מאמר שיטה

ניתוח של β-עמילואיד-induced הפרעות על מבנה קריש פיברין על ידי ספקטרוסקופיה וסריקת מיקרוסקופ אלקטרונים

DOI:

10.3791/58475

⸱

30 בנובמבר 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Patricia and John Rosenwald Laboratory of Neurobiology and Genetics, Rockefeller University, 2Electron Microscopy Resource Center, Rockefeller University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

להלן מוצגות שתי שיטות שבהן ניתן להשתמש בנפרד או במשולב כדי לנתח את השפעת בטא עמילואיד על מבנה קריש פיברין. כלול הוא פרוטוקול עבור יצירה של במבחנה clot פיברין, ואחריו קריש עכירות ואלקטרון סריקה שיטות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מציג שיטות ליצירת קרישי פיברין ב חוץ גופית ו ניתוח ההשפעה של חלבון (Aβ) בטא עמילואיד על היווצרות קרישי ומבנה באמצעות ספקטרומטר וסריקה מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM). Aβ, המהווה אגרגטים עמילואיד העצבים של מחלת אלצהיימר (AD), הוכח לקיים אינטראקציה עם פיברינוגן. אינטראקציה זו Aβ-פיברינוגן הופך קריש פיברין חריגות מבנית ועמיד בפני ופיברינוליזה. Aβ-induced העיוותים פיברין קרישת עשוי גם לתרום היבטים כשאבדן של פתולוגיה לספירה כגון microinfarcts, דלקת, וכן, angiopathy עמילואיד במוח (סי). בהתחשב בתפקיד הגירעונות נוירו-וסקולריים שעשוי להיות קריטי בפתולוגיה לספירה, פיתוח תרכובות אשר יכול לעכב או להפחית את האינטראקציה Aβ-פיברינוגן יש ערך טיפולי מבטיח. במבחנה שיטות מאת אילו פיברין היווצרות קריש דם יכול בקלות ובאופן שיטתי להידרש הן כלים שימושיים פוטנציאל לפיתוח תרכובות טיפולית. המוצג כאן הוא פרוטוקול אופטימיזציה עבור הדור במבחנה של קריש פיברין, כמו גם ניתוח ההשפעה של מעכבי האינטראקציה Aβ ו- Aβ-פיברינוגן. וזמינותו עכירות קריש דם מהירה, לשחזור מאוד והוא יכול לשמש כדי לבדוק תנאים מרובים בו זמנית, המאפשר הקרנת הסרט מספר גדול של מעכבי Aβ-פיברינוגן. תרכובות פגע ההקרנה הזאת ניתן להעריך עוד יותר בשל יכולתן דהוא Aβ-induced מומים מבניים של האדריכלות קריש פיברין תוך שימוש ב- SEM. היעילות של פרוטוקולים ממוטבת אלה הפגינו כאן באמצעות TDI-2760, מעכב האינטראקציה Aβ-פיברינוגן שזוהו לאחרונה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחלת אלצהיימר (AD), מחלת ניוון עצבי מוביל לירידה קוגניטיבית בחולים קשישים, יוכפל לאחר המרתו נובע חריג בטא עמילואיד (Aβ), צבירת וביטוי סיווג לקוי וכתוצאה מכך neurotoxicity1, 2. למרות האגודה מאופיין היטב בין Aβ אגרגטים לספירה3, המנגנונים מדויק המחלה פתולוגיה אינם מובנים היטב4. הוכחה גוברת מרמז כי הגירעונות נוירו-וסקולריים לשחק תפקיד התקדמות וחומרת של המודעה5, כפי Aβ ישירות אינטראקציה עם הרכיבים של מערכת הדם6. Aβ יש אינטראקציה גבוהה-זיקה עם פיברינוגן7,8, אשר רגישה גם על פיקדונות Aβ חולי אלצהיימר והן העכבר מודלים9,10,11. יתר על כן, האינטראקציה Aβ-פיברינוגן גורם היווצרות חריגה של clot פיברין, מבנה, כמו גם התנגדות ופיברינוליזה9,12. אפשרות טיפולית אחת בטיפול לספירה, היא שיכוך גירעונות הדם על ידי עיכוב האינטראקציה בין13,Aβ, פיברינוגן14. לכן, זיהינו מספר תרכובות קטן מעכבות את האינטראקציה Aβ-פיברינוגן באמצעות הקרנה תפוקה גבוהה וכימיה מרפא גישות13,14. כדי לבדוק את היעילות של מעכבי האינטראקציה Aβ-פיברינוגן, אנחנו ממוטב שתי שיטות לניתוח של במבחנה היווצרות קרישי פיברין: ייקרש עכירות assay וסריקה מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM)14.

