כאן, אנו חולקים שיטות למדידת צריכת החמצן מיטוכונדריאלי, הגדרת המושג של energetics תזונתי, פרוטון הנזילה, הגורם העיקרי של חוסר היעילות בדור מיטוכונדריאלי של ATP. תוצאות אלו יכול להסביר 30% מהאנרגיה שקוע ניצול מזין כדי לעזור להעריך תפקוד מיטוכונדריאלי.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מדידת צריכת החמצן מיטוכונדריאלי הכבד ואת פרוטון הדליפה קינטיקה להעריך נשימה מיטוכונדריאלי ב בקר לחלב הולשטיין
במאמר זה
סיכום
תקציר
צריכת החמצן, פרוטון מניע כוח (PMF) ויש דליפת פרוטון המידות של נשימה מיטוכונדריאלי, או כמה טוב המיטוכונדריה הם מסוגלים להמיר NADH ו FADH ATP. מאז המיטוכונדריה הם גם האתר הראשי עבור השימוש החמצן וחמצון מזין פחמן דו-חמצני ומים, איך ביעילות הם להשתמש בחמצן, מייצרים ATP ישירות מתייחס יעילות חילוף החומרים התזונתיים, דרישות התזונתי של החיה, ו בריאות של החיה. מטרת שיטה זו היא לבחון את הנשימה מיטוכונדריאלי, אשר יכול לשמש כדי לבחון את ההשפעה של תרופות שונות, דיאטות and השפעות סביבתיות על חילוף החומרים מיטוכונדריאלי. התוצאות כוללות צריכת החמצן הנמדדת נשימה התלויים פרוטון (המדינה 3) ומערכת פרוטון הדליפה התלויים נשימה (4 המדינה). היחס של המדינה 4 3 / המדינה נשימה מוגדר יחס בקרת הנשימה (RCR) ולייצג מיטוכונדריאלי יעילות אנרגטית. פרוטון מיטוכונדריאלי הדליפה היא תהליך המאפשר פיזור של פוטנציאל הממברנה מיטוכונדריאלי (MMP) על ידי זרחון חמצוני uncoupling מ- ADP להפחתת היעילות של סינתזת ATP. חמצן ו- TRMP + אלקטרודות רגיש עם מצעים מיטוכונדריאלי, מעכבי שרשרת האלקטרונים תחבורה משמשות למדידת מצב 3 ו- 4 מצב נשימה, ממברנה מיטוכונדריאלי PMF (או פוטנציאל לייצר ATP), דליפת פרוטון. מגבלות לשיטה זו הם כי רקמת הכבד חייבים להיות טריים ככל האפשר, ביופסיות וכל מבחני חייב להתבצע תוך פחות מ 10 h. זה מגביל את מספר דוגמאות אשר ניתן לאסוף ולהשתמש שעובדו על-ידי אדם אחד ביום אחד כדי כ 5. עם זאת, רק 1 גרם של רקמת הכבד נדרש, כך בבעלי חיים גדולים, כגון בקר לחלב, כמות הדגימה הצורך הוא קטן יחסית לגודל כבד, יש מעט זמן ההחלמה הדרוש.
מבוא
המיטוכונדריה הם מאוד רגיש ללחץ, הסביבה התאית שלהם יכול לתרום למגוון רחב של מחלות מטבוליות. צריכת החמצן פרוטון דליפת בתוך המיטוכונדריה אינדיקטורים של המיטוכונדריה בריאות בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. בשיטות המתוארות הזה יעילות אנרגיה מיטוכונדריאלי הערכה של נייר באמצעות RCR מבוסס על צריכת חמצן עם וללא דליפה פרוטון. תוצאות אלו יכול להסביר 30% מהאנרגיה איבד ניצול מזין1. שינויים דליפת חמצן צריכת ואת פרוטון יכול לזהות בתפקוד מיטוכונדריאלי אשר תורם למחלות מטבוליות ותוצאות יעילות אנרגיה ירד. שיטות אלה יכולים לשמש גם כדי לבחון את ההשפעה של טיפולים שונים על נשימה מיטוכונדריאלי. המטרה הכוללת של מדידת צריכת החמצן מיטוכונדריאלי וקינטיקה הדליפה פרוטון הוא לה....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל השיטות, פרוטוקול ולימודי המתוארים כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת קליפורניה, דייוויס.
