הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הערכת אפקטים Neuroprotective של בסיס Glycyrrhizae et Rhizoma לחלץ באמצעות מודל העכבר חסימה של עורק המוח התיכון ארעית

7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/58454

⸱

9 בדצמבר 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Korean Medicine, Pusan National University, 2College of Medicine, Dongguk University, 3Kyunghee Naseul Korean Medicine Clinic

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

במחקר זה, נוכל לשנות שיטה ניסיונית קיימת כדי להשיג תוצאות לשחזור יותר, על-ידי יצירת מודל העכבר סגר (MCAO) של עורק המוח התיכון. אוראלי מינהל Glycyrrhizae בסיס et תמצית מתנול קנה שורש (גר) (GRex), בעקבות שבץ אינדוקציה, ירד באופן משמעותי אוטם סה כ נפח ביחס קבוצת הביקורת שלא טופלו.

תקציר

איסכמיה ואחריו פגיעה reperfusion של זרימת דם מוחי לאחר שבץ מוביל למותו של תאי עצב ואובדן רקמת המוח. המודל הנפוץ ביותר בעלי חיים לימוד קו הוא הדגם סגר (MCAO) בעורק האמצעי. מחקרים קודמים דיווחו בגדלים שונים לאוטם גם כאשר בני אותו מין חיה ניסיוני שימש בתנאים MCAO דומה. לכן, פיתחנו שיטה ניסיונית משופרת כדי לטפל אי-התאמה זו. עכברים היו נתונים MCAO שימוש נימה של החומר סגר לחקות תנאי קו אנושי, עובי נימה אופטימלי להקים עוד נפח אוטם לשחזור. עכברים שטופלו מתנול תמצית של בסיס Glycyrrhizae et קנה שורש (GRex) בעקבות שבץ אינדוקציה הראה אמצעי אחסון אוטם הכולל ירד משמעותית של מספר רב יותר של הישרדות התאים ביחס קבוצת הביקורת שלא טופלו. זה שונה נסיוני בהצלחה והפגינו reproducibly על השפעה מיטיבה של GRex על שבץ איסכמי.

מבוא

נזק מוחי שנגרם על ידי איסכמיה פגיעה reperfusion של זרימת הדם במוח מוביל למותו של תאי עצב ואובדן רקמת המוח. סוג זה של נזק מוחי ממשיך לגדול עם השכיחות הגוברת של מחלות כשאבדן עקב ההתפשטות של מחלות מטבוליות כגון השמנת יתר, לחץ דם גבוה, סוכרת1,2. המספר המוחלט בחולים קשישים עם קו גדל באופן דרמטי ברחבי העולם, העלות של טיפול רפואי עבור חולים אלו, מי הם לעתים קרובות נותר עם מוגבלות לטווח ארוך, הוא נטל ציבורי גדול. לכן, לקויות משניות צריך אפשרות לפתור כמה שיותר להפחית את הנטל הכלכלי1,2.

מכרסמים הדגם הנפוץ ביותר של אוטם מוחי הוא הדגם סגר (MCAO) בעורק האמצעי (MCA), שבו MCA הוא occluded עם מצופה סיליקון כירורגי הפתולוגיים פילמנט לחסום את זרימת הדם, גורם שבץ איסכמי3, 4. שימוש נימה של החומר סגר מאפשר השליטה של קביעות וזמן סגר על-ידי מניפולציה משך ההוספה פילמנט אינטרה-luminal.

מחקרים קודמים הראו כי גם כאשר נעשה שימוש באותו דגם MCAO מכרסם, הנפח הכולל של אוטם מוחי משתנה בין ניסויים, גורם הפארמצבטית נמוכה של המחקרים. כדי לשפר את הפארמצבטית, אנחנו אופטימיזציה העובי של המטבעות פילמנט המשמשים את הניסוי. התוצאות של מחקר ראשוני של תקופת איסכמי מוחי, אוטם המושרה הראה כי תקופה איסכמי יותר מ 60 דקות מותר האזור הנפחי של נזק לרקמת המוח ניתן להקליט ולצפות במעשיהם לכמת.

