הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

Microhemorrhages מוחי תת חריפה הנגרמת על ידי הזרקת ליפופוליסכריד בחולדות

6.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/58423

⸱

17 באוקטובר 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, Second Hospital of Shanxi Medical University, 2Department of Neurology, PLA Army General Hospital, 3Department of Neurology, NO 261 Hospital of PLA

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

אנו מציגים פרוטוקול זירוז ולגלות CMHs הנגרמת על ידי הזרקת LPS בחולדות ספראג-Dawley, אשר עשוי להיות מנוצל בעתיד חקירות מחקר בפתוגנזה של CMHs.

תקציר

Microhemorrhages מוחי (CMHs) שכיחים בחולים בגילאי, נמצאים בקורלציה מנוטלי הפרעות שונות. האטיולוגיה של CMHs מורכבים, neuroinflammation נצפית לעיתים קרובות כמו מופע משותף. כאן, אנו מתארים תת חריפה CMHs חולדה מודל המושרה על ידי הזרקת ליפופוליסכריד (LPS), כמו גם שיטה לגילוי הזרקת LPS מערכתית CMHs. הוא יחסית פשוט, חסכוני וחסכונית. אחד היתרונות של הזרקת LPS הוא יציבותו כדי לגרום לדלקת. CMHs הנגרמת על ידי הזרקת LPS יכול יזוהו על-ידי התבוננות ברוטו hematoxylin ו אאוזין (הוא) צביעת, של Perl מכתים הפרוסי, אוונס כחול (EB) כפול-תיוג, דימות תהודה מגנטית-הרגישות משוקלל טכנולוגיית הדמיה (MRI-מושכל). לבסוף, שיטות אחרות לפתח מודלים בעלי חיים CMHs, כולל שלהם יתרונות או חסרונות, נדונות גם בדו ח זה.

מבוא

Microhemorrhages מוחי הקלאסית (CMHs) עיין perivascular זעירים פיקדונות של מוצרי דם השפלה כגון hemosiderin של תאי דם אדומים במוח1. על פי המחקר רוטרדם לסרוק, CMHs ניתן למצוא אותה כמעט 17.8% של אנשים בגילאי 60-69 שנים ו- 38.3% אלה מעל 80 שנה2. השכיחות של CMHs אצל הקשישים הוא גבוה יחסית, מתאם בין ההצטברות של CMHs תפקוד קוגניטיבי, מנוטלי כבר הוקמה3,4. מספר מודלים חייתיים של CMHs לאחרונה דווחו, כולל דגמים מכרסמים המושרה על ידי הסוג הרביעי collagenase הזרקת stereotaxic5, APP הטרנסגניים6, β-N-methylamino-L-אלנין חשיפה7ויתר לחץ דם8, עם CMHs הנגרמת על ידי דלקת מערכתית כאחת האפשרויות המקובלת יותר היטב. פישר. et al. 9 השימוש הראשון LPS נגזר סלמונלה typhimurium לפתח מודל העכבר CMHs חריפה. לאחר מכן, באותה הקבוצה דיווח על התפתחות מודל תת חריפה CMHs העכבר באמצעות גישה זהה של2.

LPS נחשבת תקנית גירוי דלקתי באמצעות הזרקת בקרום הבטן. מחקרים קודמים אישרו כי הזרקת LPS עלול לגרום neuroinflammation כפי שהיא משתקפת כמויות גדולות של מיקרוגלייה, הפעלת אסטרוציט בחיה מודלים2,10. יתר על כן, מתאם חיובי בין הפעלה של הפעלת neuroinflammation המספר של CMHs כבר הקים2,10. בהתבסס על מחקרים קודמים אלה, אנחנו כשהתבקשת לפתח מודל עכברוש CMHs על ידי הזרקה בקרום הבטן של LPS.

. ההתקדמות זיהוי הטכנולוגיות גרמו לעלייה במספר חקירות מחקר ב- CMHs. הכי נרחב הודה שיטות גילוי CMHs כוללות את הגילוי של כדוריות דם אדומות על ידי hematoxylin אאוזין (הוא) מכתים, ברזל ferric זיהוי על ידי כחול פרוסי מכתים9, זיהוי של אוונס כחול (EB) תצהיר על ידי immunofluorescence הדמיה, טסלה 7.0 תהודה מגנטית-הרגישות משוקלל הדמיה (MRI-מושכל)10. המחקר הנוכחי שואפת לפתח שיטת הקרנה של CMHs.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי חיה על עצמך ועל שימוש הוועדה (ACUC) ה-PLA ביה"ח הכללי של צבא.

