חלבון חוץ-תאית הטכנולוגיה Microarray לגילוי תפוקה גבוהה של אינטראקציות קולטן-ליגנד זיקה נמוכה

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מסך חלבון חוץ-תאי מיקרו-מערכים זיהוי הקולטן הרומן-ליגנד אינטראקציות תפוקה גבוהה. אנו גם מתארים שיטה כדי לשפר זיהוי של אינטראקציות חלבון ארעי באמצעות קומפלקסים של חלבונים-microbead.

Abstract

גורמים המופרש, קולטני ממברנה-קשורה ושותפים שמעצבת את הרגולטורים העיקריים של התקשורת הסלולארית. והתחלה איתות cascades במהלך הומאוסטזיס ומחלות, וככזה מייצגים עיקרי מטרות טיפוליות. למרות הרלוונטיות שלהם, רשתות אינטראקציה אלה נותרו באופן משמעותי underrepresented במסדי הנתונים הנוכחי; לכן, ביותר חוץ-תאית חלבונים שיהיה אין שותף מחייב מתועדת. חוסר התאמה זה נובע בעיקר האתגרים הקשורים בחקר החלבונים חוץ-תאית, כולל ביטוי של חלבונים פונקציונליים, ואינטראקציות בזיקה חלש, נמוך, חלבון שנוצר לעיתים קרובות בין קולטני פני שטח התא. מטרת שיטה זו היא לתאר את הדפסת ספריה של חלבונים חוץ-תאית בתבנית microarray להקרנה של אינטראקציות חלבון-חלבון. כדי לאפשר זיהוי של אינטראקציות חלשות, מתוארת שיטה המבוססת על multimerization של החלבון שאילתה שנבחנה. מצמידים לגישה זו מבוססת על microbead multimerization על multivalency מוגברת, microarray חלבון מאפשרת זיהוי חזקים של אינטראקציות חלבון ארעי תפוקה גבוהה. שיטה זו מציעה מדגם מהיר ונמוך לצרוך-גישה לזיהוי של אינטראקציות חדשות החלות על כל חלבון חוץ-תאית. חלבון microarray הדפסה וסינון פרוטוקול מתוארים. טכנולוגיה זו תהיה שימושית עבור חוקרים המבקשים שיטה חזקה של גילוי של אינטראקציות חלבון בחלל חוץ-תאית.

Introduction

השיטה שנסקרו כאן מתאר ההדפסה של אוסף של חלבונים חוץ-תאית בתבנית microarray, ואחריו שיטה להקרנה של מטרה עניין נגד בספריה זו. זיהינו את החלבון multimerization כצעד מכריע לצורך זיהוי של אינטראקציות מאופיין על ידי איגוד נמוך הזיקות. כדי לשפר זיהוי של אינטראקציות אלה, אנו מתארים פרוטוקול מבוסס על multimerization של החלבון שאילתה עניין באמצעות גרגרי.

מופרש, תא השטח הביע חלבונים (הנקרא באופן קולקטיבי חלבונים חוץ-תאית) יחד עם שותפים שמעצבת את הרגולטורים מפתח תקשורת סלולרית, איתות ואינטראקציה עם microenvironment. הם חיוניים, לכן, בוויסות תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים רבים. בערך רבע של הגנום האנושי (≈5, 000 חלבונים) מקודד חלבונים חוץ-תאית, אשר, בהתח....

Protocol

1. דור של ספריה של חלבונים אנושיים חוץ-תאית

1. בצע הידור רשימה של קולטני פני שטח התא או חלבוני המופרש עניין לבנות את ספריית microarray חלבון. משפחות חלבון ספציפי (לדוגמה, superfamily immunoglobulin) או חלבונים באופן סלקטיבי לידי ביטוי בפרט תא ניתן לבחור סוגי לצורך המחקר.
2. עבור קולטני פני שטח התא, לקבוע את גבולות התחום חוץ-תאית (ECD) על-ידי זיהוי האות פפטיד ואזורים transmembrane באמצעות כלי תוכנה. חלק הרלוונטי כלים, זמינה בחופשיות באינטרנט, שאליהם מפנה את השולחן של חומרים^15,16,17,18.
3. לסנתז ECD על הגנ....

Results

תיאור סכמטי של זרימת העבודה עבור טכנולוגיית microarray חלבון חוץ-תאית מוצג באיור1. וברגע שהשקופיות microarray המכיל ספריית חלבון חוץ-תאית זמינים, ההקרנה של החלבון עניין וניתוח נתונים יכולה להסתיים תוך יום אחד. רבים רלוונטי מבחינה פיזיולוגית האינטראקציות בין קולטני ממברנה-מוטבע מאופיינים על ידי איגוד חלש מאוד החוזקות (K_D בטווח micromolar). כדי לשפר זיהוי של אינטראקציות כאלה, פותחה שיטה המבוססת על השאילתה multimerization חלבון (המבוטא פיוז'ן Fc)-חלבו.......