בסיס Glycyrrhizae et Rhizoma (גר), הידוע גם בשם שוש מורכב של שורשים מיובשים, המלבלבים של שוש uralensis , קרח ג. זה שימש ברפואה המסורתית סינית וקוריאנית למטרות שונות, כולל תוסף מזון, מסיבות בריאותיות5,6,7.

ב הקודם לימוד8, טיפול קדם עם תמצית מתנול גרם (GRex) הראה אפקט אנטי-מוות בעכברים MCAO, לרבות מניעה משמעותי של הירידה בביטוי חלבונים של B-cell לימפומה 2 (Bcl-2) Bcl גדולים במיוחד (Bcl-xL). מחקר זה נערך כדי לשפר את הפארמצבטית של דגם העכבר MCAO המקובלת על-ידי הערכת היעילות שלה בקביעת אם לאוטם שלאחר הטיפול עם GRex ביעילות מופחת לאוטם האחסון ב- MCAO-induced נזק מוחי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

בכל ההליכים הכרוכים חיות אושרו על ידי ועדת האתיקה של האוניברסיטה הלאומית פוסאן (מספר אישור, PNU-2016-1087). סקירה גרפית של מחקר זה מוצג באיור1.

1. הכנה וניהול של GRex

הערה: כדי לבחור השתמשו במחקר זה נרכש מחברת התרופות מסחרי.

  1. במקום 200 גר' GR ב- 2,000 מ של מתנול, דגירה בטמפרטורת החדר (25 ° C) במשך 5 ימים.
  2. לסנן את התערובת בעזרת נייר סינון 0.26 מ מ עובי וגודל 5 מיקרומטר נקבובית ולאחר מכן הסר את תגובת שיקוע. להוסיף 1000 מ של מתנול השאריות GR ולסנן שוב.
  3. לשלב את שני supernatants, לסנן דרך נייר סינון, לרכז תחת ואקום, ולהקפיא ואז השאריות כדי לייצר GRex.
  4. להמיס את GRex ב דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד), שתדללו עם תמיסת מלח פיזיולוגית של 0.9%, לסנן דרך מסנן מזרק 0.45 מיקרומטר. לאחר מכן, התאם את הריכוז הסופי של דימתיל סולפוקסיד < 5%.
  5. לנהל GRex (300 מ"ג/ק"ג משקל גוף) 1 h לאחר פגיעה reperfusion של MCAO דרך gavage דרך הפה. לנהל דימתיל סולפוקסיד מעורבבת עם תמיסת מלח פיזיולוגית (10 מ"ל/ק"ג משקל גוף) רק על קבוצה נורמלית של קבוצות שליטה, בהתאמה.
    הערה: ריכוז GRex השתמשו בניסוי זה נקבע על-פי הריכוז היתה פעילה עד המחקר הקודם שלנו8.

