הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

טיהור של התאים נמוך-שפע ב מערכת הראייה דרוזופילה

6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/58474

⸱

26 בספטמבר 2018

 ,  , 
1Department of Neurobiology, Harvard Medical School

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול דיסוציאציה תא לבידוד ביעילות תאים נוכח שפע נמוך בתוך מערכת הראייה דרוזופילה דרך התא פלורסצנטיות מופעל מיון (FACS).

תקציר

השיפורים האחרונים בהרגישות של רצף הדור הבא יש הקלה היישום של transcriptomic וניתוחים גנומית למספר קטן של תאים. ניצול הטכנולוגיה הזאת ללמוד פיתוח במערכת דרוזופילה חזותי, ובו שפע של כלים גנטיים ייחודיים לסוג התא, מספקת גישה רב-עוצמה למיעון הבסיס המולקולרי של פיתוח עם רזולוציה הסלולר מדויק. עבור גישה כזו להיות ריאלי, זה הכרחי יש את היכולת לשלוט בצורה אמינה ויעילה לטהר תאים נוכח שפע נמוך בתוך המוח. כאן, אנו מציגים שיטה המאפשרת טיהור יעיל של תא בודד שיבוטים בניסויים פסיפס גנטי. עם פרוטוקול זה, נוכל להגיע באופן עקבי הסלולר תשואה גבוהה לאחר טיהור באמצעות קרינה פלואורסצנטית מופעל התא מיון (FACS) (% ~ 25 תאים עם תוויות כל), בהצלחה ביצע ניתוחים transcriptomics על שיבוטים תא בודד שנוצר דרך ניתוח פסיפס עם סמן תא repressible (MARCM). פרוטוקול זה הינו אידיאלי עבור החלת transcriptomic וניתוחים גנומית לסוגי תאים מסוים ב מערכת הראייה, מעבר בשלבים שונים של פיתוח, בהקשר של שינויים גנטיים שונים.

מבוא

מערכת הראייה דרוזופילה הוא מודל מצטיינים ללמוד את הבסיס הגנטי של התפתחות והתנהגות. זה מורכב של אדריכלות הסלולר הסטראוטיפי1 ערכת כלים גנטיים מתקדמים מניפולציות תא ספציפי סוגים2,3. כוח מרכזי של מערכת זו היא היכולת לחקור באופן עצמאי את ג'ין פונקציה סוגי תאים עניין עם רזולוציה תא בודד, באמצעות פסיפס גנטי שיטות4,5. חיפשנו לשלב כלים גנטיים אלה עם התפתחויות אחרונות רצף הדור הבא כדי לבצע transcriptomic ייחודיים לסוג התא, ניתוח גנומי בתא יחיד שיבוטים בניסויים פסיפס גנטי.

כדי לעשות זאת, זה חיוני לפתח שיטה חזקה ויעילה לבודד באופן סלקטיבי תא בשפע נמוך אוכלוסיות במוח. בעבר, פיתחנו פרוטוקול עבור בידוד סוגי תאים ספציפיים ב מערכת הראייה במהלך הפיתוח הגולמי דרך FACS, וקביעת transcriptomes שלהם באמצעות ה-RNA-seq6. בניסויים אלה, הרוב המכריע של תאים מסוג מסוים (למשל photoreceptors R7) הודבקו תוויות fluorescently. באמצעות שיטה זו, בניסויים פסיפס גנטי, שבה מסומנים רק ערכת משנה של תאים מאותו סוג, נכשלנו לבודד מספיק תאים כדי להשיג איכות רצף הנתונים. כדי לטפל בבעיה זו, חיפשנו להגברת התאית על ידי שיפור בפרוטוקול דיסוציאציה התא.

