הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ניתוח ביטוי גנטי של תאי אנדותל נחשף להטיית מתח באמצעות מרובות במקביל-plate זרימה צ'יימברס

8.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/58478

⸱

21 באוקטובר 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Medical Science, University of Toronto, 2Keenan Research Centre in the Li Ka Shing Knowledge Institute, St. Michael's Hospital, 3Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto, 4Department of Medicine, University of Toronto

במאמר זה

סיכום

כאן מוצג זרימת עבודה עבור ניתוח ביטוי תרבות, גנים של תאי אנדותל תחת גזירה נוזלים. כלול הוא סידור הפיזי בו זמנית דיור וניטור צ'יימברס מרובים זרימה בסביבה מבוקרת, את השימוש RNA אקסוגני עזר עבור ה-PCR כמותי.

תקציר

אנו מתארים זרימת עבודה עבור הניתוח של ביטוי גנים מתאי אנדותל בכפוף זרימה שכבתית קבועה באמצעות תאי זרימה במקביל-plate בפיקוח מרובים. תאי אנדותל ליצור תאי הציפוי הפנימי של כלי הדם, באופן כרוני חשופים לכוח חיכוך של זרימת הדם הנקרא גזירה. בתנאים פיזיולוגיים, תאי אנדותל פונקציה בנוכחות גזירה לתנאים שונים. לפיכך, היישום של גזירה תנאים במבחנה במודלים יכול לספק תובנות רבות יותר על תגובות אנדותל vivo בתוך. תא הזרימה במקביל-plate שפורסמו קודם לכן על ידי ליין. et al. 9 הוא מותאם ללמוד הכונה אנדותל הנוכחות ואת היעדר זרימה שכבתית (שאינם פועמת) קבוע. עיבודים מפתח בקביעת עבור זרימה שכבתית כפי שהוצג כאן כוללים סביבה גדול, ייעודי הבית זרימה בו-זמניות מעגלים, הפיקוח על המחירים זרימה ב בזמן אמת, והכללה של אקסוגני הפניה RNA על נירמול של נתונים כמותיים PCR בזמן אמת. כדי להעריך טיפולים/תנאים מרובים עם היישום של גזירה, זרימת החשמל מרובים, משאבות משמשים בו זמנית בתוך החממה מחוממת, humidified אותו. קצב הזרימה של כל מעגל זרימה נמדד באופן רציף בזמן אמת לתקנן את התנאים גזירה לאורך כל הניסויים. כי ניסויים אלה יש תנאים מרובים, אנו משתמשים גם של RNA אקסוגני עזר זה עלה בבזמנו של RNA חילוץ עבור נירמול של החילוץ-RNA, הראשון-strand cDNA סינתזה היעילות. השלבים למזער את השונות בין הדגימות. אסטרטגיה זו מועסק בצבר שלנו לניתוח ביטוי גנים עם גזירה ניסויים באמצעות תא הזרימה במקביל-צלחת, אבל חלקים של אסטרטגיה זו, כגון אקסוגני הפניה ספייק-ב-RNA, יכול בקלות, באופן חסכוני לשמש יישומים אחרים.

מבוא

תאי אנדותל כלי הדם בצורת תאי הציפוי הפנימי של כלי הדם במערכת הלב וכלי הדם הסגורה של מינים גבוה יותר. הם יוצרים את הממשק בין הדם לבין רקמות, מאופיינים luminal ומשטחים abluminal. אנדותל היא מערכת מגוונת, פעיל, והוא מסתגלת המווסת את זרימת הדם מזין סחר, חסינות, הצמיחה של כלי דם חדשים1. בגוף, תאי אנדותל קיימים בדרך כלל בסביבה שבה הם נחשפים לכוח חיכוך של מחזור הדם, גזירה2. גזירה הרגולטור חשוב של ביטוי גנים תא אנדותל3, תאי אנדותל לנסות לשמור על גזירה בתוך2,בטווח נתון4. תאי אנדותל מדגימים האנגיוגנזה תכנים בהעדר מאמץ גזירה5 שיכולות לשפר רקמות זלוף. דפוסים אזוריים של זרימה מופרעת, גזירה שינו משויכות הביטוי של גנים דלקתיים6 לבין התפתחות טרשת עורקים7,8. כך, דגמים הכוללים מאמץ גזירה הם מרכיב מרכזי להבנת הכונה אנדותל.

