתקן את forelimbs, את כפות רגליו, וזנב עם הדבקה, להרטיב את העכבר עיניים עם ג'ל ויטמין A מועשר ולחטא בצוואר העכבר (איור 1Bii).
3. ניתוח
   1. להכין פריטים בלוק כראוי, כלומר, מספריים, מספריים המיקרוכירורגית ו מלקחיים.
   2. לבצע חתך קטן על ציר זמן המדיאלי של הצוואר, כ 1 ס מ, באזור האמצעי בין העליון של החזה לבין הקו עובר דרך הנקודה התחתון של הלסת התחתונה (איור 1Bהשלישי).
   3. להעביר רוחבית החתכים בעור ואת בלוטות הרוק והמחש את קנה הנשימה, מכוסה על ידי השרירים. לאחר מכן, לנתח את שרירי הנשימה בזהירות עם המלקחיים (איור 1Bהשלישי).
   4. לצנרר את העכבר עם קטטר ולהתחיל בהנשמה (איור 1Bהרביעי).
      הערה: הצנתר מורכב חלק פלסטיק חיצוני, אשר מגן על רירית בקנה הנשימה, ואת המחט של ברזל פנימי. הנוכחות של המחט מייצג את הפתרון האידיאלי כדי להרחיב ולייצב את קנה הנשימה, לווסת את התערוכה שלה. בהנשמה דרך הקטטר יבטיחו נשימה נכונה של העכבר.
   5. להתחיל מיד האוורור מלאכותי צג עכבר נושם.
   6. לתקן את הקטטר גובה וכיוון בעזרת קרס כירורגי (איור 1Bv) מחובר מוט ספציפי על הלוח כירורגי (איור 1Aii-b). חושפים את קנה הנשימה באותו גובה של הסנטר.
   7. להקיף את קנה הנשימה עם וזלין, לכסות את זה עם כמה טיפות של PBS מחומם מראש כדי להבטיח לחות נכונה לאיבר (איור 1Bהשישי).
   8. הר של coverslip על ההכנה. בשלב זה, דבק coverslip על בעל מתכת (איור 1Bהשביעי), אשר להידפק למתרגם XYZ (איור 1Aii-c). להתאים את המתרגם XYZ למקם את coverslip על הכנת כירורגי.
   9. מקם את הצנתר עבור המינהל ההרדמה intraperitoneally (איור 1Bהשמיני).
   10. להזריק 50% של המינון ההתחלתי של קטמין/חריגות השירותים הווטרינריים תערובת כל 30 דקות.
       הערה: מחדש מינון של 50% עד 25% מכלל התערובת קטמין/חריגות השירותים הווטרינריים הראשונית היא חוקי ובטוח חלופי²⁵. עם זאת, כיוון פרוטוקול זה הוא מסוף קיבעון קפדנית של החיה הוא נדרש במהלך כל התהליך, להשתמש במינונים גבוהים יותר כדי לשמור על מטוס כירורגי עמוק של הרדמה.

4. in Vivo הדמיה בצילום מואץ

הערה: התמונה הרכישה בוצעה עם מיקרוסקופ שני הפוטונים זקוף, מצוידים עם שני Ti:Sa, טמפרטורה מבוקרת הדגירה קאמרית לייזרים של 25 X / נה 1.1 מים טבילה אובייקטיבי. Photomultipliers (PMT) המשמש עבור ייבוא תמונות היו היברידית גלאי או רגישות גבוהה חאספ.