הגישה שלנו היתה להקטין את האורך הכולל של פרוטוקול כדי למקסם את הבריאות של תאים הפומבית, לשפר את הבריאות התאית על ידי שינוי מאגרי לנתיחה, דיסוציאציה, להפחית את כמות הפרעה מכנית הרקמה גזור. . בדקנו את פרוטוקול משופרת7 באמצעות ניתוח פסיפס עם תא repressible סמן5 (MARCM), אשר מאפשר לדור של בודדת fluorescently המסומנות שיבוטים של סוגי לתא מסוים, פראי סוג או מוטציה עבור הגן עניין ב אחרת משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים לטוס. שם, בתנאים זהים, פרוטוקול קודמות שלנו נכשל לייצר מספיק חומר RNA-seq, פרוטוקול משופרת היה מוצלח. אנו reproducibly להשיג תשואה גבוהה הסלולר (% ~ 25 תאים עם תוויות), להשיג נתונים RNA-seq באיכות גבוהה של תאים קטנה כמו 1,0007.

מספר פרוטוקולים שתוארו קודם לכן כדי לבודד סוגי לתא מסוים דרוזופילה6,8,9,10,11,12,13 , 14 , 15 , 16. פרוטוקולים אלה נועדו בעיקר עבור בידוד תאים שנמצאים בשפע בתוך המוח. פרוטוקול שלנו ממוטבת עבור בידוד אוכלוסיות תאים בשפע נמוך (פחות מ- 100 תאי המוח) ב מערכת הראייה באמצעות FACS עבור transcriptomic הבאים וניתוחים גנומית. עם פרוטוקול זה, אנו שואפים לספק דרך reproducibly בידוד תאי שופע נמוכה של מערכת הראייה לעוף על ידי FACS וקבלת נתונים transcriptome באיכות גבוהה על ידי RNA-תת סעיף.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. תכנון לפני הניסוי

  1. לפני תחילת הניסוי, לבצע ניסוי הפיילוט בקנה מידה קטן כדי לאשר אם הגנטיקה פועלים כצפוי במיוחד לסמן את התאים הרצויים.
    1. לעבור תחילה, השתמש אימונוהיסטוכימיה, מיקרוסקופ אור כדי לקבוע אם מסומנות תאים לא רצויים. באופן אידיאלי, גנטיים יהיו ספציפיות בתוך הרשתית הראייה האונה (איור 3). רק אונות אופטיים משמשים תא דיסוציאציה, תיוג אז במוח המרכזית אינה מהווה בעיה. במקביל, לקבוע כמה תאים עניין מסומנות לפי המוח.
    2. אם תוויות גנטי יש יחודיות הרצוי, לבצע ניסוי FACS פיילוט (איור 4) כדי לקבוע אם אוכלוסיית תאים ניתן לבודד reproducibly, גם כדי להעריך כמה תאים עניין ניתן לבודד כל מהמוח. אם יש צורך, להעריך את הטוהר של תאים בודדים באמצעות PCR כמותי כדי לקבוע את העשרת או דה-העשרה של גנים ספציפיים.
  2. לקבוע את מספר צלבים צריכה להשיג את הכמות הרצויה של חומר עבור הניסוי.
    הערה: בהתבסס על ניסיון ניסיוני, ~ 17 – 25% של תאים fluorescently עם תוויות באופן עקבי מבודד עם פרוטוקול זה הינם באיכות גבוהה RNA-רצף נתונים מתקבלים מן כמה כתאי FACS מטוהרים 1,000 (פחות תאים עשוי להיות מספיק).
    1. כדי לקבל 1,000 תאים עבור ניתוחים RNA-seq, ודא כי ישנם תאים לפחות 40 עניין fluorescently תווית לכל המוח (20 תאים לכל האונה אופטיים). בסביבות 10 ~ תאים עניין מומלץ לטהר לכל המוח, לנתח אז המוח 100.
    2. כדי להשיג זבובים ~ 100 בשלב המתאים של פיתוח לנתח ניסוי, השתמש צלבים ~ 100 אם בחירת נגד כוחות מאזנים (זה ישתנה בהתאם אחרים של ההורים). אם זבובי homozygous עבור אללים/transgenes של עניין ניתן להגדיר צלבים פחות.
    3. להגביל את החלון לנתיחה h 1 כדי למקסם את הסלולר הבריאות ולצמצם את שינויים שאינם ספציפיים ביטוי גנים, ארגון הגנום יכול להתרחש לאחר המוח הם גזור, אבל זה יכול להיות מותאם. לקבוע את מספר dissectors נדרש לנתח מוחות 100 ב- h 1, אשר תלוי במיומנות של dissectors.

