מאמר שיטה

הפוך שעתוק לולאה-בתיווך איזותרמי הגברה (RT-המנורה) Assay Zika וירוס, ניקיון בגנים שתן, סרום, ודוגמאות יתוש

DOI:

10.3791/58436

⸱

14 בספטמבר 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Urology, Beaumont Health System, 2Foundational Sciences, College of Medicine, Central Michigan University, 3Oakland University William Beaumont School of Medicine

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מספק שיטה יעילה, בעלות נמוכה לזהות וירוס Zika או שליטה מטרות בדגימות שתן וסרום אנושי או יתושים על ידי שעתוק במהופך בתיווך לולאה איזותרמי הגברה (RT-המנורה). שיטה זו אינה דורשת בידוד RNA והוא יכול להיעשות תוך 30 דקות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זיהום בנגיף Zika (ZIKV) יכול להיות אסימפטומטיים במבוגרים, לעומת זאת, זיהום במהלך ההריון יכול לגרום להפלה מולדים נוירולוגיות חמורות. המטרה של פרוטוקול זה היא לזהות במהירות ZIKV בדגימות האדם והן יתושים. תקן הזהב הנוכחי לגילוי ZIKV הוא שעתוק במהופך כמותיים PCR (לרביעיית-PCR); שעתוק במהופך בתיווך לולאה איזותרמי הגברה (RT-המנורה) עשוי לאפשר לבדיקה יותר יעיל, בעלות נמוכה ללא צורך ציוד יקר. במחקר זה, RT-המנורה שימוש לצורך זיהוי ZIKV בדגימות ביולוגיות שונות בתוך 30 דקות, ללא הראשונה לבודד את הרנ א מדגם. טכניקה זו הוכח שימוש ZIKV נגוע סרום ושתן המטופל ולאחר נגוע דגימות יתושים. חומצה ריבונוקלאית ribosomal 18S אקטין משמשים כפקדי בדגימות האדם וכילה נגד יתושים, בהתאמה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בשנת 2015, Zika וירוס (ZIKV) צבר תשומת הלב העולמית בולטים כמו מחלה זיהומית של דאגה מפני זיהום במהלך ההריון היה קשור להפלה, לידות, חמור נוירולוגיות מומים מולדים כולל microcephaly, כמו גם אחרים מולדת מומים מולדים1. במקרים נדירים, ZIKV נמצא קשור תסמונת גיליאן. ZIKV מועבר בעיקר על ידי יתושי אאדס; עם זאת, זה יכול גם להיות להתפשט באמצעות מגע מיני1. בהתחשב בכך הזיהום עם ZIKV ללא תסמינים אצל רוב האנשים, או מציג עם מתון תסמינים דמויי שפעת חופפים עם הסימפטומים של זיהום של אחרים arborviruses1, היה צורך עבור שיפור שיטות גילוי מהירה וחסכונית של ZIKV למסך גם אנשים, כמו גם אוכלוסיות יתוש מקומיים.

שעתוק במהופך כמותיים PCR (לרביעיית-PCR) הוא assay אמין לצורך זיהוי ZIKV; עם זאת, טכניקה זו דורש ציוד מיוחד יקר, צוות מיומן, ובידוד RNA מדגם של ריבית. שעתוק במהופך בתיווך לולאה איזותרמי הגברה (RT-המנורה) היא שיטה הגברה חומצת גרעין בשלב אחד מבוסס על טכנולוגיית ה-PCR הדורש רק בטמפרטורת דגירה אחת עקב השימוש לרום DNA פולימראז עם סטרנד מאפייני העקירה. זה עוקף את הצורך thermocycler, מקטין את משך הזמן הדרוש כדי להשלים את הבדיקה. יתרונות נוספים של RT-המנורה כוללים שלה ירידה לפרטים גבוהה, רגישות, חוסן במגוון של רמות ה-pH, טמפרטורות, והתנגדות PCR רבים מעכבי2. יש יחסית נמוכים, ריאגנטים יציבים בטמפרטורת החדר. לאור מאפיינים אלה, RT-המנורה ניתן לפרוס במעבדה או בשטח. ככזה, המנורה תגובות פותחו כדי לזהות מגוון של פתוגנים וסוגים אחרים של זיהום3,4,5. המטרה של פרוטוקול RT-המנורה המתוארת במאמר זה היא לזהות את ZIKV ללא בידוד RNA בדגימות האנושי סרום ושתן באותה מידה כמו יתוש הנגוע יחיד בתוך 30 דקות באמצעות RT-המנורה. בשיטה זו ניתן להחליף לרביעיית-PCR כפי שהוא כלי אבחון רגיש, מהירה שפועל במהירות ובאופן בהגדרות מחוץ למעבדה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי המוסדיים סקירה לוח (IRB) של בריאות בומונט. כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות הרלוונטיים ולתקנות.