1. הנח את לוח כירורגית עם העכבר anesthetized בתוך החדר הדגירה מיקרוסקופ (שחומם מראש ב 37-38 מעלות צלזיוס), להוסיף טיפת מים על coverslip.
2. מרכז ולמצוא להתמקד הרקמה בקנה הנשימה.
3. להגדיר את התדירות סריקה עד 800 הרץ, עם 520 x 520 פיקסלים, שדה ראייה של 440 x 440 μm² וקו 1 הממוצע.
   1. המנגינה Ti:Sa הלייזר 830 nm לגרות הדור השני הרמוני (SHG) של קולגן, עם כוח מעיד על מקור של 150 mW. לכוון את הלייזר Ti:Sa השני-920 nm עם 94 mW במקור, כדי לעורר CFP והן YFP.
   2. הגדרת 3D ומצב רכישת timelapse עם עירור בו זמנית
      הערה: שמור את הכוחות לייזר נמוך ככל האפשר למזער את photobleaching ואת phototoxicity.
4. קרינה פלואורסצנטית הרשומה באמצעות שני ערוצים במצב הלא-descanned, עם מראה ודיקרואיק זוהר מאסטר-560 ננומטר. בקביעת בשימוש פרוטוקול זה, מראה ודיקרואיק זוהר השנייה לפצל את האות ב 495 ננומטר כדי להפריד בין ערוץ 1 (מסנן פליטה 475/50) של ערוץ 2 (מסנן פליטה 525/50) (איור 2 א). תצורה זו אוספת SHG אור קולגן בערוץ הראשון, בעוד פליטת CFP נאסף בשני ערוצים 1 ו-2 YFP נאסף רק בערוץ 2.
5. הגדר את טווח μm 50 לאורך ציר Z, עם גודל צעד של 3 μm (voxel בגודל 0.86 μm x 3 μm). שיא תמונות כל 30 s עבור משך סך של 30 דקות.
6. במידת הצורך, לרכוש אזורים מרובים. לפני הפעלת רכישות נוספות, לבדוק סימנים חיוניים, מזריק הרדמה דרך הקטטר במידת הצורך (ראה שלב 3.3.10).
7. בסופו של תהליך ההדמיה, המתת חסד את העכבר דרך יתר חריגות קטמין/השירותים הווטרינריים ואחריו נקע בצוואר הרחם.

5. התמונה עיבוד וניתוח כמותי של נויטרופילים-DC תנועתיות ואינטראקציה

הערה: פרוטוקול זה, תוכנת הדמיה מיוחדת שימשה לניתוח הנתונים מיקרוסקופ.