2. לטוס לעבוד

הערה: זבובים מגודלים 25 ° c עם לחות ~ 50% אלא אם נכתב אחרת. להלן גנוטיפ של נקבות מסומן בתור גנוטיפ F, וכי של זכרים גנוטיפ מ'.

  1. הרחבת מניות
    1. להשיג ~ 100 צלוחיות של זבובים צעירים (לא יותר מאשר בשבוע הישן עם גנוטיפ F) ~ 30 בקבוקונים של גנוטיפ מ'.
    2. ביום חמישי של השבוע 1, להעיף 100 צלוחיות של גנוטיפ F על מזון טרי. החל ביום שישי, להעיף את הבקבוקונים בכל יום ביום שני של השבוע 2. אלה סלטות 6 ישמש כדי לאסוף את בתולות. גם ביום רביעי השבוע 2, להעיף זבובים של גנוטיפ מ' על מזון טרי, לנקות את ההורים ביום שישי 2 בשבוע. את שתי המבחנות ישמש כדי לאסוף את הזכרים על הצלבים.
  2. איסוף בתולות
    1. מיום שני השבוע 3, לאסוף בתולות הבקבוקונים גנוטיפ F. 2 - 3 פעמים ביום לאסוף ולאחסן הבתולות-18 ° C ~ 50% לחות. חזור על פעולה זו בכל יום דרך יום שלישי בשבוע 4. מומלץ לאסוף בתולות רבים ככל האפשר, כיוון שרבים מהם למות לפני חוצה מוגדרים. בדרך כלל, ~ 2,500 בתולות צריך להיות שנאספו כדי להגדיר 100 חוצה.
  3. הגדרת צלבים
    1. ביום שישי בשבוע 4, להגדיר המספרים הרצויים צלבים (בדרך כלל 200-100 צלבים לכל ניסוי) עם בתולות 15 של גנוטיפ F וזכרים 7 של גנוטיפ M עבור כל צלב. חשוב מאוד להשתמש זכרים צעירים ובריאים עם כנפיים ללא פגע.
    2. הפוך חוצה כל יום מיום ראשון עד יום שבת בשבוע 5. תוספת חוצה עם בתולות טריים או זכרים אם נמצאו זבובים מתים. זה חיוני כדי למנוע את האוכל מתייבשת, אז מים הבקבוקונים כנדרש. מזון יבש יקטן באופן משמעותי את התשואה.
  4. בקרה שלילית FACS למיון
    1. לכלול פקד שלילי ללא התאים הרצויים להיותו שכותרתו FACS למיון. באופן אידיאלי, הפקד שלילי צריך הכתב (למשל UAS-GFP) אבל לא הנהג (למשל GAL4), כך ביטוי הבזליים של הכתב (UAS-בונה יכולה להיות "דולף") יכול להיקבע לקביעת מתאימה gating FACS למיון. הפוך את הזבובים עבור הפקד שלילי בו זמנית עם הזבובים ניסיוני, שלב אותם באותו אופן.
  5. הגלמים הזמני
    1. כדי לאסוף תאים בשלב מסוים של התפתחות הגולמי (למשל h 40 לאחר היווצרות puparium [h APF]), הבמה הגלמים בחלון הזמן 1 h כדי להתאים עם תקופת 1 h המוקצב והניתוחים (שנדונו לעיל). FACS צריכה להתבצע ישירות לאחר תא דיסוציאציה, אשר מתרחשת לאחר ניתוח ולוקח ~ 40 דקות. לכן, הזמן המדויק של היערכות, והניתוחים נקבעת לפי זמינות FACS.
    2. כדי להשיג הגלמים ב 40 h APF, שלב ביום שני של השבוע 6 בנקודת זמן מסוימת (למשל, 5 pm) לנתח הגלמים 40 h מאוחר יותר (למשל, 9 בבוקר ביום רביעי). להשתמש במברשת רטובה בעדינות לבחור לבן הגלמים קדם ולמקם אותם על הקיר, בקבוקונים ומחוממת מראש. רק לבחור את הגלמים עם גנוטיפ הרצוי.
  6. משכפל ביולוגי
    1. האם משכפל ביולוגית לפחות 3 עבור ניסוי. כדרך פשוטה, חזור על הניסוי שלוש פעמים באותו השבוע (שבוע 6) באמצעות חוצה אותו. לדוגמה, שלב הגלמים עבור השני והשלישי משכפל בימים שלישי ורביעי, בהתאמה. לנתח את הגלמים האלה בימים חמישי ושישי, בהתאמה.