2. העכבר בדגם MCAO

  1. בשימוש הגברי C57BL/6 עכברים בגיל 6 שבועות, במשקל של 22-25 g... לספק כל החיות עם גישה חופשית תקן האוכל ומים הבית אותם בסביבה עם טמפרטורה מבוקרת (22 ± 1 ° C) ואת מחזור/כהה 12 שעות.
    1. לחלק העכברים קבוצות של עכברים 6 כל אחד, אשר צריכה להיות מורכבת המופעלים באמצעות העמדת פנים רגיל, שליטה וקבוצות טיפול GRex.
    2. לבצע ניתוח MCAO (שינוי של השיטה של קואיזומי. et al. 9) על שליטה ועל קבוצות טיפול GRex באמצעות מיקרוסקופ סטריאו.
  2. לגרום הרדמה שאיפת בעכברים באמצעות איזופלוריין 2%-70% N2O ו- 30% O2. הרדמה נחשב מספיק כאשר העכבר מפסיק להגיב לגירוי מכני חלה על זנבו. לשמור על טמפרטורת הגוף של העכברים-36.5 ± 0.5 ° C באמצעות גוף השמיכה טמפרטורה החזקת מחובר מד חום.
  3. להסיר את כל השיער על החזה ואת הצוואר של העכברים מאת גילוח ואחריו השימוש קרם להסרת שיער, לחטא באתר כירורגית של העור עם betadine סקראב לסירוגין עם אלכוהול עבור שתי פעמים, ולאחר מכן בצע חתך של 2 ס מ ארוך עם כירורגית להב במרכז הצוואר. בזהירות לבודד את השמאלי עורק תרדמני (LCCA), העורק החיצוני ואת הסניף של העורק שבסביבה רקמות החיבור.
  4. מאתרים ומפסיקים את עורק חיצוני, את עורק תרדמני בתפר כירורגי (4-0 בתפר משי, תקלות חצי קשר) באופן זמני לחסום את זרימת הדם לתוך העורק במהלך המבצע.
  5. הוסף התפר ניילון מצופה סיליקון (8-0 monofilament, 11 מ"מ) דרך העורק על מוצאם של MCA השמאלי. להתאים את העובי של החלק מצופה סיליקון של חוט הלהט לטווח של 0.10-0.12 מ"מ.
  6. למדוד את הירידה בזרימת הדם המוחית היחסי (rCBF) ב- MCA באמצעות זרימה דופלר של לייזר. MCAO תאושר כאשר rCBF נשמרת ב- < 20% מהערכים בתנאי מנוחה במהלך תקופת איסכמי כולה.
  7. לתקן את הסיב שנוסף על כלי הדם כבר שעתיים בזמן עורק המוח הוא occluded, ואז מסירים בזהירות את הסיב כדי לשחזר את זרימת הדם עבור h 22 של פגיעה reperfusion. תפר את העור על ידי תפירה 5 מקומות (3-0 בתפר משי, שני מכשולים חצי קשר) ולאפשר לכל בעכבר כדי להתעורר מההרדמה.
  8. בקבוצה רגילה, לבצע פעולת המזויפים בעקבות ההליך אותו מעל (עד 2.4), עם החריגה הבאה. מאתרים ומפסיקים את עורק תרדמני, תפר את חרות שריר ועור.

3. מדידה של נפח של רקמת המוח הפגוע

  1. לאחר המתת חסד של העכברים למדידה נזק מוחי עם שאיפת2 CO, בלו העכבר מוח 24 שעות לאחר תחילתה של MCAO באמצעות מספריים כירורגיים איריס ומלקחיים בזווית.
    1. לאחר הסרת את הראש באמצעות מספריים, לעשות חתך בעור קו האמצע של הראש להטיל על העור מהגולגולת.
    2. לשבור עצמות הקודקוד עם מלקחיים זוויתי, פילינג ביטול דורא משנה באותו זמן, אז לבודד את המוח בקפידה מתוך הגולגולת.
  2. גזור רקמת נכרת למקטעים (1 מ מ עבה) שימוש במטריצה מוח העכבר ולאחר מכן כתם הסעיפים במשך 17 דקות בפתרון של 2% 2,3,5-triphenyltetrazolium כלוריד (TTC).
  3. לתקן את הסעיפים בפורמלין 10% כבר לפחות שעתיים, ואז לצלם אותם באמצעות מצלמה דיגיטלית. TTC יתקיימו כתם רקמות קיימא אדום, בעוד אזורי נמק יהיה לבן.
  4. לנתח ולכמת את האזור לאוטם מוחי של כל מקטע באמצעות ImageJ.

