להלן מוצגות שתי שיטות שבהן ניתן להשתמש בנפרד או במשולב כדי לנתח את השפעת בטא עמילואיד על מבנה קריש פיברין. כלול הוא פרוטוקול עבור יצירה של במבחנה clot פיברין, ואחריו קריש עכירות ואלקטרון סריקה שיטות.
מאמר שיטה
* These authors contributed equally
להלן מוצגות שתי שיטות שבהן ניתן להשתמש בנפרד או במשולב כדי לנתח את השפעת בטא עמילואיד על מבנה קריש פיברין. כלול הוא פרוטוקול עבור יצירה של במבחנה clot פיברין, ואחריו קריש עכירות ואלקטרון סריקה שיטות.
מאמר זה מציג שיטות ליצירת קרישי פיברין ב חוץ גופית ו ניתוח ההשפעה של חלבון (Aβ) בטא עמילואיד על היווצרות קרישי ומבנה באמצעות ספקטרומטר וסריקה מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM). Aβ, המהווה אגרגטים עמילואיד העצבים של מחלת אלצהיימר (AD), הוכח לקיים אינטראקציה עם פיברינוגן. אינטראקציה זו Aβ-פיברינוגן הופך קריש פיברין חריגות מבנית ועמיד בפני ופיברינוליזה. Aβ-induced העיוותים פיברין קרישת עשוי גם לתרום היבטים כשאבדן של פתולוגיה לספירה כגון microinfarcts, דלקת, וכן, angiopathy עמילואיד במוח (סי). בהתחשב בתפקיד הגירעונות נוירו-וסקולריים שעשוי להיות קריטי בפתולוגיה לספירה, פיתוח תרכובות אשר יכול לעכב או להפחית את האינטראקציה Aβ-פיברינוגן יש ערך טיפולי מבטיח. במבחנה שיטות מאת אילו פיברין היווצרות קריש דם יכול בקלות ובאופן שיטתי להידרש הן כלים שימושיים פוטנציאל לפיתוח תרכובות טיפולית. המוצג כאן הוא פרוטוקול אופטימיזציה עבור הדור במבחנה של קריש פיברין, כמו גם ניתוח ההשפעה של מעכבי האינטראקציה Aβ ו- Aβ-פיברינוגן. וזמינותו עכירות קריש דם מהירה, לשחזור מאוד והוא יכול לשמש כדי לבדוק תנאים מרובים בו זמנית, המאפשר הקרנת הסרט מספר גדול של מעכבי Aβ-פיברינוגן. תרכובות פגע ההקרנה הזאת ניתן להעריך עוד יותר בשל יכולתן דהוא Aβ-induced מומים מבניים של האדריכלות קריש פיברין תוך שימוש ב- SEM. היעילות של פרוטוקולים ממוטבת אלה הפגינו כאן באמצעות TDI-2760, מעכב האינטראקציה Aβ-פיברינוגן שזוהו לאחרונה.
מחלת אלצהיימר (AD), מחלת ניוון עצבי מוביל לירידה קוגניטיבית בחולים קשישים, יוכפל לאחר המרתו נובע חריג בטא עמילואיד (Aβ), צבירת וביטוי סיווג לקוי וכתוצאה מכך neurotoxicity1, 2. למרות האגודה מאופיין היטב בין Aβ אגרגטים לספירה3, המנגנונים מדויק המחלה פתולוגיה אינם מובנים היטב4. הוכחה גוברת מרמז כי הגירעונות נוירו-וסקולריים לשחק תפקיד התקדמות וחומרת של המודעה5, כפי Aβ ישירות אינטראקציה עם הרכיבים של מערכת הדם6. Aβ יש אינטראקציה גבוהה-זיקה עם פיברינוגן7,8, אשר רג....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
1. הכנת Aβ42, פיברינוגן לניתוח
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
במבחנה קרישת assay (עכירות), תרומבין אנזים cleaves פיברינוגן, וכתוצאה מכך להיווצרות רשת פיברין24. המשקע קריש פיברין גורמת פיזור של האור עובר דרך הפתרון, וכתוצאה מכך גדל עכירות (איור 1), דיו לפני סוף תקופת הקריאה (איור 2, ירוק). כאשר פיברינוגן, נדגרה בנוכחות Aβ42, עכירות של הפתרון פחתה, עם עקומת המתנשאים עד לגובה כמחצית המירבי של פיברינוגן לבד (איור 2 א, כחול). בפרסום .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
השיטות המתוארות כאן מספקים אמצעי מהיר הדירים הערכת פיברין קריש היווצרות במבחנה. יתר על כן, הפשטות של המערכת הופכת את הפרשנות של מה Aβ משפיע על היווצרות קרישי פיברין ועל מבנה יחסית ישר קדימה. בפרסום הקודם של המעבדה הזאת, זה הוצג כי מבחני אלה יכול לשמש לבדיקת תרכובות על יכולתם לעכב את האינטראקציה Aβ-פיברינוגן13,14. באמצעות מבחני שני אלה, סדרה של תרכובות מסונתז נותחו על היכולת לעכב את האינטראקציה Aβ-פיברינוגן. למעשה, וזמינותו עכירות קריש הדם יכול לשמש כדי ל.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
המחברים אין לחשוף.