3. הכנת הדוגמא

הערה: כל ריאגנטים בשימוש פרוטוקול זה מפורטים בטבלה של חומרים.

  1. להתכונן פתרונות והניתוחים, רקמות דיסוציאציה
    1. להכין את האנזים הפרוטאוליטי תערובת הפתרון מניות (ראה טבלה של חומרים) על ידי לשחזר את האנזים lyophilized עם ddH2O לריכוז של Wünsch 26 יחידות (Wu) / mL. בשביל בקבוקון המכיל 260 וו (בקבוקון גדולים), להוסיף 10 מ של ddH2O למבחנה ובצע את aliquots חד-פעמיים (4.2 µL נדרשים לכל דיסוציאציה). פתרון מלאי החנות ב-20 ° C. ניסוי מחייב דיסוציאציה של שני מדגמים (שליטה שלילי ורקמות ניסויית).
    2. הכינו 10 x של Rinaldini פתרון (RS) ולא מדיה (CSM של שניידר מלאה) יום לפני הקרע (שני של שבוע 6). להכין 5 מיליליטר CSM עבור כל בניתוח ולאחר כ- 5 מ ל 1 x ר' ו- 5 מיליליטר CSM על דיסוציאציה של דגימות 2 (שלילית שליטה וניסויים). אחסן את ר' 10 x-4 מעלות צלזיוס במשך עד חודש, ואת CSM ב 4 מעלות צלזיוס במשך שבוע.
      1. כדי להכין 100 מ של 10 x ר', להמיס 8 גרם של NaCl, 200 מ ג אשלגן כלורי, 50 מ"ג של2PO NaH4, 1 g של NaHCO3 ו 1 גר' גלוקוז ב- 100 מ של ddH2O גביע 250 מ. מסנן לחטא עם מסנן 0.22 מ מ.
      2. הוסף 20 מ ג L-גלוטתיון 1 מ"ל של ddH2O microtube.
      3. כדי להכין 50 מ של CSM, הוסף 5 מ של חום להשבית סרום שור, 0.1 מ"ל של 10 מ"ג/מ"ל אינסולין פתרון, 5 מ ל-200 מ מגלוטמין פתרון, μL 12.5 של 20 מ"ג/מ"ל L-גלוטתיון, 1 מ"ל של פתרון פניצילין-סטרפטומיצין (5,000 יחידות של פניצילין, 5 מ"ג של סטרפטומיצין / mL) מ ל 38.9 של המדיה של שניידר. מסנן לחטא עם מסנן 0.22 מ מ.
      4. לדלל עם ddH2O לעשות 1 x ר' הפתרון עובד 10 x ר'. להכין μL 500 של ר' x 1 ללא דבק microtubes עבור כל דגימה.
    3. הפעל באמבט מים ולהגדיר את הטמפרטורה ב 37 º C. ודא כי הטמפרטורה היא מדויקת באמצעות מד חום. לאמבט מים חייב להיות בטמפרטורה הנכונה לפני הפעלת פפאין. מומלץ לקבוע את הטמפרטורה ערב קודם ניתוח בוקר.
  2. הכינו פפאין ואת האנזים הפרוטאוליטי להתמזג
    הערה: ודא פפאין פתרון טריים לפני כל דיסוציאציה.
    1. ביום שלישי של שבוע 6 בערך 45 דקות לפני שמתחילים את והניתוחים, לאחזר את מבחנה 1 של אבקת פפאין מ- 4 ° C, דגירה בטמפרטורת החדר. גם להפריש CSM בצינור גלאים בטמפרטורת החדר מאוחר יותר להוסיף האבקה פפאין.