1. חומרים

  1. הכנה של הזרקת LPS
    1. להוסיף 25 מ ל מים מזוקקים 25 מ ג של אבקת LPS נגזר typhimurium ס כדי ריכוז סופי של 1 מ"ג/מ"ל. לאחסן את הזריקה בשפופרת סטרילי ב 4 º C.
      התראה: LPS הוא רעיל.
    2. להכין פתרון EB 2% בתמיסת נורמלי 0.9% לשמור EB הזרקת ריכוז בעבודה.

2. בעלי חיים

  1. לנהל מאושרת. שתחסום את זכר חולדות ספראג-Dawley (SD), בגילאי 10 שבועות (ממוצע משקל: 280 ± 20 גרם) על ידי הזרקת בקרום הבטן.
    התראה: אם חולדות נרכשים מארגון אחר, אז השלב מסתגלת לא צריך להיות פחות מ- 7 ימים.

3. LPS זריקות

  1. להזריק LPS intraperitoneally לתוך כל עכברוש במינון של 1 מ"ג/ק"ג, וחוזרים העכברושים הכלוב שלהם הביתה.
    הערה: ההרדמה אינו הכרחי.
  2. שש שעות מאוחר יותר, להזריק את מינון זהה של הזרקת LPS לתוך העכברושים.
  3. לאחר 16 שעות להזריק באותו המינון של LPS לתוך העכברושים.
    התראה: מזריק SD חולדות LPS במינון של 1 מ ג/ק ג עלול לגרום שיעור התמותה של 5%. שיעור התמותה יכול להגדיל עוד יותר צעיר או מבוגר עכברים או חולדות נקבות בהריון.
  4. להחזיר את החולדות לכלובים שלהם לאחר הזרקת LPS ומספקים גישה ad libitum מזון ומשקה.
    הערה: חולדות תערוכת לתגובה דלקתית מערכתית ברורה, לכן חיוני כי הכלובים נשארים נקיים לאורך כל הניסוי. עכברושים צריך להיות בתדירות גבוהה (2 x יום) ניטור משקל, המראה הכללי של היחס לאחר הזריקה הראשונה LPS. אם החולדות מתחיל להפגין יציבה שפופות, נכונות לעבור, ירידה משמעותית במשקל (> 20%), פורפירין מכתים הם להיות בצורה הומאנית מורדמים לפני יום 7 נקודת סיום לימוד EB.

4. דוגמה אוסף

  1. הזרקת EB
    1. שבעה ימים לאחר הזריקה הראשונה, עזים ומתנגד העכברוש מאת intraperitoneally על פי הנהלים IACUC שאושרו.
    2. לחכות 1-2 דקות עד החולדות לא מראים תגובות רפלקס המצמוץ. ביצוע של 5-8 מ מדקירה עמוקה הלב על כל עכברוש; נקודת puncturing צריך להיות 5 מ מ לשוליים השמאליים של החזה ברווח intercostals 3 ו-4.
    3. המתן עד דם שחזור נצפית ולאחר להזריק EB במינון של 0.2 גרם/100 גרם משקל לתוך החדר השמאלי של הלב.
      התראה: דום לב לנקב, הזרקת EB יש בקפידה לבצעו. EB עשוי להיות מוזרק לתוך חלל בית החזה או קרום הלב במקום הנוזלים הלב השמאלי.
      1. למצוץ שוב עם שפופרת ריק והחלף אמצעי אחסון זה שפופרת EB לפני הזרקת כדי לעזור להפחית את הכשלונות (למשל., הזרקה אל הצלעות בטעות).
    4. שמור את החולדה במצב פרקדן למשך 10 דקות.
      הערה: אם המדגם אינו בשימוש כדי לזהות דליפות EB בתחום ההדמיה immunofluorescence, אז שלב זה עשוי להיות מושמט.
  2. תצפית מגעיל
    1. לבצע perfusions הלב באמצעות תמיסת מלח מאגר פוספט 1 מ' הקר (PBS) כדי לנקות את מוחי להערכת ואת המוח.
      1. באמצעות אזמל, לעשות חתך בבטן מעבר לכל אורכה של הסרעפת.
      2. חתך דרך צלעות רק שנשאר האמצע כלוב הצלעות.
      3. תפתחו חלל בית החזה. השתמש תופסנים כדי לחשוף את הלב, כדי להקל על ניקוז של דם ונוזלים אחרים.
      4. תוך החזקת בהתמדה את הלב עם מלקחיים (הלב צריך עדיין להיות מנצח), ישירות הוספה מחט לתוך בליטה של החדר השמאלי, הורחב כ 5 מ מ. לאבטח את המחט באותו מיקום על ידי מחבר חובק למעקה ליד נקודת כניסה.
        התראה: לא בצורה מוגזמת להרחיב את המחט, כפי שהוא יכול לחדור את החומה הפנימית לסכן את זרימת הדם של פתרונות.
      5. שחרר את השסתום כדי לאפשר זרימה פתרון PBS קר כקרח (200 – 300 מ"ל) בקצב איטי ויציב ב בסביבות 20 מ ל/דקה באמצעות משאבה זלוף. אם בעלי החיים דורשים קיבוע במקום תצפית ברוטו, השתמש המינון אותו תמיסת מלח קרה כקרח 0.9%.
      6. באמצעות מספריים חדות, לעשות חתך בחלל האטריום, המבטיח כי הפתרון זורם באופן רציף. אם הנוזל אינה זורמת בחופשיות או מגיע הנחיריים או הפה של החיה, למקם מחדש את המחט.
    2. מסך עבור CMHs באמצעות התבוננות ברוטו.
      הערה: אם המדגם לא משמש לחישוב מספר CMHs באמצעות התבוננות מגעיל, אז שלב זה עשוי להיות מושמט.
  3. קיבעון
    1. לבצע perfusions הלב באמצעות כקרח 0.9% תמיסת מלח (200 – 300 מ"ל) כדי לנקות את להערכת מוחי ואת המוח.
    2. לבצע perfusions הלב באמצעות קרח paraformaldehyde 4% עבור קיבעון.
    3. לערוף את החולדה, לבודד את המוח, לטבול את המוח ב- 20% סוכרוז פתרון לפחות 6 שעות.
    4. לשנות את הפתרון לתוך 30% סוכרוז, תיקון עבור עוד 6 שעות.
  4. הכינו 10 סעיפים רקמות המוח מ מעבה, באמצעות cryostat.