4. hematoxylin ואת אאוזין (H & E) Cresyl מכתים סגול סעיפים היסטולוגית

  1. המתת חסד העכברים למחקר היסטולוגית באמצעות אינהלציה2 CO, perfuse אותם transcardially עם 10 מ ל תמיסת באגירה פוספט (PBS), ואחריו 10 מ"ל של 4% paraformaldehyde (PFA). לבודד את המוח באמצעות שתוארו לעיל (3.1), לטבול את המוח ב- 10 מ"ל של 30% סוכרוז למשך הלילה.
  2. להטביע על רקמת המוח טמפרטורה אופטימלית חיתוך (אוקטובר) מתחם ולחתוך אותו coronally למקטעים 15-מיקרומטר-עבה באמצעות של cryostat. הר הסעיפים בשקופיות זכוכית, ואחריו מכתים עם hematoxylin אאוזין (H & E) או סגול cresyl.
  3. לטבול את השקופיות זכוכית 80% אתנול עבור 1 דקות ולאחריו מכתים בפתרון hematoxylin במשך 5 דקות.
    1. טובלים את השקופיות ב- 1% אלכוהול חומצה פעמיים, לטבול בתמיסה רוויה ליתיום קרבונט ב-30 s, תשטוף עם מים מהברז של 30 s ולאחר מכן counterstain ב eosin פתרון עבור 30 s.
    2. לשטוף את השקופיות במי ברז, לטבול 95% ואתנול מוחלטת ברצף.
    3. מילה נהדרת השקופיות, לנקות אותם ב קסילן לפחות 10 דקות ולאחר מכן לטעון על coverslips באמצעות הרכבה בינונית.
  4. במקום שקופיות זכוכית על שקופית חמים במשך לפחות שעה, ואחריה טבילה באתנול 50% מדולל עם הכלורופורם בן לילה.
    1. מכתים את השקופיות בויולט cresyl 0.1% 10 דקות בתנור יבש 40 ° C.
    2. לטבול אתנול 95% במשך 30 דקות ולאחר מכן מייבשים באתנול מוחלטת על פי 2.
    3. נקה 2 פעמים ב קסילן למשך 5 דקות ולאחר מכן לטעון עם הרכבה בינונית לאחר ייבוש האויר.
  5. באמצעות מיקרוסקופ, שים לב היסטולוגית השינויים שהתרחשו לאחר פגיעה מוחית הנגרמת MCAO.

5. ניתוח סטטיסטי

  1. לבטא את תוצאות הניסוי בתור אמצעי ± סטיית התקן וקבע את מובהקות סטטיסטית בין הקבוצות באמצעות בכיוון אחד ניתוח של שונות (ANOVA) ואחריו ניתוח פוסט הוק של Tukey באמצעות תוכנת ניתוח נתונים.
  2. להגדיר את מובהקות סטטיסטית p-הערך < 0.05.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בקבוצה המופעלים באמצעות העמדת פנים רגיל, אין לאוטם מוחי הוא ציין ואילו בקבוצת הביקורת, נצפית מגוון רחב יחסית של אזורים פגועים. בעכברים מנוהל 300 מ"ג/ק"ג GRex בקבוצה מודל MCAO, ירידה משמעותית מבחינה סטטיסטית באזור הפגוע הוא ציין (איור 2).

השינויים היסטולוגית נחקרות על ידי צביעת מוח איסכמי מקטעים בויולט H & E או cresyl. צביעת המטוקסילין מספק מידע מבניים ומידע פונקציונלי מסוים על תאים