    2. דקות לפני תחילת יחליט להשתמש מזרק כדי להוסיף את טמפרטורת החדר CSM בקבוקון פפאין (ישירות דרך הכיפה) כך הריכוז הוא 100 יחידות/mL (כמות האבקה ב כל בקבוקון שונה במקצת; בשביל בקבוקון המכיל 123 יחידות להוסיף 1.23 מ' L של CSM). לערבב, תחילה להפוך את הצנצנת כדי ללכוד אבקה תקוע בצד הפנימי של הכיפה ולאחר מכן פיפטה למעלה ולמטה.
    3. הוסף את המבחנה גביע המכילה 37 מעלות צלזיוס המים באמבט מים. ודא שבקבוקון פפאין פתרון לא צף. להפעיל את פפאין למשך 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.
    4. לאחר הוספת פפאין את גביע באמבט מים, לאחזר aliquot מתערובת האנזים הפרוטאוליטי (26 וו/mL) מ-20 ° C, דגירה זה בטמפרטורת החדר. לאחר 30 דקות של הפעלת, דגירה של פפאין בטמפרטורת החדר.
  3. ניתוח
    1. ביום שלישי בשבוע 6, לנתח את המוח הגולמי בשלבים תוך קר CSM עם מלקחיים נקי ולנתק את האונות הראייה על ידי צובט בצומת של האונה הראייה והמוח המרכזית.
    2. הוסף האונות לתחתית microtube המכילה 500 μL של ר' x 1 (אחד microtube של הרקמה ניסיוני) ואחד עבור הרקמה שליטה שלילי. שמור תמיד את הצינורות על קרח.
    3. לנתח אונות רבים ככל האפשר 1 h. הרקמה שליטה שלילי, הם מספיק 10 אונות. בריכת ביתר אופטיים אונות microtube יחיד כדי למנוע איבוד רקמות במהלך העברה בין microtubes.
  4. דיסוציאציה תא
    1. הסר בזהירות את ר' 1 x מ microtube עם ביתור אונות הראייה באמצעות פיפטה P200, משאיר מספיק כדי לכסות את האונות. להוסיף בזהירות 500 μL של 1 x ר' לצד של הרכבת התחתית, כדי להפריע את המוח כמה שפחות. שמור תמיד את הצינורית על קרח.
    2. תן האונות ליישב את העניין. רק פעם אחת, לקחת את 200 μL, פיפטה החוצה כדי לערבב (אונות תנוע). תן האונות ליישב שוב.
    3. עבור שני מדגמים (בקרה ניסויית ושליליים), aliquot 600 μL של הפעלת בטמפרטורת החדר פפאין לתוך microtube. הוסף μL 4.2 מתערובת האנזים הפרוטאוליטי בטמפרטורת החדר בתוך תמיסת פפאין μL 600 בריכוז הסופי של וו 0.18/mL. מערבבים על-ידי pipetting למעלה ולמטה. זהו הפתרון דיסוציאציה.
    4. בזהירות להסיר את ר' 1 x כל מדגם ולהוסיף 300 μL של דיסוציאציה פתרון האונות. דגירה בדגימות 25 ° c, 1,000 סל ד למשך 15 דקות thermomixer microtube.
    5. 5 ו- 10 דקות זמן נקודות, להפסיק את thermomixer ולתת האונות לשקוע לתחתית microtube. לקחת את μL 200 של פתרון, pipet החוצה כדי לערבב.
    6. לאחר 15 דקות, תן האונות ליישב את העניין, הסר בזהירות את הפתרון דיסוציאציה בין האונות (try שלא להפריע האונות).