קריש דם עכירות וזמינותו היא שיטה ישר קדימה ומהירה לניטור היווצרות קרישי פיברין באמצעות ספקטרוסקופית UV-גלוי. כמו קריש פיברין טפסים, תאורה מפוזרת יותר ויותר ומגביר עכירות של הפתרון. לעומת זאת, כאשר Aβ קיים, המבנה של קריש פיברין היא שונה, עכירות של התערובת מצטמצם (איור 1). יכול להיות שקובעת את ההשפעה של תרכובות מעכבות היכולת לשחזר עכירות קריש דם Aβ-induced הפרעות. בעוד וזמינותו עכירות מאפשר לניתוח מהיר של תנאים מרובים, הוא מספק מידע מוגבל על צורתו קריש דם. SEM, שבו לטופוגרפיה של חפצים מוצקים מתגלה על ידי אלקטרון הגישוש, מאפשר הניתוח של הארכיטקטורה תלת-ממד של17,18 16,15,קריש דם, את ההערכה של איך הנוכחות של Aβ, תרכובות מעכבות/או משנה את מבנה9,14. הן ספקטרומטר SEM הם וטכניקות מעבדה קלאסית כי שימשו למטרות שונות, לדוגמה, ספקטרופוטומטר משמש לניטור צבירת עמילואיד19,20. באופן דומה, SEM משמש גם כדי לנתח clot פיברין נוצר הפלזמה של אלצהיימר, פרקינסון, שבץ תרומבואמבוליים חולים21,22,23. הפרוטוקולים המובאים כאן הם אופטימיזציה עבור הערכת היווצרות קרישי פיברין בצורה מהירה הדירים.

פרוטוקול הבאים מספק את ההוראות להכנת במבחנה -clot פיברין עם ובלי Aβ. זה גם מפרט את שיטות כדי לנתח את השפעת Aβ על היווצרות קרישי פיברין ומבנה. היעילות של שתי השיטות למדידת עיכוב של האינטראקציה Aβ-פיברינוגן הוכח באמצעות TDI-2760, מתחם מעכבות14קטן. שיטות אלו, הן כיחידים והן יחד, מאפשרים ניתוח מהירה וישירה של במבחנה היווצרות קרישי פיברין.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת Aβ42, פיברינוגן לניתוח

  1. להכין Aβ42 monomeric של אבקת lyophilized
    1. לחמם Aβ42 אבקת בטמפרטורת החדר, ספין למטה ב g x 1,500 ל 30 s.
    2. הוספת µL 100 של קרח hexafluoroisopropanol (HFIP) לפי 0.5 מ ג של אבקת Aβ42, תקופת דגירה של 30 דקות על קרח.
      התראה: נקוט משנה זהירות בעת טיפול HFIP ולבצע כל השלבים בשכונה כימי.
    3. להכין 20 µL aliquots ולתת שלאוויר סרטים יבש בשכונה כימי לסרטים 2-3 ח' שניתן לאחסן ב-20 ° C.
    4. לשקם Aβ42 monomeric, בסרט µL 10 של טרי דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) על ידי עצבנות ב sonicator אמבטיה 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    5. הוסף µL 190 מ מ 50 טריס (hydroxymethyl) aminomethane (טריס) מאגר (pH 7.4), פיפטה למעלה ולמטה בעדינות.
    6. הסר את אגרגטים חלבון על ידי צנטריפוגה ב g x 20,817 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
    7. דגירה של תגובת שיקוע ב 4 ° C עבור לילה ויום הבא צנטריפוגה הפתרון ב g 20,817 x ב 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות כדי למחוק נוספות אגרגטים חלבון.
    8. למדוד ריכוז Aβ42 על ידי bicinchoninic חומצה (BCA) וזמינותו. טורי שתדללו טהור שור אלבומין (BSA) של 1 מ"ג/מ"ל כדי 0.0625 mg/mL כדי לייצר תקן חלבון, להוסיף 10 µL ברמה כל הבארות של צלחת רב גם כן. לדלל דגימות Aβ 1:4 ולהוסיף 10 µL הבארות דולר. לערבב BCA פתרונות A ו- B, להוסיף 200 µL כל טוב. תקופת דגירה של 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ולקרוא על קורא צלחת במלון-562 ננומטר. לשמור את הפתרון Aβ שנותרו על קרח, להשתמש בתכשיר עכירות assay, ב- SEM.
  2. להכין פתרון פיברינוגן
    1. למדוד 20 מ ג של אבקת פיברינוגן lyophilized לתוך צינור 15 מ"ל והשהה מחדש עם מראש ומחוממת 2 מ"ל 20 מ מ hydroxyethylpiperazine אתאן חומצה sulfonic (HEPES) מאגר (pH 7.4).
    2. דגירה באמבט מים 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    3. לסנן פתרון דרך מסנן מזרק 0.2 µm ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. להוציא את הפתרון של 4 ° C ו מסנן שוב דרך מסנן מזרק מיקרומטר 0.1 להוציא אגרגטים פיברינוגן או קיימים פיברין.
    4. מודדים את ריכוז פיברינוגן מאת BCA וזמינותו. בצע את ההוראות מ שלב 1.1.8. לשמור על הפתרון פיברינוגן הנותרים 4 ° C, להשתמש בתכשיר עכירות assay, ב- SEM.