1. לאחר השלמת ייבוא תמונות 4D, להעביר את הקבצים (נתונים ומטא) בתחנת עבודה עם מספיק משאבים חישובית (הציע דרישות המערכת המינימליות: 32 GB זיכרון RAM, מעבד מהיר solid-state כוננים, האחרונים, הקדיש GPU על בסיס בנפט אדריכלות במקביל).
2. לפתוח את הקבצים בתוכנת הדמיה.
3. להפעיל את הווידאו, ודא כי התאים עניין הם נראים בבירור חפצים הדמיה נעדרים.
   הערה: למטרה זו, ודא כי שניהם התנועה של המדגם, וריאציית בהירות נכלאים מספיק. ואכן, אלה מייצגים אתגרים עבור ניתוח אוטומטי²⁶. אם התנועה של המדגם בין מסגרות סמוכות היא מוגזמת, להחיל שיטת תיקון להיסחף, שימוש בערוץ SHG למשל כנקודת התייחסות קבועה. זה מאפשר מדד טוב יותר את תנועת התאים ולא את התנועה של המדגם. בנוסף, בנוכחות רקע בהיר או פסולת, לגזום את המשטחים שוחזר באמצעות אחסון כפרמטר הבחירה.
4. ליצור ערוץ לוקליזציה של שותף ספציפי עבור תאים CFP⁺ , על מנת להפריד את האות בין CFP הקולגן (SHG). לשם כך, מציינות מצולע חסימה (איור 2Bאני) בוחר רק את voxels בעל עוצמה חיובית לערוץ הצבע הירוק והן בתוך ערוץ הצבע הכחול.
   הערה: הליך זה עשוי להשתנות לפי ערכת מסנן המיקרוסקופ ההכתמה של התאים. זה יכולה להיות מושגת על-ידי בחירה רק voxels בעוצמה מספקת הירוק והן את הערוצים הכחולים. בין הכלים המצויים, הפונקציונליות "coloc" יכול לשמש כדי לחשב באופן אוטומטי את ערוץ colocalization מבוסס על עוצמת סף. בנוסף, ניתן להשתמש בשיטות מבוסס על לומדות בשלב זה עם הפיקוח של מומחה²⁷.
5. לזהות ולעקוב אחר תאים CFP⁺ , באמצעות שחזור אוטומטי פני שטח ומעקב (כלי השטח) מעל לתעלה לוקליזציה שותף מתאים.
   הערה: curation ידנית של שגיאות מעקב בסופו של דבר להדרה של מסלולים עם משך קצר יותר מסף מוגדרים (קרי, 150 s) עשוי להידרש.
6. ליצור ערוץ לוקליזציה של שותף ספציפי עבור תאים CD11c-YFP⁺ , על מנת להפריד בין אותות CFP ו YFP. לשם כך, מציינות מצולע חסימה (איור 2Bii) בוחר רק את voxels שיש עוצמת חיובי בערוץ ירוק אבל בעצימות נמוכה בערוץ הצבע הכחול.
   הערה: micrographs ייצוגית מציג את האותות של ערוץ 1, ערוץ 2, ערוץ משותף לשפות אחרות עבור CFP, ערוץ משותף לשפות אחרות עבור YFP השילוב של כל הערוצים ניתן למצוא איור 2Bהשלישי.
7. לשחזר את פני השטח של התאים CD11c-YFP⁺ , לעקוב אחר המיקום שלהם לאורך זמן (משטח הכלי).
   הערה: תיקון ידני של שגיאות מעקב בסופו של דבר אין צורך בשלב זה. ואכן, בשל הדינמיקה-עתיים מורכבים של DC, שיחזור פני השטח שלהם מדויקות מנתונים 2, P-IVM הוא משימה מאתגרת זה אינה יכולה להיות מושגת עם תוכנה פילוח זמינים. בין הסיבות שהופכות את משימה זו מאתגרת, בליטות דק ווריאציות בהירות אינם מאפשרים את השימוש של טכניקות עיבוד תמונה מסוימת, כגון החלקה מסננים או סף סטטי. יתר על כן, ברשת של DC, קשה להפריד בין תאים בודדים בהתבסס רק על המראה שלהם. 2, P-IVM נתונים. על הסיבות האלה, יותר מאשר ניסיון של פילוח מדויק על-ידי כיוונון פרמטרים של התוכנה, אנו מציעים לשחזר משטחים שאינם מדויקות של DC. לטפל, על שגיאות אפשריות באמצעות מדדים חזקים, כמתואר ב- 5.8.
8. למדוד נדידת תאים.
   1. לייצא את אמצעי ההעברה קלאסית עבור CFP⁺ ותאים CD11c-YFP⁺ . בין אלה, "מסלול מהירות הממוצע" מציין את הנדידה מהירות ממוצעת של התאים בזמן "תעקוב אחר יושר" מצביע על הכיוון של התאים. אמצעים אלה ניתן לייצא קובץ גיליון אלקטרוני מתוך התוכנה הדמיה.
   2. בתוך הקבצים מיוצא גיליון אלקטרוני, לחשב את "יושר המסלול המתוקן" (המכונה גם יחס כליאה המתוקן) עבור CFP⁺ והן תאים CD11c-YFP⁺ , אשר מוגדר כ- "מסלול יושר" כפול שורש ריבועי של "מעקב אחר משך" מחולק השורש הריבועי של משך וידאו. אמצעי זה היא איתנה יותר מאשר "לאתר יושר" בנוכחות קצר רצועות²⁸, שמקורם למשל מעקב שגיאות.
      הערה: ניתן להשוות רק קטעי וידאו באורך זהה עם מידה זו.
9. למדוד תא אינטראקציה.
   1. מגדיר קשר בין תא CFP⁺ תא CD11c-YFP⁺ אם המרחק שלהם (voxels הכי קרוב) פחות או שווה מסף (קרי, 2 μm).
      הערה: את הסף הזה צריך להיות נוקשה מספיק כדי לזהות איש קשר רק כאשר התאים נמצאים בסמיכות. עם זאת, אנו ממליצים לשמור את הסף הזה גדול מ- 0, אידיאלי N פעמים גדול יותר רדיוס voxel (N > 2), כי גבול החלקה יכול לגרום בבניה מחדש של תאים קטנים יותר גודל התא בפועל.
   2. לספור את המספר ואת משך הזמן של אנשי קשר בין CFP⁺ CD11c-YFP⁺ תאים. בתוכנת הדמיה ניתן לבצע זאת למשל על ידי הפעלת פקק "לנשק ולרוץ" בתוך. אמצעים אלה ניתן לייצא קובץ הגיליון האלקטרוני מהכרטיסיה סטטיסטיקה.
10. ייבוא בצעדים מחושבים בעבר תוכנה סטטיסטית, ליצור החלקות ולבצע בדיקות סטטיסטיות.