נתאר שיטת לימוד של הכונה בתאי אנדותל כלי הדם תחת גזירה. מערכת זו משתמשת זרימה פועמת ואת מחקה רמות הנוזלים גזירה, ריכוז חמצן את התנאים מודל עבור תאי אנדותל עורקי. פרוטוקול זה כולל פרטים על שיטות נוקאאוט גנטי באמצעות התערבות ב RNA (RNAi), הסידור של יישום באמצעות מכשירים במקביל-plate זרימה, שיטות ספייק-אין של אקסוגני הפניה RNA לפני הניתוח על ידי מאמץ גזירה תגובת שרשרת של פולימראז כמותית-טרנסקריפטאז (RT-qPCR). צינור זה משמש עבור הלומדים הכונה בתאי האנדותל הנוכחות ואת היעדר למינריות גזירה, כולל עיבוד של המנגנון הזרימה במקביל-plate מתוארת על ידי ליין. et al. 9. הגדרת המסוים הזה נועד לקדם את ההערכה בו זמנית של מספר תנאים ניסיוני המאפשר השוואה ישירה של תנאים גזירה, כמו גם את הנורמליזציה של RNA ניתוח. יחידה גדולה מחוממת עם מבוקרת לחות מנוצל כדי לאפשר זרימה נפרדת צ'יימברס מרובים, משאבות לנהל בו זמנית עם זרימה המחירים פיקוח להרכבה הקאמרית לכל הזרימה בזמן אמת. היישום של זה משמש נוקאאוט גנטי באמצעות RNAi בסביבה של זרימה שכבתית/גזירה, אך ניתן ליישם היבטים של פרוטוקול זה כל הערכה של RNA ביטוי.

גישות נפוצות היישום של גזירה עבור תאי אנדותל כוללים מערכות microfluidic10, עם מד צמיגות חרוט ופלייט-11קאמרית הזרימה במקביל-plate12. Microfluidic מערכות מיצרנים שונים היו שימושיים בלימוד mechanobiology ו- mechanotransduction תא מרובים, סוגי רקמות ואת מגוון רחב של גירויים ביופיזיקלי. עבור תאי אנדותל, הם שימשו ללמוד תאי אנדותל בידוד, כמו גם את האינטראקציה של תאי אנדותל וסחר של תאי החיסון או גידול10. עם זאת, מערכות אלו מתאימים פחות ההתאוששות של מספר גדול של תאים9. מד צמיגות קונוס-ו-plate והן במקביל-plate זרימה צ'יימברס לאפשר ההתאוששות של מספר גדול של תאים confluent monolayers12. מערכות אלה ניתן להפיק מגוון של הכוחות ודפוסי הטיה12. במקביל-plate זרימה קאמרית הרכבה9 יש את היתרון הזה הדמיה בזמן אמת יכול להתבצע דרך חלון זכוכית להערכת המורפולוגיה הסלולר בכל נקודת זמן. יתר על כן, ניתן לאסוף את perfusate בתנאים סטריליים. עבור מערכת המספרים המובאים כאן, הזרם ניתן גם לנטר בזמן אמת, מלכודת קאמרית מרובה, המאפשרת קיום התנאים הטיה בין צ'יימברס.

לניסויים נציג, הוא יפתור אנדותל תאים (HUVEC), אשר מייצגים סוג תאי אנדותל macrovascular, משמשים, ונשתמש התנאים גזירה (1 הרשות הפלסטינית) משקפים מצבים עורקי (0.1 - 0.7 הרשות הפלסטינית). עם זאת, ניתן להשתמש בפרוטוקול זה עם סוגי תאים אנדותל אחרים, התנאים גזירה יכול להיות מותאם על פי השאלה ניסיוני. לדוגמה, ההערכה של תאי אנדותל אדם תנאים בהם מודל מחזור ורידים ידרוש רמות נמוכות יותר של גזירה (Pa 1-6), מחקרים כי מודל זרימת microvascular נעזרו גזירה רמות של 0.4 - הרשות הפלסטינית 1.213 , 14. בנוסף, גזירה יכול להשתנות אפילו בין תאי אנדותל בתוך כלי דם באותו6. הסידור הנוכחי, מערכת מעקב יחיד משמש זה יכול לעקוב אחר בו זמנית ארבע לולאות זרם נפרד. עבור מעבדות צריכה לולאות זרם נוסף, יש שטח בסביבה ייעודית למערכת ניטור נוספים.