5. הוא מכתים

הערה: הליך זה מבוצע באמצעות הוא מכתים ערכה.

  1. לשטוף את השקופיות במים מזוקקים.
  2. כתם ב hematoxylin פתרון עבור 8 דקות לשטוף במים ברז למשך 5 דקות.
  3. להבדיל ב 1% אלכוהול חומצה עבור 30 ס' לשטוף במים מהברז עבור 1 דקות.
  4. כתם במים אמוניה 0.2% (הכחלת) או רווי ליתיום קרבונט פתרון עבור 30 s כדי 1 מינימלית לשטוף במים ברז למשך 5 דקות.
  5. שוטפים ב- 95% אלכוהול (10 מטבלים).
  6. Counterstain עם פתרון אאוזין 30 s כדי 1 דקות.
  7. מייבשים עד 95% אלכוהול, שני שינויים של אלכוהול המוחלט, למשך 5 דקות.
  8. ברור של קסילן ב-30 s.
  9. הר באמצעות שיטה של ליו9.
  10. לנתח באמצעות מיקרוסקופ זריחה brightfield.
    הערה: תאי דם אדומים שוחררו כלי דם, אשר הם הרכיבים של CMHs, מופיעים אדום כתום תחת הוא מכתים.

6. פרל כחול פרוסי מכתים

הערה: הליך זה מבוצע באמצעות ערכת מכתים פרלס.

  1. רחץ שקופיות עם מים מזוקקים.
  2. כתם בפתרון התגובה עם חלקים שווים תערובת של ferrocyanide חומצת מלח למשך 10 דקות.
  3. מייבשים, נקה, הר, ולנתח את השקופיות כמתואר בצעדים 5.7-5.10.

7. EB כפול מכתים

הערה: הליך זה עוקב אחר צעד 4.1.3.

  1. רחץ שקופיות עם PBS שלוש פעמים במשך 5 דקות.
  2. דגירה שקופיות עם 4', 6-diamidino-2-phenylindole פתרון (דאפי) למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. לשטוף את השקופיות עם PBS פתרון שלוש פעמים במשך 5 דקות, והר שקופיות עם פתרון PBS-גליצרול.
  4. לנתח את התמונות על ידי קרינה פלואורסצנטית המיקרוסקופ. EB התצהיר שציין פלואורסצנטי אדום; הגרעינים מסומנים באמצעות כחול.