בעבודה זו, אנו המתואר פרוטוקול מפורט ללמוד ויוו תנועתיות ואינטראקציות בין נויטרופילים DC במהלך זיהום שפעת בקנה הנשימה מאתר (איור 3 א). למטרה זו, בודדנו CFP+ נויטרופילים (92% טוהר; איור 3B) מ- CK6-ECFP עכברים, ואנו adoptively אותם לתוך עכבר CD11c-YFP נגוע שפעת. לאחר מכן, ביצענו 2, P-IVM של חוליות הצוואר-יום 3 חוקר פרטי בשלב זה הזמן הבחנו גיוס ברורה של נויטרופילים באזור הנגוע, כפי שמוצג על ידי ניתוח תזרים cytometric (איור 3C). פרוטוקול 2, P-IVM מחייב שימוש לוח ניתוח ספציפי ספק חמצן עבור מכרסמים (איור 1 א'). הספקת חמצן דרך בצינורית מוכנס לקנה עזר החיה נושמת הקל אקספוזיציה של חוליות הצוואר, נשלט תנועת האיברים הקשורים נושם (איור 1B). בעקבות הגדרת הניסוי הזה, השגנו יציב 4D תמונות ויוו לקנה נגוע במהלך תקופה של 30 דקות (איור תלת-ממדבסרט 1).

הניתוח של התמונות 4D שנרכש באמצעות תוכנות הדמיה מיוחדים מותר למדוד את ההעברה של תאים כדי לכמת את הדינמיקה-עתיים של נויטרופילים ו- DC. לגבי תא תנועתיות, נצפו הבדלים משמעותיים בין התנועה של DC נויטרופילים מגויס, אשר הראו מהירות מהר יותר באופן משמעותי מאשר האחרון (איור 4A). תוצאה זו מאשר באופי הדינמי של נויטרופילים, שתואר קודם לכן כתאי מאוד תאי מסוגל נודדות לכיוון מקור chemoattractant29... לגבי כיוון, הגענו למסקנה הזאת המורפולוגיה מורכבים של ה-DC הניב שגיאות בתדירות גבוהה בתא מעקב, אשר בתורו הפיק רצועות עם ירידה משך מוגברת השונות של הפעולה כיוונית נמדד (איור 4B). מסיבה זו, חושבו מדד של החזקה כי הוא מסוגל למדוד כיוון על ידי בהתחשב משך המסלול. באמצעות מדד זה, הבחנו הבדל משמעותי ב. הכיוון של נויטרופילים vs DC (איור 4C).

בנוסף, חישוב המרחק בין נויטרופילים DC מותר כדי לזהות ולנתח את אנשי הקשר שלהם לאורך זמן. במודל זה ניסיוני, הבחנו כמה נויטרופילים שיצרו אנשי קשר מרובים קצר עם DC ואחרים זה לא יוצרים קשר במהלך תקופת הדמיה (איור 4D). יתר על כן, המחקר של המגמה הממוצעת של המרחק בין נויטרופילים DC לאורך זמן מאפשרת לנו ללמוד את מיקום הכוללת התאים למדה (איור 4E), תוך החקירה של המגמה תאים מסוימים מותר כדי לאפיין התנהגות של כל יחיד-תא (איור 4Fסרט 2).