2. קריש הדם עכירות Assay

  1. כדי מכל קידוח ניסיוני של צלחת 96-ובכן, להוסיף µL 20 30 מיקרומטר Aβ42 פתרון משלב 1.1.8 כך הריכוז הסופי שלו היא מיקרומטר 3.0 ב- 200 µL של המאגר. להוסיף באותו אמצעי אחסון של 5% דימתיל סולפוקסיד במאגר טריס 50 מ מ (pH 7.4) למתן בארות שליטה בצלחת 96-ובכן.
    הערה: הנפח המדוייק של Aβ42 בשלב זה אינו חשוב. על ההכנות ריכוז נמוך, שמשמשים אמצעי אחסון גבוהה יותר, ניתן לכוונן את עוצמת הקול של המאגר היווצרות קריש דם. עוצמת הקול הסופי צריכים להישאר 200 µL.
  2. אם בדיקות תרכובות מעכבות, לדלל את המתחם לריכוז עבודה כמו דימתיל סולפוקסיד. הוספת תרכובת או דימתיל סולפוקסיד לבד עבור פקד לבארות עם Aβ42, לערבב היטב.
    הערה: פתרון Aβ42 צריך טופס droplet דיסקרטית בתחתית הבאר, המתחם או דימתיל סולפוקסיד צריך להיות pipetted ישירות אל מרכז ה-droplet.
  3. לדלל את הפתרון מניות של פיברינוגן מהשלב 1.2.4 במאגר היווצרות קריש דם (20 מ מ HEPES מאגר (pH 7.4), 5 מ מ CaCl2ו- 137 מ מ NaCl) ולהוסיף אותו Aβ42 בארות המכיל ושליטה של צלחת 96-ובכן. לכוון את עוצמת הקול של הפתרון פיברינוגן כך הריכוז הסופי שלו הופכת מיקרומטר 1.5 בכרך סה כ 200 µL התגובה. Pipette הפתרון לאט ולהימנע ויוצרים בועות. דגירה את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לוחץ על פלטפורמה מסתובבת.
    הערה: הנפח של פיברינוגן פתרון עשוי להשתנות בהתאם ריכוז המניות שלה, אך הנפח הכולל בכל אחד מהם צריך להיות µL 170 בזמן הדגירה.
  4. להכין תרומבין פתרון על ידי המסת אבקה תרומבין מסחרית מטוהרים ddH2O לעשות פתרון מניות של 50 U/mL. לדלל לפתרון עבודה U/mL 5 במאגר HEPES 20 מ מ (pH 7.4) ישירות לפני השימוש.
  5. לאחר 30 דקות של דגירה, במקביל להוסיף 30 µL של תרומבין פתרון (5 U/mL) לתוך פתרונות פיברינוגן בצלחת 96-ובכן מ- 2.3 שלב באמצעות פיפטה רב-ערוצי. תוספת של תרומבין תיזום מיד היווצרות קריש דם. לכן, מוסיפים תרומבין ישירות למרכז של הפתרון פיברינוגן בזהירות כדי למנוע יצירת בועות.
    הערה: הפעילות של תרומבין יכול להשתנות בין התנאים ניסיוני, כמו גם הרבה תרומבין. הריכוז הנכון הנדרש כדי לייצר robustly קרישי ייתכן שיקבע מדעית.
  6. קרא את ספיגת של הקריש במבחנה על קורא צלחת מיד לאחר התוספת תרומבין. למדוד את ספיגת-350 nm במשך 10 דקות, כל 30-60 ס' לבצע הבדיקה כולה בטמפרטורת החדר.
    הערה: תרכובות מסוימות מעכב עשוי לשנות את ספיגת פתרון-350 nm, שבו ניתן למדוד במקרה עכירות-405 ננומטר.