1. לקבל את ביופסיה של הכבד של פרה חלב הולשטיין
הערה: ביופסיה של הכבד צריכה להתבצע על-ידי וטרינר מורשה. ביופסיות כבד יכול להתבצע באתר חלב שבה ממוקמים הפרות. מניקות פרות חולבות ניתן להמשיך לחלוב בדרך כלל, חלב לא צריך להיות מופנמים של אספקת המזון לפני או אחרי הניתוח. מומלץ כי לפחות 4 אנשים נדרשים לבצע את ביופסית הכבד על פרה חלב: וטרינר לבצע את הביופסיה, מטפל בבעלי חיים עומדים על הירך של הפרה כדי להגן על אזור ביופסיה של וטרינר, טכנאי מעבדה בצד החיצוני של העט כדי להפוך פניו er כלים, חו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
תוצאות חיוביות מציג קינטיקה הדליפה RCR ופרוטון מוצגים בטבלה 1 ו- 15 איור, בהתאמה. ב מחקר7, RCR ו חלבון הדליפה קינטיקה נמדדו ב פרות הולשטיין-70 יום בחלב אחרי הפרות היו הואכלו 1 של 5 רמות שונות של Zn, Cu, Mn במשך 28 ימים. המדינה 4, נשימה מקסימלית הפרוטונים תלויי-דליפה, הייתה נטייה להיות מושפעת צריכת מינרלים Cu, Mn ו- Zn (p < 0.1). מצב 3 נשימה (ATP המרבי מגורה נשימה) ו RCR = מצב 3 / 4 המדינה (בקרת הנשימה יחס) .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הנקודה שבה רוב בפרוטוקול קבלת מדגם מייצג רקמת הכבד, מתחיל את ניתוקה של המיטוכונדריה בהקדם האפשרי לאחר ביופסיה. וריאציה במדידות נשימה הוא נמוך (טבלה 1) בשל תקופה קצרה בתחבורה ציבורית פרה למעבדה. כדי לצמצם את זמן תחבורה, מעבדה קטנה הוקם במשרד של החלב, דגימות הכבד גורשו למעבדה office כפי נאסף כל כך המיטוכונדריה היו מבודדים בתוך 10 דקות של ביופסיה. התקנה ובדיקה של נשימה קאמרית, אלקטרודות (חמצן, TPMP +) עם מד pH נהגה הרשומה הבדלים פרוטון מעברי צבע יום לפני איסוף ועיבוד דגימות יכול למנוע תקלות כגון חסר מידות מ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
מחקר זה נתמך על ידי קרנות Alltech פתח משרד החקלאות דרך המרכז לבריאות בעלי חיים מזון ב- UC דיוויס בית הספר לרפואה וטרינרית.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <ביופסיית כבד חזקה> | |||
| <חזקה>ציוד | |||
| שקלפורד-קורטני מכשיר ביופסיית כבד בקר | מכשיר Sontec Instruments Englewood CO | 1103-904 | |
| תפר | פישר סיינטיפיק | 19-037-516 | |
| מחטי תפרים | NA NA כלול עם אזמל תפרים | ||
| סיגמא - Aldrich | S2896 / S2646 | # לידית ולהבים | |
| מגבות ניתוח | פישר סיינטיפיק | 50-129-6667 | |
| צינורות פלקון 50 מ"ל | פישר סיינטיפיק | 14-432-22 | |
| פינצטה | סיגמא - אולדריץ' | Z168750 | |
| 50 מ"ל מזרקים | פישר סיינטיפיק | 22-314387 | |
| מחטי הזרקה (22, 2 1/2) | VWR | MJ8881-200342 | |
| הלטר פרה | אספקת טרקטור ושות ' | ||
| צמר גפן ספוגית | פישר סיינטיפיק | 14-959-102 | |
| ריבועי גזה כותנה (4x4) | פישר סיינטיפיק | 22-246069 | |
| מספריים רפואיים | סיגמא - אולדריץ' | Z265969 | |
| <חזק>כימיקלים | |||
| חיסון קוקסידיוזיס 0.75 בקבוק/פרה | מסופק על ידי | ||
| קלוסטרידיה | מסופק על ידי וטרינר | ||
| ביופסיית כבד אנטיביוטיקה excenel 2 סמ"ק/100 פאונד למשך 3 ימים | מסופק על ידי הווטרינר | ||
| Providone Scrub | Aspen Veteterinary Resources | 21260221 | |
| אתנול 70% | Sigma - Aldrich | 793213 | |
| קסילזין הידרוכלוריד 100 מ"ג/מ"ל IV ב-0.010-0.015 מ"ג/ק"ג משקל | מסופק על ידי וטרינר | ||
| 2% לידוקאין הידרוכלוריד (10-15 מ"ל) | מסופק על ידי וטרינר | ||
| הזרקה של 1 מ"ג/ק"ג IV של פלוניקסין מגלומין | מסופק על ידי וטרינר | ||
| <חזק>בידוד מיטוכונדריה (כבד)< | |||