    7. לשטוף פעמיים עם 1 x ר'. כדי לעשות זאת, בזהירות להוסיף 500 μL 1 x ר' (try שלא להפריע האונות). כדי לערבב בעדינות pipet למעלה 200 μL, pipet ואז לצאת אל microtube. תן האונות שקעו וחזור.
    8. לשטוף כל מדגם פעמיים עם 500 μL של CSM (כמו בשלב הקודם).
    9. בזהירות להסיר את CSM ולהוסיף עוד 200 μL של CSM ברכבת התחתית. באמצעות פיפטה P200, לשבש את הרקמה על ידי pipetting למעלה ולמטה בלי קצף, עד הפתרון הוא הומוגני (קרי, אין עוד באפשרותך לראות כל שרידים של רקמות).
    10. לסנן התליה תא באמצעות כובע רשת 30 μm לתוך צינור 5 מ"ל FACS על קרח (תשתמש P200, ותוודא המתלה כולו עובר). להוסיף עוד 500 μL של CSM לשטוף את microtube דיסוציאציה, לסנן את הפתרון לתוך הצינור FACS.
    11. בזהירות. תוריד את הכובע של הצינור FACS, לאסוף את הפתרון מתחת מסנן רשת עם P200 והוסף אותו לשאר חלקי המתלה בצינור FACS. הדגימות מוכנים FACS.
    12. ודאו שיש לכם microtubes לאיסוף תאים FACS מטוהרים מוכן מראש. עבור ה-RNA-seq, למיין תאים כל מדגם ישירות לתוך microtubes המכיל 300 μL מאגר RLT (פירוק מאגר) מתוך ערכת טיהור RNA (להוסיף בטחונות 2–Mercaptoethanol לפני השימוש).
  5. FACS מיון
    הערה: לאחר דיסוציאציה, למיין מיד את התאים על ידי FACS (מקסימום 1h). ודא ספר FACS להפעלות בהתאם בעת תכנון לניסוי. סדרן התא עם גודל החרירים של 100 μm משמשת בדרך כלל.
    1. להשוות את התפלגות התא הפקד שלילי, המדגם ניסיוני כדי להגדיר את gating עבור המיון. באופן אידיאלי, לבסס את דרך השער פיילוט FACS, המדגם שליטה שלילי יספקו אישור או כוונון עדין של gating הוקמה מראש. התאים עניין להפרידם היטב את התאים הרקע הקיימים הפקד שלילי והן המדגם ניסיוני (איור 4) (זה מבחן בניסויים פיילוט).
    2. איסוף התאים מיון הצינורות אוסף מוכן.
  6. RNA טיהור
    1. לאחר מיון התאים ישירות לתוך μL 300 RLT מאגר, pipet למעלה ולמטה כדי lyse התאים.
    2. לטהר RNA בעקבות הפרוטוקול הסטנדרטי של טיהור של RNA הכולל מן החי, תאים אנושיים באמצעות הטיהור קיט (ראה טבלה של חומרים) עם עיכול הדנ א-טור7. Elute את הרנ א ב μL 20 RNase ללא מים.
    3. להקפיא את הדגימות RNA עם חנקן נוזלי, חנות ב-80 מעלות צלזיוס.
    4. עבור ניסוי לבצע משכפל לפחות 3 עבור פקד ותנאים ניסיוני. להתכונן ספריות cDNA של כל הדגימות במקביל ולהפעיל כל הדגימות באותו התא זרימה כדי לשלוט על השתנות טכני. לאחר כל הדגימות RNA מוכנים להשתמש vac מהירות כדי להקטין את עוצמת הקול כדי μL 2-5 (כל דגימה).