Discussion

מספר משמעותי של קולטנים יתומה הגנום האנושי ו הרומן שותפים שמעצבת להמשיך להופיע חלבונים חוץ-תאית עם ליגנדים מאופיין בעבר. הגדרת קשרי הגומלין ליגנד לקולטן של האדם ואורגניזמים דגם חיוני להבין את המנגנונים מכתיב תקשורת סלולרית במהלך הומאוסטזיס, וכן dysregulation למחלות, ולהודיע לכן חדשות או משופרות אפשרויות טיפוליות. למרות זאת, זיהוי של אינטראקציות חלבון חוץ-תאית על ידי טכנולוגיות בשימוש נרחב ייצג חסם משמעותי בעיקר בשל האתגרים הטכניים משויך את הביוכימיה של קולטני הסלולר ובין שותפותיהן אינטראקציה. בדו ח זה אנו מתארים את השימו.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
גליצרול טהור במיוחד בדרגת MB	USB Corporation	56-81-5	אחסון חלבון
SeptoMark מאגר חוסם	Zeptosens	BB1, 90-40	חסימת מאגר מיקרו-מערך שקופיות
אלבומין סרום בקר	Roche	03-117-957-001	בקרת שקופיות להתאמת מסכה (אופציונלי)
צלחות פוליפרופילן מרובות בארות	Greiner Bio One	82050-678	אחסון חלבון
צלחות פוליפרופילן מרובות בארות	Arrayit	MMP384	הדפסת שקופיות
NanoPrint LM60, או מגע דומה מיקרו-מערך	Arrayit	NanoPrint LM60, או מיקרו-מערך מגע דומה	הדפסת שקופיות
מיקרו סיכות איתור	Arrayit	מיקרו סיכות איתור הדפסת	שקופיות
תחנת חסימת ZeptoFOG	תחנת חסימה ZeptoFOG, 1210	חסום שקופיות לאחר הדפסת
אבקת חלב רזה	Thermo Fisher	LP0031	פתרון
חסימהשקופית זכוכית מצופה אפוקסיסילן	Nextrion Slide E	1064016	Microarray שקופיות
מחזיק זכוכית וסט מתלה שקופיות	Wheaton	900303	אחסון שקופיות
Cy5 צבע מונו-ריאקטיבי	GE Healthcare	PA23031	תיוג אלבומין
Cy5 צבע מונו-ריאקטיבי	GE Healthcare	PA25001	תיוג IgG אנושי עמוד
התפלה Pro-spin	פרינסטון הפרדות	CS-800	הסר צבע חופשי
אטם רדיד אלומיניום דבק	AlumaSeal	F-384-100	חותם לוחות מלאי
בקבוקונים קריוגניים פוליפרופילן		430658	בקבוקוני מאסטר לאחסון ספריית חלבון
מיקרו-חרוזים	Miltenyi	120-000-396	מולטימריזציה של חלבון
IgG אנושי	ג'קסון Immunoresearch	& נ.ב.פ; 009-000-003	IgG לא רלוונטי לסימון
חלבון A	סיגמא	P7837	Microarray חסימת שקופיות
תחנת היברידיזציה, a-Hyb או תחנת	Miltenyi	דומה, a-Hyb או דומה	עיבוד מיקרו-מערך אוטומטי (אופציונלי)
סורק GenePix 4000B או	התקנים מולקולריים	סורק GenePix 4000B או דומה	סריקת שקופיות
GenePix Pro או תוכנת חילוץ נתונים שווה ערך	מכשירים	מולקולרייםGenePix Pro או תוכנת חילוץ נתונים שווה ערך	נתונים
אות P4.1	DTU ביואינפורמטיקה, תוכנה מקוונת של האוניברסיטה הטכנית של דנמרק		כלי חיזוי לקביעת נוכחות ומיקום של אתרי מחשוף פפטיד אותות
TMHMM 2.0 שרת DTU	ביואינפורמטיקה, תוכנה מקוונת של האוניברסיטה הטכנית של דנמרק		חיזוי סלילי טרנסממברנה בחלבונים
פוביוס	תוכנה מקוונת של המרכז לביואינפורמטיקה בשטוקהולם		טופולוגיה טרנסממברנית משולבת ומנבא פפטיד אותות
TOPCONS	תוכנה מקוונת	אוניברסיטת שטוקהולם	חיזוי טופולוגיית ממברנה ופפטידי אותות