RT-qPCR משמש את כימות מוחלטת של ביטוי גנים בהגדרה של גזירה. הביטוי היחסי של הגנים יעד משמש לעתים קרובות כדי להשוות RNA הביטוי על-פני תנאים. מינים מסוימים RNA יכול להתקיים כמויות נמוכות מאוד או להיעדר, ובכך שמסבך מידות יחסית. לדוגמה, זמן noncoding RNAs בתאי האנדותל שיכולים להפעיל אפקטים חזק במספרים עותק נמוך יחסית לכל תא5. בנוסף, הבדלי יעילות פריימר יכול להוביל פרשנות שגויה של ניצול שיטת הסף (Ct) של מחזור דלתא-delta לנתח את הנתונים. כדי לטפל חשש זה, אנו מבצעים כימות מוחלטת על ידי יצירת עיקול רגיל באמצעות כמות ידועה של פלסמיד ה-DNA. יתר על כן, משלימים לסינתזת DNA (cDNA) הוא תהליך לא יעיל, הבדלים cDNA יעילות יכול להסביר הבדלים בביטוי RNA בין בתנאים ובין דגימות15. היישום של גזירה ו/או תרביות תאים ריאגנטים יכול להשפיע על התפשטות תאים אפופטוזיס, הכדאיות, או להוסיף רכיבים עלולים להפריע סינתזה RNA בידוד ו/או cDNA. להביא בחשבון האפשרות של הטיה מן הבידוד רנ א cDNA סינתזה, אנו משתמשים בספייק RNA פקד מסונתז במעבדה, הוסיף בזמנו של החילוץ-RNA, נמדד עם כל cDNA סינתזה ויה RT-qPCR. פעולה זו מאפשרת לא רק את ההתאמה טכני הבדלי סינתזה RNA חילוץ ו- cDNA אך גם מאפשר חישוב כמויות מוחלטת בכל תא, כאשר ספירת ידוע.

מערכת זו משתמשת צעדים נוספים כדי לשמור על דמיון או בחשבון הבדלים טכניים בין תנאי. שלבים אלה מודגשת במיוחד בגלל האופי המורכב של ניסויים אלה, בהם מעורבים מספר set-ups פיזי ותנאים ניסיוני זה יכול להוביל השתנות ניסיוני.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת אקסוגני עזר RNA

הערה: בחר הפניה אקסוגני RNA שאינו קיים מינים או מודל של עניין. עבור מערכות יונקים, גחלילית לוציפראז RNA עשוי לשמש.