איור 1: שלבים עבור 2, P-IVM של קנה הנשימה מאתר וציוד. (Ai) המערכת נייד הרדמה בעלי חיים אחראי על האוורור האוטומטי מחובר משאבה שמספק חמצן העכבר. מבט חזיתי (כל) , מבט צד (וואייי) של הלוח כירורגי בהזמנה אישית משמש מודל בקנה הנשימה. הלוח מורכב שלב מתכת עם עכבר פלסטיק לפי מיקום (כל-a), רוד להחזיק מלחציים מטלטלין (כל-b),. בסדר XYZ tunable תרגום (כל-c). (B) שלבים רציפים של המודל כירורגי והכו אותי: הסרת שיער (Bi) של אזור הניתוח, (Bii) מיקום העכבר anesthetized הלוח כירורגי, תערוכות כירורגי (ביל) של חוליות הצוואר, (קצת ) צנרור עם קטטר לאוורור, קיבעון (Bv) של הקטטר, תוספת (Bvi) של PBS לקנה הנשימה חשוף, הרכבה (Bvii) של coverslip, וכן מיקום (Bviii) של צנתר עם הרדמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2: זיהוי אותות פלואורסצנט במהלך 2, P-IVM- (א) ייצוג סכמטי של מיקרוסקופים בזיהוי לסנן ערוצים המתאימים הקמה. המראה ודיקרואיק זוהר-560 nm מפריד כחול/ירוק של פליטת אדום אדום/רחוק. המראה ודיקרואיק זוהר נוספים ב- 495 ננומטר משמש עוד יותר לזהות את לאזורי משנה שונים של ספקטרום הפליטה. ערוץ 1 מעסיקה גלאי היברידית (פליטת מסנן 475/50), בעוד ערוץ 2 שימושים רגישות גבוהה חאספ PMT (מסנן פליטה 525/50). (B) נציג פיזור נקודה חלקות של אותות P 2 מציג את האסטרטגיה המגביל לדור של הערוצים colocalization לצורך זיהוי האות מגיע את CFP (Bi), את fluorophores YFP (Bii). (ביל) נציג micrographs מציג את אותות מסוימים ערוץ 1 (Ch 1, כחול כהה), ערוץ 2 (Ch 2, ירוק), הערוץ משותף לשפות אחרות עבור CFP (תכלת), הערוץ משותף לשפות אחרות עבור YFP (צהוב), השילוב של כל הערוצים (Ch 1 + Ch 2 + CFP + YFP). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3: Intravital 4D הדמיה של נויטרופילים ו- DC בקנה הנשימה שפעת מזוהם. (א) חלוקה סכמטית של הפרוטוקול. (B) מייצג זרימה cytometric scatterplot מציג את האחוז של נויטרופילים ביחס הכולל CD45 + תאי השעיה תא מבודד מאתר מח עצם באמצעות השיטה מעבר צבע Percoll. (ג) מייצג זרימה cytometric scatterplots מציג עלייה בשכיחות של נויטרופילים ב tracheas מ נגוע עכברים לעומת עכברים נגועים בנגיף שפעת-יום 3 חוקר פרטי (D) (החלונית הימנית) אנטומי דימוי מאתר קנה הנשימה מציג את האזור שנבחר עבור ייבוא תמונות. (לוח נכון) נציג הקרנה תלת-ממד של מיקרוסקופ 2, P-IVM מציג שחזור משטח של נויטרופילים (תכלת) ו DC (צהוב) יחד עם עקבותיהם ביום 3 חוקר פרטי SHG אות מוצג בחושך כחול. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 4: אפיון של נויטרופילים, יחסי ההעברה ואינטראקציה DC בקנה הנשימה שפעת מזוהם. חלקות נציג מציג את מהירות המסלול מתכוון (A), לעקוב אחר יושר (B), תיקון המסלול יושר (C), כפי שהוגדר על ידי Beltman ועמיתיו (2009)28, נויטרופילים, DC בקנה הנשימה-יום 3 חוקר פרטי עם וירוס שפעת. המדידה יושר המסלול המתוקן מוצגים חוסן לאיתור שגיאות. היסטוגרמה 2D (D) מציג את התדירות של נויטרופילים לפי מספרם של אנשי קשר עם DC ומשך הקשר מרושע. (E) המרחק הממוצע של נויטרופילים אל התחום הקרוב ביותר במהלך משך הזמן של הסרט. (F) (משמאל) ניתוח של המרחק של נציג נויטרופילים אל התחום הקרוב ביותר בזמן. הקו האדום מנוקד ציון הסף מרחק לשקול כי נויטרופילים הוקמה איש קשר עם בקר קבוצת מחשבים. (נכון i-iii) Micrographs רכשה בנקודות זמן שונות המייצגות את ההעברה של נויטרופילים (תכלת) לכיוון DC (צהוב). תא רצועות מוצגים כקו צבעוניים, כי שינויי צבע מכחול לאדום לייצג את הזמן. SHG אות קולגן fibrillary מוצג בצבע כחול כהה. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. כל הדמויות, הנתונים שהוצגו הם נציג לפחות שלושה ניסויים עצמאית. התוצאות ניתנות אומר ± SD. סטטיסטיקה על ידי הבדיקה של וולש. ns p > 0.05; p < 0.0001. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

סרט 1: נויטרופילים ו- DC dynamics בקנה הנשימה במהלך זיהום שפעת. 30 דקות תמונה תלת-ממדית זמן לשגות מציג אינטראקציה דינמיקה בין נויטרופילים (תכלת) ו DC (צהוב), כמו גם מסלולים בהתאמה ביחס הרשת קולגן (כחול כהה) של קנה הנשימה. נציג נויטרופילים-DC אינטראקציות מסומנים באמצעות החצים הלבנים. תא רצועות מוצגים כקו צבעוניים, כי שינויי צבע מכחול לאדום לייצג את הזמן. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)

סרט 2: נציג לטווח קצר נויטרופילים-DC אינטראקציה לקנה במהלך זיהום שפעת. תמונה תלת-ממדית זמן לשגות 30 דקות, מראה של נציג האינטראקציה בין של נויטרופילים (תכלת) DC (צהוב) ומסלולים בהתאמה. תא רצועות מוצגים כקו צבעוניים, כי שינויי צבע מכחול לאדום לייצג את הזמן. SHG אות קולגן מוצג בצבע כחול כהה. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)

המחברים אין לחשוף.