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

עם השכיחות הגוברת של מחלות מטבוליות כגון יתר לחץ דם כרוני, סוכרת, היפרליפידמיה, המהווים גורמי סיכון עיקריים עבור קו, קו מניעה וטיפול הפכו אזור חשוב של המחקר הרפואי12, 13. לגירעונות שפה ותנועה לאחר שבץ חזק נמצאים בקורלציה עם מידת הנזק במוח רקמות14 , לגרום שאיכות החיים עבור חולים ואת המשפחות שלהם15. חשוב להשתמש במודל חיה המתאימה של שבץ המערבת את אותם שינויים פתולוגיים לאלה המתרחשים מחלות אנושיות כדי לחקור את היעילות ש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Glycyrrhizae Radix et RhizomaGwangmyoung Pharmaceuticals Co., קוריאהGlycyrrhizae Radix et Rhizoma
נייר סינון איכותיAdvantecנייר סינון מס' 2נייר סינון איכותי
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)SigmaD8418-250MLדימתיל סולפוקסיד (DMSO)
מסנן מזרק (0.45 µ מ)CLS431220 סיגמא(0.45 ומיקרו; m)
מיקרוסקופ סטריאוLeicaM50מיקרוסקופ
סטריאו מיקרוסקופ סטריאוNikonSMZ745מיקרוסקופ סטריאו
לייזר דופלרמור מכשירmoorVMS-LDFלייזר דופלר
הרדמה סוגר שולחן עם N2O & מערכת מד זרימה O2Harvard Appratus34-1352תושבת שולחן הרדמה עם N2O& מערכת מד זרימה O2
מערכת ניטור הומותרמיתהרווארד Appratus55-7020מערכת ניטור הומותרמית
מצלמה דיגיטליתCanonEos-M2מצלמה דיגיטלית
CryostatLeicaCM3050Sקריוסטט
קארל זייסזייס Axioניתוח נתונים של מיקרוסקופ
Systat Software Inc.SigmaPlot גרסה 12ניתוח
נתונים ניתוח נתוניםNIH ImageImageJניתוח נתונים
דיאטת עכברDoo Yeol Biotechצ'או מכרסמים סטנדרטידיאטת עכבר
IsofluraneJOONGWAEA02104781Isoflurane
IsofluraneTROIKAAISOTROY 100תפר משי איזופלורן
(4-0 משי שחור) AILEESK47510תפר משי (4-0 משי שחור) 
תפר משי (3-0 משי לבן) Baekjae57תפר משי (3-0 משי לבן) 
תפר ניילון (מונופילמנט 8-0) AILEENB825תפר ניילון (8-0 מונופילמנט) 
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC)SigmaT8877-25G2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC)
פורמלין (תמיסת פורמלדהיד)JUNSEI69360-1263 20 ק"גפורמלין (תמיסת פורמלדהיד)
המטוקסילין (האריס המטוקסילין)YD DiagnosticsEasyStainHematoxylin (Harris Hematoxylin)
Eosin (1% תמיסת Eosin Y)MUTO PURE CHEMICALS3200-2אאוזין (תמיסת 1% אאוזין Y)
קרזיל סגול (אצטט)סיגמאC5042-10Gקרזיל סגול (אצטט)
פרפורמלדהיד סיגמא-אולדריץ'P6148-1KGפרפורמלדהיד 
סוכרוזJUNSEI31365-0350 1 ק"גסוכרוז
תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT)Scigen4583תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT)
סכין חיתוךכלי מדע עדינים10055-12סכין ניתוק
#4 מלקחייםכלים מדעיים עדינים11241-30#4 מלקחיים
5 מלקחייםכלים מדעיים עדינים11254-20#5 מלקחיים
#6 מלקחייםכלים מדעיים עדינים11260-20#6 מלקחיים
7 מלקחיים עדיניםכלי מדע עדינים11274-20#7 מלקחיים עדינים
מספריים כירורגייםכלי מדע עדינים14001-12מספריים כירורגיים
מספריים בון עדינים במיוחדכלי מדע עדינים 14084-08מספריים בון עדינים במיוחד
אביב מוריה פסשף-וולף מספרייםכלי מדע עדינים15371-92Moria Pascheff-Wolff אביב מספריים
מלקחיים מרחיבמדע עדין 18153-11מלקחיים מרחיב כלי
מסנן מזרק מיקרוסקופ # # כלי כלי