התראה: כל חומר העלול זיהומיות צריך להיות מטופל על פי תקני אבטחה ברמה 2 כולל השימוש של ציוד מגן אישי. כל הנהלים, אשר עשויה לייצר תרסיס צריכה להתבצע בתוך ארון אבטחה. בנוסף, עבודה עם יתושים חיה צריכה להתבצע במתקן המתאים של פרוקי-רגליים הבלימה רמה 1-3.... בהתחשב האגודה של זיהום ZIKV עם מומים מולדים, נשים בהריון, מנסה להרות, או השותפים של נשים אלו צריכים באופן משמעותי לצמצם את חשיפתם מעבדה ZIKV. הובלה של דגימות ZIKV מסווגים בארצות הברית קטגוריה B חומרים ביולוגיים לפי מחלקה של מסוכנים חומרים תקנות התעבורה (49 CFR Part 171-180) ולכן משלוח דוגמאות צריך לדבוק אלה הנחיות. ייבוא לתוך biospecimens ארצות הברית של ZIKV דורשת מרכזי לבקרת מחלות ומניעתן (CDC) להתיר ייבוא. ייבוא של כל פרוקי רגליים זה יכול לשמש כמו וקטור לשידור ZIKV, גם אם הם לא נדבקו, דורש אישור מחלקת החקלאות של ארצות הברית (USDA). מידע זה הוא הנוכחי בזמנו של הפרסום. המלצות עדכניות ניתן למצוא ב- https://www.cdc.gov/zika/laboratories/lab-safety.html.

הערה: RT-המנורה תגובות נוטים שיעור גבוה יותר של תגובות חיוביות כוזבות, ולכן יש לנקוט אמצעי זהירות בתכנון ניסיוני. כל ביצוע של RT-המנורה תגובות הקמה עליך להשתמש פיפטות המיועד וטיפים מסנן. באופן אידיאלי, יש להקים זרם עבודה לרוחב. במידת האפשר, אנליזה והדמיה (סעיף 5) צריך להתרחש בחדר סגור נפרד כדי למנוע זיהום. הפתיחה של מבחנות המכילות מוצרים RT-המנורה צריכה להישמר עד למינימום.

1. RT-המנורה תחל הכנה

  1. לשקם כל פריימר RT-המנורה lyophilized במים ברמה מולקולרית כדי ריכוז סופי של 100 מיקרומטר (טבלה 1). בקצרה מערבולת הפתרון פריימר כדי להבטיח פתרון הומוגני ולסובב בקצרה את הפתרון במהירות המרבית ומפרידה מלמעלה בטבלה כדי לאסוף את כל פתרון פריימר.
  2. הכינו 10 x RT-המנורה תמהיל פריימר של תחל ב- FIP, ביפ, F3, B3, אם ו LB באמצעות אמצעי האחסון בטבלה מס ' 2. בקצרה מערבולת הפתרון פריימר כדי להבטיח פתרון הומוגני, בקצרה ספין למטה הפתרון במהירות המרבית ומפרידה מלמעלה בטבלה כדי למנוע אובדן.
    הערה: פריימר RT-המנורה להגדיר עבור Ae. aegypti אקטין (AEDAE) אינו מכיל פריימר ליברות (primers לופ אינם תמיד הכרחי לתגובות RT-המנורה). במקרה זה, להחליף את אמצעי האחסון פריימר ליברות כיתה מולקולרית מים.
  3. לאחסן את תחל ב-20 ° C בין שימושים ולהימנע מחזורים חינם-הפשרה.