3. מיקרוסקופ אלקטרונים סורק

  1. הכנה של קריש דם, קיבוע, כביסה
    1. המקום נקי siliconized זכוכית מעגל כיסוי שקופיות (12 מ"מ) לתוך צלחת. ובכן 12 או 24-ובכן באמצעות מלקחיים.
    2. להכין פיברינוגן במאגר היווצרות קריש דם. ראה פרוטוקול שלב 1.2 לפרטים.
    3. כדי להעריך את ההשפעה של מעכבי האינטראקציה Aβ-פיברינוגן על מבנה קריש פיברין, בצע את ההוראות עבור הדגירה כמתואר וזמינותו עכירות (שלב 2). תמיד כוללים בקרת בארות אשר מכיל פיברינוגן, בהעדר הן Aβ והן מעכבי.
    4. פיפטה 80 µL של תערובת פיברינוגן מהשלב 3.1.3 בשקופיות כיסוי. מורחים בעדינות את הפתרון כך היא מופצת באופן שווה על השקופית כיסוי.
    5. לדלל תרומבין מניות (50 U/mL) לתוך תמיסת מלח HEPES buffered 20 מ מ כדי ריכוז סופי של 2.5 U/mL ולהוסיף 20 µL ישירות אל המרכז לפתרון של פיברינוגן ללא ערבוב.
      הערה: אם יש צורך, ריכוז העבודה תרומבין גבוה יותר (5 U/mL) יכול לשמש.
    6. מכסה את הצלחת 12-ובכן עם מכסה פלסטיק, להשאירו בטמפרטורת החדר למשך 30-60 דקות.
    7. בזמן קרישת התגובה פועל, להכין את התייבשות ופתרונות קיבעון. להכין מאגר cacodylate נתרן (0.1 M, pH 7.4). 10% גלוטראלדהיד הפתרון מניות במאגר cacodylate נתרן (0.1 M, pH 7.4) כדי להפוך של % 2 עובד תמיסת גלוטראלדהיד מדולל. שמור כל הפתרונות על קרח. טרי מדולל גלוטראלדהיד (2%) אמור לשמש בתוך שבוע 1, כאשר מאוחסנים כראוי מקרר ב 4 º C.
    8. לדלל מוחלטת אתנול (100%) במים מזוקקים כפול (80%, 50% ו-20% אתנול). לשמור על אתנול פתרונות אלה מוחלטת אתנול (100%) על קרח.
      זהירות: נקוט משנה זהירות בעת טיפול cacodylate נתרן גלוטראלדהיד, לבצע את הפעולות הבאות בברדס כימי.
    9. לאחר 30 דקות, בעדינות לשטוף הקרישים עם מאגר cacodylate נתרן כקרח (0.1 M) פעמיים. להוסיף 2 מ"ל של המאגר טוב כל כך שקוע לחלוטין הקריש. מכסה את הצלחת היטב עם מכסה, תשאיר את זה למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר 2 דקות, להסיר בעדינות את המאגר באמצעות פיפטה 1 מ"ל או גזע צר העברה פיפטה. חזור על פעם אחת.
    10. לתקן את הקרישים עם גלוטראלדהיד כקרח (2%). שמירה על הלוחית טוב קרח, להוסיף בסביבות 2-3 מ"ל של 2% גלוטראלדהיד מכל קידוח. ודא שהקרישים לחלוטין טובע. לכסות ולהשאיר את הצלחת קרח למשך 30 דקות.
    11. לאחר 30 דקות, בעדינות להסיר את גלוטראלדהיד מכל קידוח ולשטוף את הקרישים באמצעות מאגר cacodylate נתרן (0.1 M) כפי שתואר לעיל (2 דקות, פעמיים). לקחת את הצלחת היטב על קרח.
  2. טורי התייבשות של הקריש וייבוש נקודה קריטית
    1. מייבשים את קרישי סדרה מדורגת ממכוני אתנול קפואים מוכנים בשלב 3.1.8 (20%, 50%, 80%, 100% ו again100%) עבור 5 דקות כל אחד. הסדרה אתנול, הוסיפו 2-3 מ"ל, מוודא שהקרישים טובע. מכסה, דגירה על קרח.