מקורות

  1. Bejot, Y., Delpont, B., Giroud, M. Rising stroke incidence in young adults: more epidemiological evidence, more questions to be answered. Journal of the American Heart Association. 11 (5), (2016).
  2. Hadadha, M., Vakili, A., Bandegi, A. R. Effect of the inhibition of hydrogen sulfide synthesis on ischemic injury and oxidative stress biomarkers in a transient model of focal cerebral ischemia in rats. Journal of Stroke and Cerebrovascular Diseases. 24 (12), 2676-2684 (2015).
  3. Durukan, A., Tatlisumak, T. Animal models of ischemic stroke. Article in Handbook of Clinical Neurology. 92, 43-66 (2009).
  4. Kim, D. Animal Models of Stroke. Brain and Neurorehabilitation. 4 (1), 1-11 (2011).
  5. Rizzato, G., Scalabrin, E., Radaelli, M., Capodaglio, G., Piccolo, O. A new exploration of licorice metabolome. Food Chemistry. 221, 959-968 (2017).
  6. Zhu, Z., et al. Rapid determination of flavonoids in licorice and comparison of three licorice species. Journal of Separation Science. 39 (3), 473-482 (2016).
  7. Ota, M., Mikage, M., Cai, S. Q. Herbological study on the medicinal effects of roasted licorice and honey-roasted licorice. Yakushigaku Zasshi. 50 (1), 38-45 (2015).
  8. Lim, C., et al. Licorice pretreatment protects against brain damage induced by middle cerebral artery occlusion in mice. Journal of Medicinal Food. 21 (5), 474-480 (2018).
  9. Koizumi, J. Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema. Nosotchu. 8 (1), 1-8 (1986).
  10. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).
  11. Zhu, Y., Liu, F., Zou, X., Torbey, M. Comparison of unbiased estimation of neuronal number in the rat hippocampus with different staining methods. Journal of Neuroscience Methods. 254, 73-79 (2005).
  12. Alberts, M. J., Ovbiagele, B. Current strategies for ischemic stroke prevention: role of multimodal combination therapies. Journal of Neurology. 254 (10), 1414-1426 (2007).
  13. Pinto, A., Tuttolomondo, A., Di Raimondo, D., Fernandez, P., Licata, G. Cerebrovascular risk factors and clinical classification of strokes. Seminars in Vascular Medicine. 4 (3), 287-303 (2004).
  14. Barlow, S. J. Identifying the brain regions associated with acute spasticity in patients diagnosed with an ischemic stroke. Somatosensory and Motor Research. 33 (2), 1-8 (2016).
  15. Roth, S., Liesz, A. Stroke research at the crossroads - where are we heading. Swiss Medical Weekly. 146, 14329(2016).
  16. Feuerstein, G. Z., Wang, X. Animal models of stroke. Molecular Medicine Today. 6 (3), 133-135 (2000).
  17. Herson, P. S., Traystman, R. J. Animal models of stroke: translational potential at present and in 2050. Future Neurology. 9 (5), 541-551 (2014).
  18. Kumar, A., Gupta Aakriti, V. A review on animal models of stroke: an update. Brain Research Bulletin. 122, 35-44 (2016).
  19. O'Collins, V. E., Donnan, G. A., Howells, D. W. History of animal models of stroke. International Journal of Stroke. 6 (1), 77-78 (2011).
  20. Ji, S., et al. Bioactive constituents of Glycyrrhiza uralensis (licorice): discovery of the effective components of a traditional herbal medicine. Journal of Natural Products. 79 (2), 281-292 (2016).
  21. Yang, R., Wang, L. Q., Yuan, B. C., Liu, Y. The pharmacological activities of licorice. Planta Medica. 81 (18), 1654-1669 (2015).
  22. Yang, R., Yuan, B. C., Ma, Y. S., Zhou, S., Liu, Y. The anti-inflammatory activity of licorice, a widely used Chinese herb. Pharmaceutical Biology. 55 (1), 5-18 (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

תמצית שורש ליקוריץניתוח נפח אוטםפרוטוקול צביעת TTCשיטת צביעת H&Eצביעת קרזיל ויולט (Cresyl Violet)פלואמטריה בלייזר דופלרחיתוך רקמת מוחמתן באמצעות זריקה פומית (Oral Gavage)
הערכת אפקטים Neuroprotective של בסיס Glycyrrhizae et Rhizoma לחלץ באמצעות מודל העכבר חסימה של עורק המוח התיכון ארעית
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.