8. אר. איי-מושכל

  1. לבצע MRI על מגנט 7-T מצויד עם מערכת מעבר הצבע מחוברות באופן פעיל (16 ס"מ קוטר פנימי).
  2. שבעה ימים לאחר הטיפול, עזים ומתנגד העכברים מאת facemask שאיפה של 1.5-2.0% איזופלוריין באמצעות מערכת הרדמה איזופלוריין.
  3. להחיל משחה הוטרינר על גבי העיניים של העכברוש למניעת יובש תחת הרדמה.
  4. לשמור את החולדות שכיבה ולבצע בסריקה MRI-מושכל.
  5. להשיג מושכל משוקלל סריקות באמצעות רצף מהיר-ספין הד באמצעות הפרמטרים הבאים: הד הזמן (TE) 8 מילי-שניות, החזרה זמן (TR) 40 ms, היפוך זווית = ° 12, שדה ראייה (FOV) 35 מ מ × 35 מ מ, מטריקס רכישה 384 × 384, לרכוש פרוסות בעובי מ מ 1.
  6. לזהות CMHs ב MRI-מושכל על פי גרינברג. et al. 11, אשר כללה את הקריטריונים הבאים: (1) בקוטר של ≤10 מ"מ, ונקודות בעוצמה מעגלית (2), מבודד, קליטה נמוכה.
  7. בסוף הניסוי, המתת חסד החולדות באמצעות שיטת פחמן דו-חמצני (זרם של 6 L/min) או 30% נפח מיכל ממנת יתר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ניתן להבחין CMHs תוך שימוש בגישות שונות. השיטות המקובלת יותר היטב כוללים את הפריטים הבאים: (1) דוחה תצפית והערכה של פני השטח CMHs (ראה איור 1, החלונית העליונה); (2) הוא מכתים איתור של תאי דם אדומים (ראה איור 2A, החלונית העליונה) או הפרוסי צביעת הברזל ferric גילוי נגזר פירוק של כדוריות דם אדומות (איור 2 א, החלונית התחתונה); (3) EB הוכפל מכתים איתור התצהיר EB נגזר BBB דליפה (איור 3...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מחקרים על CMHs הגבירו בשנים האחרונות. עם זאת, המנגנון של CMHs עדיין לא ברור, הנחיה מדענים ליצור מודלים בבעלי חיים לדמות מצב מסוים זה. לדוגמה, הופמן. et al. פיתח הנוצרות על-ידי היפוקסיה CMHs העכבר מודל שמראה כי CMHs נגרמים על ידי היפוקסיה, שיבוש autoregulation כשאבדן12. רויטר. et al. 5 הוקם דגם CMHs העכברים הטרנסגניים-APP23, אשר הראו כי angiopathy עמילואיד במוח (סי) משחק תפקיד מרכזי האטיולוגיה של CMHs. פישר. et al. דיווח על מודל העכבר CMHs היה המוש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

אנו מודים ליי פנג ג'יאן המורה ועמיתיו מאוניברסיטת קפיטל הרפואה עבור הדרכה במהלך בדיקת MRI. אנו מודים גם ג'ינג Zeng מן המחלקה לנוירולוגיה, בבית החולים של ייצ'אנג של העם השני למתן תמיכה טכנית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
LPSSigma-AldrichL-2630לאינדוקציה דלקתית
EBSigma-aldrichE2129לזיהוי דליפות
EB תמיסת גסיסה DAPIServicbioG1012ספירה בינונית עבור IF
Perl' s צביעה פרוסיתSolarbioG1424ערכה לצביעה פרוסית
HE צביעתSolarbioG1120ערכה לצביעה HE
כלורל הידרטSigma-Aldrich47335Uלהרדמה
פוספט מאגר מלח (PBS)SolarbioP1022מעין תמיסת חיץ הנפוצה בניסוי
0.9% תמיסתמלחHainan DonglianChangfu Pharmaceutical Co., Ltd., סיןפתרון לפרפוזיה
פרפורמלדהידסיגמא-אולדריץ'158127סוג של תמיסה המשמשת בדרך כלל לקיבוע תמיסת סוכרוז
20%SolarbioG2461סוג של תמיסה המשמשת בדרך כלל לקיבוע תמיסת סוכרוז
30%SolarbioG2460של תמיסה המשמשת בדרך כלל לקיבוע
משחה וטרינריתג'ל עיניים Solcoseryl, Bacel, שוויץלהגנה על עיני חולדות
סוג