    2. לאחר כל שלב אתנול, הסר את הפתרון אתנול באמצעות פיפטה 1 מ"ל או פיפטה חד פעמיות טפי. אל תסיר לחלוטין האתנול. ודא כי השטח קריש הדם לא חשופה לאוויר.
      הערה: התייבשות מוחלטת אתנול (100%) צריכה להתבצע פעמיים.
    3. תוך שמירה על המדגם שקועים האתנול 100% הסופי, להעביר לנקודת שיא מייבש (שיקגו). השתמש בעל מדגם רופאות או בעל מכסה עם דסקית להעברת השקופיות אל החדר רופאות. מניחים דסקית אחת לפחות בין כל שקופית.
    4. להוציא את השקופית כיסוי מן החדר רופאות, לעלות אותו על ספח SEM באמצעות הקלטת פחמן.
  3. להתיז ציפוי והדמיה
    1. להעביר את כל הדגימות עם ספח SEM תא ציפוי לרעוד. להוציא.
    2. לרעוד. להוציא מעיל בפחות מ-20 ננומטר של זהב/פלדיום או חומרים מוליכי חשמל אחרים, כגון פחמן, שימוש עם coater לרעוד. להוציא ואקום.
      הערה: השתמשנו 18 ננומטר של ציפוי זהב/פלדיום. הציפוי לרעוד. להוציא בוצע עבור 45 s ומהירות ציפוי היה 4 Å / ס' לרעוד. להוציא מצופה דגימות יציבים כאשר שמרה כראוי בסביבה יבשה בטמפרטורת החדר למשך כמה שבועות. SEM ניתוח יכול להתבצע בכל עת.
    3. לרכוש תמונות במיקרוסקופ אלקטרונים סריקה מצויד הגלאי SE2 ב-4 kV.
      הערה: גודל התמונה פיקסל בתמונה זו להגדיר טווח 13 nm nm-31.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במבחנה קרישת assay (עכירות), תרומבין אנזים cleaves פיברינוגן, וכתוצאה מכך להיווצרות רשת פיברין24. המשקע קריש פיברין גורמת פיזור של האור עובר דרך הפתרון, וכתוצאה מכך גדל עכירות (איור 1), דיו לפני סוף תקופת הקריאה (איור 2, ירוק). כאשר פיברינוגן, נדגרה בנוכחות Aβ42, עכירות של הפתרון פחתה, עם עקומת המתנשאים עד לגובה כמחצית המירבי של פיברינוגן לבד (איור 2 א, כחול). בפרסום ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השיטות המתוארות כאן מספקים אמצעי מהיר הדירים הערכת פיברין קריש היווצרות במבחנה. יתר על כן, הפשטות של המערכת הופכת את הפרשנות של מה Aβ משפיע על היווצרות קרישי פיברין ועל מבנה יחסית ישר קדימה. בפרסום הקודם של המעבדה הזאת, זה הוצג כי מבחני אלה יכול לשמש לבדיקת תרכובות על יכולתם לעכב את האינטראקציה Aβ-פיברינוגן13,14. באמצעות מבחני שני אלה, סדרה של תרכובות מסונתז נותחו על היכולת לעכב את האינטראקציה Aβ-פיברינוגן. למעשה, וזמינותו עכירות קריש הדם יכול לשמש כדי ל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחברים תודה מסאנורי קוואסקי Kazuyoshi אסו, מייקל פולי מ מכון דיסקברי הרפוי Tri-מוסדית (TDI), ניו-יורק של סינתזה של מעכבי האינטראקציה Aβ-פיברינוגן והצעות ערך שלהם. מחברים תודה גם חברי המעבדה סטריקלנד לדיון מועיל. עבודה זו נתמכה על ידי מענק-NIH NS104386 האלצהיימר קרן גילוי סמים, רוברטסון טיפולית הקרן עבור ה, NIH הענק NS50537, מכון דיסקברי הרפוי Tri-מוסדית, אלצהיימר סמים גילוי קרן, קרן משפחת רודין, ג'ון הרמן א עבור אס