מחברים תודה מסאנורי קוואסקי Kazuyoshi אסו, מייקל פולי מ מכון דיסקברי הרפוי Tri-מוסדית (TDI), ניו-יורק של סינתזה של מעכבי האינטראקציה Aβ-פיברינוגן והצעות ערך שלהם. מחברים תודה גם חברי המעבדה סטריקלנד לדיון מועיל. עבודה זו נתמכה על ידי מענק-NIH NS104386 האלצהיימר קרן גילוי סמים, רוברטסון טיפולית הקרן עבור ה, NIH הענק NS50537, מכון דיסקברי הרפוי Tri-מוסדית, אלצהיימר סמים גילוי קרן, קרן משפחת רודין, ג'ון הרמן א עבור אס
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| פיבריוגן, מדולל פלסמינוגן, פלזמה | EMD Millipore | 341578 | לשמור על פרפילם עטוף במכסה כדי למנוע חשיפה ללחות |
| בטא-עמילואיד (1-42), | Anaspec | AS-20276 | |
| מפלזמה אנושית | Sigma-Aldrich | T7009 | |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol, גדול או שווה ל-99% | סיגמא-אולדריץ' | 105228 | |
| דימתיל סולפוקסיד (DMSO), | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Pierce BCA | Thermo Scientific | 23225 | |
| Tris Base | Fischer Scientific | BP152 | |
| HEPES | Fischer Scientific | BP310 | |
| NaCl | Fischer Scientific | S271 | |
| CaCl2 | Fischer Scientific | C70 | |
| , 0.2µ M, 25 מ"מ | Pall | 4612 | |
| Millex מסנני מזרק סטריליים, 0.1 אום, PVDF, קוטר 33 מ"מ. | Millipore | SLVV033RS | |
| מוצק 96 באר צלחות גבוהה מחייב מוסמך שטוח תחתון | פישר מדעי | 21377203 | |
| Spectramax Plus384 | מכשירים מולקולריים | 89212-396 | |
| צנטריפוגה, 5417R | Eppendorf | 5417R | |
| ברנסון 200 מנקה אולטרסאונד | פישר מדעי | 15-337-22 | |
| מסובב מעבדה | Thermo Scientific | 2314-1CEQ | |
| דסקיות חילוף למחזיק החלקת כיסוי | Tousimis | 8766-01 | |
| צנרת גזע צרה - Sedi-Pet | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 70967-13 | |
| מחזיק מדגם עבור CPD (מחזיק החלקת כיסוי) | Tousimis | 8766 | |
| קופסת מחזיק תושבת, סוג סיכה | מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית (EMS) | 76610 | |
| שקופיות כיסוי זכוכית עגולות (12 מ"מ) | Hampton Research | HR3-277 | |
| 10% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 16120 | |
| אתנול | Decon Labs | 11652 | |
| 24 באר צלחת | Falcon | 3047 | |
| Na Cacodylate | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 11652 | |
| SEM Stubs, קצה מחודד סיכה. | מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית (EMS) | 75192 | |
| כרטיסיות PELCO, כרטיסיות מוליכות פחמן, 12 מ"מ OD | Ted Pella | 16084-1 | |
| Autosamdri-815 מייבש נקודה קריטית | Tousimis | ||
| Denton Desk IV Coater עם יעד זהב / פלדיום | ואקום | ||
| דנטון Leo 1550 FE-SEM | Carl Zeiss | ||
| תוכנת | SEM חכמהקרל זייס |
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה
בקש הרשאה