2. הכנת הדוגמא

  1. עבור דגימות שתן: להשתמש שתן טרי, קפוא שתן או שתן חומר משמר. עבור מדגם טרי או קפוא: מיד תוצאה לדגימה אחרי האוסף 10 דקות ב 700 x g, ו השתמש את תגובת שיקוע לניתוח או להקפיא ב-80 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי. הפשרת דגימות קפוא בקרח לפני השימוש.
  2. לדגימות בנסיוב אדם: השתמש גם הדוגמאות סרום טרי או קפוא.
  3. עבור ZIKV נגוע שורות תאים: להשתמש במדיה ממוזגים או תא lysates.
    הערה: נטול תאים ממוזגים מדיה Ae. albopictus C6/36 תאים 8 ימים לאחר הפגיעה יכול לשמש כפקדי חיובי לתגובות ZIKV RT-המנורה.
  4. Aegypti Ae. היתושים: להשתמש גם הגוויות יתושים שלם טרי או קפוא. הפשרת יתושים קפוא בקרח. להכין יתוש גולמי lysate על-ידי הצבת של יתוש בודדים µL 100 של באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS), homogenize על ידי ריסוק היתוש 10 פעמים עם טיפ pipet P10 (איור 1). בקצרה centrifuge את lysate כדי הצניפה נפולת הגולמי. השתמש את תגובת שיקוע לניתוח RT-המנורה במורד הזרם.
    הערה: בקרת חיובי יכול להיווצר באווירה מעבדה ע י הדבקה הנשי יתושים באמצעות intrathoracic microinjection במקבילות גנום3 כ 10 של וירוס באמצעי אחסון של 200 nL קצירת היתוש 5 ימים לאחר הפגיעה.

3. להכין מיקס מאסטר RT-מנורה

  1. להכין תגובה מיקס מאסטר RT-המנורה על קרח כל פריימר מוגדר לשמש באמצעות מדריך נפח בטבלה3.
    הערה: השימוש של thermolabile אורציל דנ א Glycosylase (UDG) מסייע במניעת תוצאות חיוביות שגויות.
  2. מערבולת בקצרה על מנת להבטיח כי כל דוגמאות מעורבבים היטב, ואז לסובב למטה בקצרה כדי למנוע אובדן נפח.

4. RT-המנורה Assay

  1. Pipet 23.0 µL של המיקס RT-המנורה הראשית לכל תגובה לתוך צינור PCR 200 µL. הוסף µL 2.0 מדגם (שתן, סרום או יתוש גולמי lysate תגובת שיקוע כפי שמתואר בשלב 2). זה יביא את הנפח הכולל µL 25.0 לכל תגובה RT-המנורה. עבור הפקד שלילי, להשתמש במים ברמה המולקולרית. כוללות פקד חיובי.
    הערה: מניות רגיל או וירוס ה-PCR של תגובת שיקוע של שורות תאים נגועים יכול לשמש כפקד חיובי.
    1. אופציונלי: כוללים בקרת ירידה לפרטים תגובה של arbovirus נלווים כגון וירוס דנגה (DENV). הכנת המדגם כמתואר בשלב 2 לפי סוג הדגימה. להוסיף µL 2.0 של הפקד ירידה לפרטים µL 23.0 של המיקס RT-המנורה הראשית לתוך צינור PCR 200 µL.
  2. מחממים את הדגימות ב 61 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות באמצעות בלוק חימום, תנורים או thermocycler.
  3. חום לבטל את פולימראז על-ידי חימום עד 80 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.

5. RT-המנורה ניתוח

הערה: לבצע ניתוח RT-המנורה חלל נפרד המצורף.