מקורות

  1. Sumbria, R. K., et al. A murine model of inflammation-induced cerebral microbleeds. J Neuroinflammation. 13 (1), 218(2016).
  2. Vernooij, M. W., et al. Prevalence and risk factors of cerebral microbleeds the Rotterdam Scan Study. Neurology. 70 (14), 1208-1214 (2009).
  3. Pettersen, J. A., et al. Microbleed topography, leukoaraiosis, and cognition in probable Alzheimer disease from the Sunnybrook dementia study. Archives of Neurology. 65 (6), 790-795 (2008).
  4. Xu, X., et al. Cerebral microbleeds and neuropsychiatric symptoms in an elderly Asian cohort. Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 88 (1), 7-11 (2017).
  5. Mcauley, G., Schrag, M., Barnes, S., Obenaus, A., Dickson, A., Kirsch, W. In vivo iron quantification in collagenase-induced microbleeds in rat brain. Magnetic Resonance in Medicine. 67 (3), 711-717 (2012).
  6. Reuter, B., et al. Development of cerebral microbleeds in the APP23-transgenic mouse model of cerebral amyloid angiopathy-a 9.4 tesla MRI study. Frontiers in Aging Neuroscience. 8 (8), 170(2016).
  7. Scott, L. L., Downing, T. G. A single neonatal exposure to BMAA in a rat model produces neuropathology consistent with neurodegenerative diseases. Toxins. 10 (1), E22(2018).
  8. Toth, P., et al. Aging exacerbates hypertension-induced cerebral microhemorrhages in mice: role of resveratrol treatment in vasoprotection. Aging Cell. 14 (3), 400-408 (2015).
  9. Liu, S., et al. Comparative analysis of H&E and Prussian blue staining in a mouse model of cerebral microbleeds. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 62 (11), 767-773 (2014).
  10. Zeng, J., Zhào, H., Liu, Z., Zhang, W., Huang, Y. Lipopolysaccharide induces subacute cerebral microhemorrhages with involvement of Nitric Oxide Synthase in rats. Journal of Stroke and Cerebrovascular Diseases. 27 (7), 1905-1913 (2018).
  11. Greenberg, S. M., et al. Cerebral microbleeds: A guide to detection and interpretation. Lancet Neurology. 8 (2), 165-174 (2009).
  12. Hoffmann, A., et al. High-Field MRI reveals a drastic increase of hypoxia-induced microhemorrhages upon tissue reoxygenation in the mouse brain with strong predominance in the olfactory bulb. Plos One. 11 (2), e0148441(2016).
  13. Sumbria, R. K., et al. Effects of phosphodiesterase 3A modulation on murine cerebral microhemorrhages. Journal of Neuroinflammation. 14 (1), 114(2017).
  14. Sumbria, R. K., et al. Aging exacerbates development of cerebral microbleeds in a mouse model. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 69(2018).
  15. Mello, B. S. F., et al. Sex influences in behavior and brain inflammatory and oxidative alterations in mice submitted to lipopolysaccharide-induced inflammatory model of depression. Journal of Neuroimmunol. 320, 133-142 (2018).
  16. Souza, D. F. D., et al. Changes in astroglial markers in a maternal immune activation model of schizophrenia in Wistar rats are dependent on sex. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9 (489), (2015).
  17. Dutta, G., Zhang, P., Liu, B. The Lipopolysaccharide Parkinson's disease animal model: mechanistic studies and drug discovery. Fundamental & Clinical Pharmacology. 22 (5), 453-464 (2008).
  18. El-Sayed, N. S., Bayan, Y. Possible role of resveratrol targeting estradiol and neprilysin pathways in lipopolysaccharide model of Alzheimer disease. Advances in Experimental Medicine and Biology. 822 (822), 107-118 (2015).
  19. Combrinck, M. I., Perry, V. H., Cunningham, C. Peripheral infection evokes exaggerated sickness behaviour in pre-clinical murine prion disease. Neuroscience. 112 (1), 7-11 (2002).
  20. Pantoni, L. Cerebral small vessel disease: from pathogenesis and clinical characteristics to therapeutic challenges. Lancet Neurology. 9 (7), 689-701 (2010).
  21. Rosand, J., et al. Spatial clustering of hemorrhages in probable cerebral amyloid angiopathy. Annals of Neurology. 58 (3), 459-462 (2005).
  22. Robinson, S., et al. Microstructural and microglial changes after repetitive mild traumatic brain injury in mice. Journal of Neuroscience Research. 95 (4), 1025-1035 (2017).
  23. Kraft, P., et al. Hypercholesterolemia induced cerebral small vessel disease. Plos One. 12 (8), e0182822(2017).
  24. Schreiber, S., Bueche, C. Z., Garz, C., Baun, H. Blood brain barrier breakdown as the starting point of cerebral small vessel disease? - New insights from a rat model. Experimental & Translational Stroke Medicine. 5 (1), 4(2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Evans BluePrussian BlueMRISWI
Microhemorrhages מוחי תת חריפה הנגרמת על ידי הזרקת ליפופוליסכריד בחולדות
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.