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
פיבריוגן, מדולל פלסמינוגן, פלזמהEMD Millipore341578לשמור על פרפילם עטוף במכסה כדי למנוע חשיפה ללחות
בטא-עמילואיד (1-42),AnaspecAS-20276
מפלזמה אנושיתSigma-AldrichT7009
1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol, גדול או שווה ל-99%סיגמא-אולדריץ'105228
דימתיל סולפוקסיד (DMSO),Sigma-AldrichD2438
Pierce BCAThermo Scientific23225
Tris BaseFischer ScientificBP152
HEPESFischer ScientificBP310
NaClFischer ScientificS271
CaCl2Fischer ScientificC70
, 0.2µ M, 25 מ"מPall4612
Millex מסנני מזרק סטריליים, 0.1 אום, PVDF, קוטר 33 מ"מ.MilliporeSLVV033RS
מוצק 96 באר צלחות גבוהה מחייב מוסמך שטוח תחתוןפישר מדעי21377203
Spectramax Plus384מכשירים מולקולריים89212-396
צנטריפוגה, 5417REppendorf5417R
ברנסון 200 מנקה אולטרסאונדפישר מדעי15-337-22
מסובב מעבדהThermo Scientific2314-1CEQ
דסקיות חילוף למחזיק החלקת כיסויTousimis8766-01
צנרת גזע צרה - Sedi-PetElectron Microscopy Sciences (EMS)70967-13
מחזיק מדגם עבור CPD (מחזיק החלקת כיסוי)Tousimis8766
קופסת מחזיק תושבת, סוג סיכהמדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית (EMS)76610
שקופיות כיסוי זכוכית עגולות (12 מ"מ)Hampton ResearchHR3-277
10% GlutaraldehydeElectron Microscopy Sciences (EMS)16120
אתנולDecon Labs11652
24 באר צלחתFalcon3047
Na CacodylateElectron Microscopy Sciences (EMS)11652
SEM Stubs, קצה מחודד סיכה.מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית (EMS)75192
כרטיסיות PELCO, כרטיסיות מוליכות פחמן, 12 מ"מ ODTed Pella16084-1
Autosamdri-815 מייבש נקודה קריטיתTousimis
Denton Desk IV Coater עם יעד זהב / פלדיוםואקום
דנטון Leo 1550 FE-SEMCarl Zeiss
תוכנתSEM חכמהקרל זייס
תרומבין אנושי ערכת בדיקת חלבון בסינון סטרילי מזרק פילטר