  1. לאחר הדגירה, לגשת RT-המנורה תגובות ויזואלית על ידי מחפש את הנוכחות של שינוי צבע.
    1. לדלל את חומצת גרעין פלורסנט לצבוע 1:10 במאגר טה (40 מ"מ טריס, חומצה אצטית 20 מ מ 1 מ"מ EDTA).
      התראה: כל כתם חומצת גרעין נקשר חומצות גרעין, ולכן הוא חומר מסרטן. ללבוש כפפות בעת הטיפול.
    2. כדי µL 12 התגובה RT-המנורה, להוסיף 2 µL של דילול צבעי פלורסנט חומצת גרעין.
      הערה: תגובות שליליות יהיה כתום, תגובות חיוביות יהיה צהוב/ירוק בצבע.
    3. אופציונלי: לצלם תמונות של RT-המנורה תגובות על רקע לבן בעזרת מצלמה.
  2. במקום הדגימות תחת 302 nm UV אור לאשר הנוכחות של RT-המנורה מוצרים על-ידי קרינה פלואורסצנטית. לצלם התוצאה בעזרת מצלמה.
    הערה: תגובות חיוביות RT-המנורה יהיה הפלט של פלורסנט.
    התראה: ללבוש מגן גוגל או פנים העין מגן UV בעת עבודה עם אור UV.
  3. אופציונלי: לאשר הנוכחות של מוצרים RT-המנורה על ידי ביצוע בג'ל על הדגימות.
    1. יוצקים 2% agarose ג'ל במאגר x TAE 1 עם כתם חומצת גרעין עבור פריט חזותי.
      התראה: כל כתם חומצת גרעין נקשר חומצות גרעין, ולכן הוא חומר מסרטן. ללבוש כפפות בעת הטיפול.
    2. הוסף µL 5 של סולם הדנ א במסלול הראשון כדי להשוות את המשקולות מולקולרית.
    3. עבור כל תגובה RT-המנורה, מערבבים µL 13 תערובת התגובה RT-מנורה עם 2 µL של ה-DNA בטעינת צבע. לטעון את התערובת 15 µL המכיל את ה-DNA בטעינת צבע.
    4. הפעל את הג'ל על 90 V במשך 90 דקות או עד הלהקות מופרדים ותמונה עם 302 אור UV ננומטר.
      הערה: תגובות חיוביות RT-המנורה יש דפוס laddering. תגובות שליליות RT-המנורה לא להכיל להקות.

6. סילוק

  1. תשליך RT-המנורה תגובות בשקיות חתומות כפול. תעשה לא אוטוקלב זה ייתכן aerosolize המוצרים RT-המנורה, שמוביל תגובות חיוביות כוזבות בעתיד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RT-המנורה תגובות ניתן לנתח באמצעות שלוש שיטות שונות. ראשית, עם התוספת של צבע פלורסנט חומצת גרעין, תגובות חיוביות יהיה צהוב/ירוק צבע היכן תגובות שליליות. תופיע כתום בעין בלתי מזוינת. שנית, התוספת של חומצת גרעין פלורסנט לצבוע את התגובה RT-המנורה תוצאות ב אות ניאון כאשר הדגימות שמחים על ידי אור UV. תגובות שליליות לא תהיה אות ניאון לזיהוי מעל כל זריחה רקע שעשויות להופיע בכמויות קטנות של הפקד שלילי. לבסוף, ניתן להפעיל RT-המנורה תגובות על ג'ל agarose. תגובות חיוביות RT-המנורה יש תבנית בעלת רצוע...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

וזמינותו ZIKV RT-המנורה המתוארת בעלון זה עבודות נייר באמצעות דגימות של האדם והן יתושים-6. המגבלה של זיהוי היה כ 1 גנום שוות ערך6, אשר אמורה להספיק מאז המטען הנגיפי טיפוסי של חולה סימפטומטי ZIKV נגוע הוא 103 כדי 6 10 PFU/mL7. בנוסף, שיטה זו יכול לזהות ZIKV בדגימות ללא RNA בידוד הראשון וללא הגברה וירוס תרבית תאים. פעולה זו מפחיתה באופן משמעותי את זמן, עלות, הסיכונים הבריאותיים של זה וזמינותו בהשוואה לרביעיית-PCR.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ארוחת ליל סדר MBC יש קניין רוחני על שיטות אבחון Zika וירוס. המחברים הנותרים יש אין אינטרסים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי תרומה פילנתרופית משפחה מורין, רונלד הירש שדה מכון מדעי המח, כנסיית מריה הקדושה של מישיגן. התורמים שחיים היה אין תפקיד תכנון המחקר, איסוף נתונים, ניתוח, ההחלטה לפרסם או אופן ההכנה של כתב היד. אנו מודים גם ד ר ברנדט Zwaans, אליהו וורד עבור שלהם סקירה ביקורתית של כתב היד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Bst 2.0 WarmStart DNA פולימראזניו אינגלנד BiolabsM0537S
 ניו אינגלנד BiolabsB0537S
WarmStart RTx טרנסקריפטאז הפוךניו אינגלנד BiolabsM0380S
אנטארקטיקה תרמולאביל UDGניו אינגלנד BiolabsM0372S
MgSO4New England BiolabsB1003S
100 mM dATP פתרוןניו אינגלנד BiolabsN0440Sדאוקסינוקלאוטיד N0446S
100 מ"מ תמיסת dCTPניו אינגלנד ביולאבסN0441Sסט דאוקסינוקלאוטיד N0446S
100 מ"מ תמיסת dTTPניו אינגלנד ביולאבסN0443Sסט דאוקסינוקלאוטידים N0446S
100 מ"מ תמיסת dGTPניו אינגלנד ביולאבסN0442Sסט דאוקסינוקלאוטיד N0446S
100 מ"מ תמיסת dUTPתרמו פישר סיינטיפיקR0133
SYBR חומצת גרעין ירוקה I כתם ג'לInvitrogenS7563
Nancy-520Sigma Aldrich01494
סולם מסת DNA נמוךInvitrogen10-068-013
זיקה בקרת פוסטיבמכון רוברט קוך, גרמניהN/A
AgaroseThermo Fisher ScientificBP1600
BlueJuice מאגר טעינת ג'לInvitrogen
10816015 פריימריםטכנולוגיות DNA משולבותמותאמות אישית Oligo
Nuclease-Free WaterAmbionAM9938
חומר משמר שתןNorgen Biotek18126
ZIKV PCR Standardמכון רוברט קוךN/AVero E6 תאים סופרנטנטים
DENV2 גינאה החדשה C בקרתקונטיקט ניסוי חקלאי תחנהלא ישים
מאגר הגברה איזותרמית