4. הכנת cDNA ספריות וסדר על ידי חכמים-seq2

הערה: כדי למזער את השתנות טכני, להפוך את כל ספריות cDNA באותו זמן, אותן ברצף על זרימה באותו התא.

  1. השתמש קלט של 1.5 μL של RNA מרוכז כדי להפוך ספריות cDNA לפי הפרוטוקול הסטנדרטי עבור החכם-seq217 למעט השינויים הבאים: שימוש מאסטר אחר של ה-PCR אמינות גבוהה לערבב (ראה טבלה של חומרים) עבור ה-PCR הגברה; השתמש של טיהור PCR על עמודות קיט (ראה טבלה של חומרים) במקום beads מגנטי לטהר את מוצרי ה-PCR.
  2. פרוטוקול חכם-seq2 כולל שלב קדם הגברה PCR לאחר שעתוק במהופך, כמו גם צעד PCR העשרה הסופי לאחר tagmentation. מספר מחזורים ב- PCR הגברה תלוי השפע של חומר קלט. עם תאי 1,000 כקלט, משתמשים בדרך כלל 15 מחזורים בשלב קדם הגברה PCR ו- 12 מחזורים עבור השלב ה-PCR העשרה הסופי.
  3. מאגר של הספריות, אותן ברצף על תא בודד זרימה (למשל, פלטפורמת NextSeq).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הערכה כללית
ערכה הכללית של הפרוטוקול מוצג באיור1. הפרוטוקול מחולק לשלושה חלקים מרכזיים: לטוס בעבודה, הכנת הדוגמא, רצף של ניתוח נתונים. הפעלת "תכנון לפני הניסוי" של הפרוטוקול אינו כולל את הערכה כללית של פשטות.

ציר הזמן
לוח שנה של החלקים העיקריים של הפרוטוקול (עבודה לעוף, הכנת הדוגמא) מוצג באיור2.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול זה הוא פשוט לא טכנית קשה לביצוע, אבל יש מפתח מספר צעדים זה אם מתעלמים מהם רצון לגרום לירידה ניכרת התשואה הסלולר. (שלב 2.3.2.) זה הכרחי כי צלבים הם בריאים, כי האוכל לא יתייבש. השקיה של צלבים חיוני כדי למקסם את מספר זבובים זמין עבור ניתוח של גנוטיפ נכון את, בשלב הנכון של פיתוח. באיזו תדירות צלבים צורך להיות להשקות ישתנו בהתאם האוכל ותנאי הדיור של הזבובים. כדי להבטיח צלבים לא להתייבש, לבחון את הבקבוקונים פעמיים ביום ומוסיפים מים בהתאם. (שלב 3.3.) חשוב גם אספנו את המוח ביתור לתוך microtube יחיד שישמש עבור הדיסוציאצי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

תודות

מחקר זה מומן על ידי NINDS של מכוני הבריאות הלאומיים תחת מספר פרס K01NS094545, andgrants מן המרכז לפלר עבור המחקר של הפרעות ניווניות. אנו להכיר לימינג טאן ו ג'ייסון מקיואן לשיחות יקרי ערך.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Liberase TMRoche5401127001תערובת אנזימים פרוטאוליטיים
NaClSigma-AldrichS3014
KClSigma-AldrichP9541
NaH2PO4Sigma-AldrichS9638
NaHCO3Sigma-Aldrich  S5761
גלוקוזסיגמא-אולדריץ'G0350500
L-גלוטתיוןסיגמא-אולדריץ'G6013
סרום בקר מומת בחוםסיגמא-אולדריץ'F4135
תמיסת אינסוליןסיגמא-אולדריץ'I0516
L-גלוטמיןסיגמא-אולדריץ'G7513
פניצילין-סטרפטומיצין פתרוןסיגמא-אולדריץ'P4458
מדיום תרבית שניידרGibco21720024
פפאיןוורת'ינגטוןLK003178
2-מרקפטואתנול Sigma-AldrichM6250-100ML
RNeasy Micro KitQiagen74004ערכת טיהור RNA
ללא RNase DNaseQiagen79254
SuperScript II Reverse TranscriptaseLife Technologies18064-014
dNTP MixLife TechnologiesR0191
MgCl2 פתרוןסיגמא-אולדריץ'M1028-10X1ML
תמיסת בטאיןסיגמא-אולדריץ'B0300-1VL
RNaseOUTLife Technologies10777-019
Q5 נאמנות גבוהה 2x מאסטר מיקסניו אינגלנד BiolabsM0492S
ערכת טיהור PCR MinEluteQiagen28004
Nextera XT ערכת הכנה לספרייתDNA IlluminaFC-131-1024
ערכת אינדקס Nextera XTIlluminaFC-131-1001
מבחנה עם מסננת תאים מכסה הצמדFalcon352235
מערכות מסנן ואקום בקבוקקורנינגCLS431153
ThermoMixer F1.5Eppendorf5384000020
FACSAria Flow CytometerBD Biosciences656700
מערכת ריצוף HiSeq 2500IlluminaSY– 401– 2501