| חזק>ציוד | |||
| בקבוקון ויטון 30 מ"ל עם עלי טפלון של 0.16 מ"מ | פישר סיינטיפיק | 02-911-527 | |
| מנוע הומוגנייזר | קול פארמר | EW-04369-10 | |
| הומוגנייזר בדיקה | קול פארמר | EW-04468-22 | |
| פיפטה אוטומטית (10 מ"ל) | קול פארמר | SK-21600-74 | |
| (500 מ"ל) עם קרח | פישר סיינטיפיק | FB100600 | |
| מיקרופוגה מקוררת | פישר סיינטיפיק | 75-002-441EW3 | |
| צינורות מיקרופוגה (1.5 מ"ל) | פישר סיינטיפיק | AM12400 | |
| <חזק>כימיקלים | |||
| בדיקת חלבון חומצה ביצינצ'ונינית (BCA) (מיקרו-פלטות לקורא צלחות) | abcam | ab102536 | |
| סוכרוז | סיגמא - אולדריץ' | S7903-1KG | |
| Tris-HCl | Sigma - Aldrich | T1503-1KG | |
| EDTA | Sigma - Aldrich | EDS-1KG | |
| BSA (ללא חומצות שומן) | סיגמא - Aldrich | A7030-50G | |
| מניטול | סיגמא - Aldrich | M4125-1KG | |
| סיגמא מים נטולי יונים | - Aldrich | 38796 | |
| Hepes | Sigma - Aldrich | H3375-500G | |
| השתמש ליצירת מצעי בידוד מיטוכונדריה: 220 מ"מ מניטול, 70 מ"מ סוכרוז, 20 מ"מ HEPES, 20 מ"מ Tris-HCl, 1 מ"מ EDTA, ו-0.1% (w/v) ללא חומצות שומן BSA, pH 7.4 ב-4 מעלות; C, יחזיק מעמד יומיים במקרר | |||
| <חזק>אספקת חמצן מיטוכונדריאלית | |||
| <חזקה>ציוד | |||
| הגדרת אוקסיגרף + אלקטרודת חמצן מסוג קלארק | Hansatech (PP Systems) | חום OXY1 | |
| MLE2001 | |||
| אלקטרודת חמצן מסוג קלארק | NA | ||
| NA Autopipette (1 מ"ל) | קול פארמר | SK-21600-70 | כלול עם Oxy1 |
| מוט ערבוב מגנטי קטן | פישר סיינטיפיק | 14-513-95 | |
| מיקרופיפטה (10 μ L) | Cole Parmer | SK-21600-60 | |
| מד pH | VWR | ||
| חזק>כימיקלים | |||
| KCl | סיגמא - Aldrich | P9333-1KG | |
| Hepes | Sigma - Aldrich | H3375-500G | |
| KH2PO4 | Sigma - Aldrich | P5655-1KG | |
| MgCl2 | Sigma - Aldrich | M1028-100ML | |
| EGTA | Sigma - Aldrich | E3889-100G | |
| השתמש לייצור מדיית צריכת חמצן מיטוכונדריאלית: 120 מ"מ KCL, 5 מ"מ KH2PO4, 5 מ"מ MgCl2, 5 מ"מ Hepes ו-1 מ"מ EGTA, pH 7.4 ב-30 מעלות; C עם 0.3% BSA | |||
| (תמיסה של 4 מ"מ) | סיגמא - אולדריץ' | R8875-5G | |
| סוקסינט (תמיסה של 1 מ') | סיגמא - אולדריץ' | S3674-250G | |
| ADP (תמיסה של 100 מ"מ) | סיגמא - אולדריץ' | A5285-1G | |
| אוליגומיצין (תמיסה של 8 μ גרם/מ"ל באתנול) | סיגמא - Aldrich | 75351 | |
| FCCP | Sigma - Aldrich | C2920 | |
| <>חזקפוטנציאל ממברנה מיטוכונדריאלית וכוח מניע פרוטון | |||
| <חזק>ציוד | |||
| TPMP אלקטרודה | World Precision Instruments. | DRIREF-2 | |
| <חזק>תמיסות כימיות אינן צריכות להיות טריות אך יש לשמור אותן במקפיא בין ריצות | |||
| מלונט (תמיסה של 0.1 מ"מ) | סיגמא - אולדריץ' | M1296 | |
| אוליגומיצין (8 μ גרם/מ"ל באתנול), שומרים במקפיא | סיגמא - Aldrich | 75351 | |
| ניגריצין (80 ננוגרם/מ"ל באתנול), שומרים במקפיא | סיגמא - Aldrich | N7143 | |
| FCCP | Sigma - Aldrich | C3920 | |
| TPMP | Sigma - Aldrich | T200 | |
| תמיסת TPMP: 10 מ"מ TPMP, 120 מ"מ KCL, 5 מ"מ Hepes ו-1 מ"מ EGTA, pH 7.4 ב-30 מעלות; C עם 0.3% BSA |
מקורות
- Brand, M. D., Divakaruni, A. S. The regulation and physiology of mitochondrial proton leak. Physiology. 26, 192-205 (2011).
- Stephenson, E. J., Hawley, J. A. Mitochondrial function in metabolic health: A genetic and environmental tug of war. Biochimica ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