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Selkoe, D. J., Schenk, D. Alzheimer's disease: molecular understanding predicts amyloid-based therapeutics. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 43, 545-584 (2003).
  2. Kurz, A., Perneczky, R. Amyloid clearance as a treatment target against Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 24, 61-73 (2011).
  3. Benilova, I., Karran, E., De Strooper, B. The toxic Abeta oligomer and Alzheimer's disease: an emperor in need of clothes. Nature Neuroscience. 15 (3), 349-357 (2012).
  4. Karran, E., Hardy, J. A critique of the drug discovery and phase 3 clinical programs targeting the amyloid hypothesis for Alzheimer disease. Annals of Neurology. 76 (2), 185-205 (2014).
  5. Yoshikawa, T., et al. Heterogeneity of cerebral blood flow in Alzheimer disease and vascular dementia. AJNR, American Journal of Neuroradiology. 24 (7), 1341-1347 (2003).
  6. Strickland, S. Blood will out: vascular contributions to Alzheimer's disease. The Journal of Clinical Investigation. 128 (2), 556-563 (2018).
  7. Ahn, H. J., et al. Alzheimer's disease peptide beta-amyloid interacts with fibrinogen and induces its oligomerization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21812-21817 (2010).
  8. Zamolodchikov, D., et al. Biochemical and structural analysis of the interaction between beta-amyloid and fibrinogen. Blood. 128 (8), 1144-1151 (2016).
  9. Cortes-Canteli, M., et al. Fibrinogen and beta-amyloid association alters thrombosis and fibrinolysis: a possible contributing factor to Alzheimer's disease. Neuron. 66 (5), 695-709 (2010).
  10. Cortes-Canteli, M., Mattei, L., Richards, A. T., Norris, E. H., Strickland, S. Fibrin deposited in the Alzheimer's disease brain promotes neuronal degeneration. Neurobiology of Aging. 36 (2), 608-617 (2015).
  11. Liao, L., et al. Proteomic characterization of postmortem amyloid plaques isolated by laser capture microdissection. The Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 37061-37068 (2004).
  12. Zamolodchikov, D., Strickland, S. Abeta delays fibrin clot lysis by altering fibrin structure and attenuating plasminogen binding to fibrin. Blood. 119 (14), 3342-3351 (2012).
  13. Ahn, H. J., et al. A novel Abeta-fibrinogen interaction inhibitor rescues altered thrombosis and cognitive decline in Alzheimer's disease mice. The Journal of Experimental Medicine. 211 (6), 1049-1062 (2014).
  14. Singh, P. K., et al. Aminopyrimidine Class Aggregation Inhibitor Effectively Blocks Abeta-Fibrinogen Interaction and Abeta-Induced Contact System Activation. Biochemistry. 57 (8), 1399-1409 (2018).
  15. Pretorius, E., Mbotwe, S., Bester, J., Robinson, C. J., Kell, D. B. Acute induction of anomalous and amyloidogenic blood clotting by molecular amplification of highly substoichiometric levels of bacterial lipopolysaccharide. Journal of the Royal Society Interface. 13 (122), (2016).
  16. Veklich, Y., Francis, C. W., White, J., Weisel, J. W. Structural studies of fibrinolysis by electron microscopy. Blood. 92 (12), 4721-4729 (1998).
  17. Weisel, J. W., Nagaswami, C. Computer modeling of fibrin polymerization kinetics correlated with electron microscope and turbidity observations: clot structure and assembly are kinetically controlled. Biophysical Journal. 63 (1), 111-128 (1992).
  18. Chernysh, I. N., Nagaswami, C., Purohit, P. K., Weisel, J. W. Fibrin clots are equilibrium polymers that can be remodeled without proteolytic digestion. Scientific Reports. 2, 879(2012).
  19. Klunk, W. E., Jacob, R. F., Mason, R. P. Quantifying amyloid beta-peptide (Abeta) aggregation using the Congo red-Abeta (CR-abeta) spectrophotometric assay. Analytical Biochemistry. 266 (1), 66-76 (1999).
  20. Zhao, R., et al. Measurement of amyloid formation by turbidity assay-seeing through the cloud. Biophysical Reviews. 8 (4), 445-471 (2016).
  21. Bester, J., Soma, P., Kell, D. B., Pretorius, E. Viscoelastic and ultrastructural characteristics of whole blood and plasma in Alzheimer-type dementia, and the possible role of bacterial lipopolysaccharides (LPS). Oncotarget. 6 (34), 35284-35303 (2015).
  22. Pretorius, E., Page, M. J., Mbotwe, S., Kell, D. B. Lipopolysaccharide-binding protein (LBP) can reverse the amyloid state of fibrin seen or induced in Parkinson's disease. PLoS One. 13 (3), e0192121(2018).
  23. Kell, D. B., Pretorius, E. Proteins behaving badly. Substoichiometric molecular control and amplification of the initiation and nature of amyloid fibril formation: lessons from and for blood clotting. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 123, 16-41 (2017).
  24. Wolberg, A. S., Campbell, R. A. Thrombin generation, fibrin clot formation and hemostasis. Transfusion and Apheresis Science. 38 (1), 15-23 (2008).
  25. Soon, A. S., Lee, C. S., Barker, T. H. Modulation of fibrin matrix properties via knob:hole affinity interactions using peptide-PEG conjugates. Biomaterials. 32 (19), 4406-4414 (2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

A beta 42SEM

מאמרים קשורים