מקורות

  1. Fischbach, K. -F., Dittrich, A. P. M. The optic lobe of Drosophila melanogaster. I. A Golgi analysis of wild-type structure. Cell and Tissue Research. 258, 441-475 (1989).
  2. Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (28), 9715-9720 (2008).
  3. Jenett, A., et al. A GAL4-driver line resource for Drosophila neurobiology. Cell Rep. 2 (4), 991-1001 (2012).
  4. Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
  5. Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
  6. Tan, L., et al. Ig Superfamily ligand and receptor pairs expressed in synaptic partners in drosophila. Cell. 163 (7), 1756-1769 (2015).
  7. Peng, J., et al. Drosophila Fezf coordinates laminar-specific connectivity through cell-intrinsic and cell-extrinsic mechanisms. Elife. 7, (2018).
  8. Krasnow, M. A., Cumberledge, S., Manning, G., Herzenberg, L. A., Nolan, G. P. Whole animal cell sorting of Drosophila embryos. Science. 251 (4989), 81-85 (1991).
  9. Cumberledge, S., Krasnow, M. A. Preparation and analysis of pure cell populations from Drosophila. Methods in Cell Biology. 44, 143-159 (1994).
  10. Bryant, Z., et al. Characterization of differentially expressed genes in purified Drosophila follicle cells: toward a general strategy for cell type-specific developmental analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (10), 5559-5564 (1999).
  11. Neufeld, T. P., de la Cruz, A. F., Johnston, L. A., Edgar, B. A. Coordination of growth and cell division in the Drosophila wing. Cell. 93 (7), 1183-1193 (1998).
  12. Calvi, B. R., Lilly, M. A. Fluorescent BrdU labeling and nuclear flow sorting of the Drosophila ovary. Methods in Molecular Biology. , 203-213 (2004).
  13. Tirouvanziam, R., Davidson, C. J., Lipsick, J. S., Herzenberg, L. A. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) of Drosophila hemocytes reveals important functional similarities to mammalian leukocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (9), 2912-2917 (2004).
  14. Bryantsev, A. L., Cripps, R. M. Purification of cardiac cells from Drosophila embryos. Methods. 56 (1), 44-49 (2012).
  15. Harzer, H., Berger, C., Conder, R., Schmauss, G., Knoblich, J. A. FACS purification of Drosophila larval neuroblasts for next-generation sequencing. Nature Protocols. 8 (6), 1088-1099 (2013).
  16. Khan, S. J., Abidi, S. N., Tian, Y., Skinner, A., Smith-Bolton, R. K. A rapid, gentle and scalable method for dissociation and fluorescent sorting of imaginal disc cells for mRNA sequencing. Fly (Austin). 10 (2), 73-80 (2016).
  17. Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
  18. Nern, A., Zhu, Y., Zipursky, S. L. Local N-cadherin interactions mediate distinct steps in the targeting of lamina neurons. Neuron. 58 (1), 34-41 (2008).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

טיהור תאיםמיון תאים מופעל פלואורסצנציהשיבוטים של תא בודדניסויי פסיפס גנטיאנליזה טרנסקריפטומיתפירוק באמצעות פאפאיןדיסקציה של האונה האופטיתמיקרוסקופיה קונפוקליתטכניקת MARCM
טיהור של התאים נמוך-שפע ב מערכת הראייה דרוזופילה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.