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Petersen, L. R., Jamieson, D. J., Powers, A. M., Honein, M. A. Zika Virus. New England Journal of Medicine. 374 (16), 1552-1563 (2016).
  2. Francois, P., et al. Robustness of a loop-mediated isothermal amplification reaction for diagnostic applications. Federation of European Microbiological Societies Immunology and Medical Microbiology. 62 (1), 41-48 (2011).
  3. Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products. Nature Protocols. 3 (5), 877-882 (2008).
  4. Gandasegui, J., et al. The Rapid-Heat LAMPellet Method: A Potential Diagnostic Method for Human Urogenital Schistosomiasis. Public Library of Science Neglected Tropical Diseases. 9 (7), 0003963(2015).
  5. Barkway, C. P., Pocock, R. L., Vrba, V., Blake, D. P. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays for the species-specific detection of Eimeria that infect chickens. The Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
  6. Lamb, L. E., et al. Rapid Detection of Zika Virus in Urine Samples and Infected Mosquitos by Reverse Transcription-Loop-Mediated Isothermal Amplification. Scientific Reports. 8 (1), 3803(2018).
  7. Faye, O., et al. One-step RT-PCR for detection of Zika virus. Journal of Clinical Virology. 43 (1), 96-101 (2008).
  8. Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. PCR inhibitors - occurrence, properties and removal. Journal of Applied Microbiology. 113 (5), 1014-1026 (2012).
  9. Poole, C. B., Tanner, N. A., Zhang, Y., Evans, T. C., Carlow, C. K. Diagnosis of brugian filariasis by loop-mediated isothermal amplification. Public Library of Science Neglected Tropical Diseases. 6 (12), 1948(2012).
  10. Tanner, N. A., Zhang, Y., Evans, T. C. Simultaneous multiple target detection in real-time loop-mediated isothermal amplification. Biotechniques. 53 (2), 81-89 (2012).
  11. Chan, K., et al. Rapid, Affordable and Portable Medium-Throughput Molecular Device for Zika Virus. Scientific Reports. 6, 38223(2016).
  12. Lee, D., et al. Simple and Highly Sensitive Molecular Diagnosis of Zika Virus by Lateral Flow Assays. Analytical Chemistry. 88 (24), 12272-12278 (2016).
  13. Pardee, K., et al. Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
  14. Song, J., et al. Instrument-Free Point-of-Care Molecular Detection of Zika Virus. Analytical Chemistry. 88 (14), 7289-7294 (2016).
  15. Yaren, O., et al. Point of sampling detection of Zika virus within a multiplexed kit capable of detecting dengue and chikungunya. BioMed Central Infectious Diseases. 17 (1), 293(2017).
  16. Wang, X., et al. Rapid and sensitive detection of Zika virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 238, 86-93 (2016).
  17. Priye, A., et al. A smartphone-based diagnostic platform for rapid detection of Zika, chikungunya, and dengue viruses. Scientific Reports. 7, 44778(2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

RNAMaster Mix

מאמרים קשורים