  1. לינאריזציה של פלסמיד אקסוגני עזר RNA
    1. להכין הפניה אקסוגני RNA לפחות 48 שעות לפני החילוץ RNA הצפויה. להשיג או לייצר שיבוט cDNA של שבחרת אקסוגני ההתייחסות RNA, כגון שיבוט cDNA גחלילית לוציפראז וקטור פלסמיד מתאים במבחנה שעתוק (ראה טבלה של חומרים).
    2. לבצע אנזים הגבלה (RE) העיכול של µg 1 של פלסמיד באורך מלא (פלסמיד לוציפראז גחלילית זה pSP-לוק + אשר 4100 bp) משתמש יחיד-חותך מחדש (XhoI) 1.5-mL microfuge צינורות. לבחור RE זה בחותך יחיד (חתכים פלסמיד x רק 1) בקצה 3' של ההפניה אקסוגני רצף ה-RNA שמשאירה של 5' החריגה או סוף בוטה. עבור הכנה טיפוסי, לבצע פלסמיד שבע לינאריזציה תגובות (שלבים 1.1.4 - 1.1.7) במקביל ליצירת RNA ריכוז וכמות מספקת כדי להשלים סט אחד של ניסויים או פרויקט אחד.
      1. מודדים את ריכוז פלסמיד באמצעות ספקטרופוטומטר או spectrofluorometry.
      2. להכין תערובת רי ב כל שפופרת: להוסיף 4 µL של XhoI (20,000 יחידות/mL), µL 8 של RE מאגר, x µL של פלסמיד (1 µg), ולהגיע H מספיקות2O פתרון כולל של 80 µL.
      3. דגירה התערובת RE עבור 2 h ב- 37 מעלות צלזיוס. השתמש האדומ לפי הנוהל של היצרן, כל השינויים עלול לגרום פעילות מוגברת כוכב או שאינם ספציפיים המחשוף של יעד ה-DNA. חום להשבית את תערובת התגובה כעשרים דקות ב 65 º C.
      4. לסיים את התקציר RE עם אתנול משקעים כל שפופרת. לתערובת RE, להוסיף ישירות µL 4 של 0.5 M EDTA pH 8.0, µL 8 של 3 מ' סודיום אצטט pH 5.2, 184 µL של 100% אתנול. מערבבים היטב, להקפיא את התערובת ב-20 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
      5. ספין למטה התערובת ב 4 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות-כוח צנטריפוגלי היחסי (RCF) של 16,100 x g.
      6. הסר את תגובת שיקוע עם טיפ טוב, בלי לגעת בגדר. מילה נהדרת בגדר במשך 5 דקות, resuspend זה ב 6 µL של H2O (התחמם עד 37 ° C) על ידי pipetting למעלה ולמטה 5 x - 10 x.
      7. לאשר את לינאריזציה של פלסמיד לוציפראז על-ידי הפעלת המוצר מתעכל על 2% agarose ג'ל המכיל אתידיום ברומיד (EtBr) יחד עם סולם 1 kb +, supercoiled הסולם, ולא גזור, פלסמיד נימולים. בדוק את הג'ל והמשך שעתוק במבחנה אם הנתיב עבור פלסמיד לחתוך מראה להקה אחת ~ 4 kb (פלסמיד נימולים יהיו שלוש להקות; איור 1).
        זהירות: EtBr היא סרטנית. לעבוד בשכונה fume כימי.
  2. ב חוץ גופית שעתוק של פלסמיד אקסוגני עזר RNA
    1. לכל שפופרת של מוצרים פלסמיד מעוכל, לבצע תמלול חוץ גופית בתוך באמצעות שיטת תיעתוק במבחנה (ראה טבלה של חומרים). בצע הוראות היצרן ולהשתמש phage המתאים של RNA פולימראז. אם השיטה של cDNA הסינתזה דורש זנב poly(A), או יישומים אחרים דורשים זנב poly(A), בחר פעולת שירות של שעתוק במבחנה הכוללת תוספת הזנב poly(A) (ראה טבלה של חומרים).
    2. לשלב את כל במבחנה עיבד מוצרים לתוך צינור פוליפרופילן 1.5-mL יחיד לפני טיהור.
  3. Purif ication של RNA מן התגובה שעתוק במבחנה
    1. לטהר במבחנה עיבד מוצרים עם במבחנה תמלול הניקיון קיט (ראה טבלה של חומרים). אנא עקוב אחר הפרוטוקול של היצרן.
    2. להעריך את ריכוז ה-RNA על ידי מדידת ספיגת ב-260 nm באמצעות ספקטרופוטומטר.
      הערה: ריכוז ה-RNA מחושבת באמצעות החוק למברט. זה קובע ספיגת חומצות גרעין (אשר סופגים אור חזק-260 ננומטר) פרופורציונלי לריכוז. ספיגת של 1.0 שווה 40 µg/mL של RNA חד-גדילי.
  4. Aliquoting המניה RNA לתוך ה-PCR צינורות לשימוש ניסיוני
    1. ודא ריכוז ה-RNA µg 1/µL.
      1. אם ריכוז ה-RNA > 1 µg/µL, לדלל את המניה 1 µg / Aliquot 1 µL µL. לתוך ה-PCR צינורות ואחסן אותם ב- 80 ° c
      2. אם ריכוז ה-RNA < 1 µg/µL, משקעים נוספים באמצעות 5 מ' אמוניום אצטט (שסופק בערכה) יכולה להתבצע לפי הפרוטוקול של היצרן. אם ריכוז ה-RNA הוא עדיין < 1 µg/µL, להמשיך עם aliquoting 1 µL לתוך המבחנות.

2. החלק ציפוי

הערה: השלבים 2.1-2.10 צריך להיות h 24-48 שבוצעו לפני תא הצפויה זריעה.

  1. מחממים התנור ל 250 מעלות צלזיוס.
  2. שימוש בכפפות סטריליות, לעטוף כל שקופית זכוכית 2 x עם רדיד אלומיניום. הימנע לגעת במשטח של השקופית ישירות.
  3. אופים את השקופיות בתנור לשעה ב 250 מעלות צלזיוס ולאפשר את השקופיות להתקרר לטמפרטורת החדר.
    הערה: שלב זה הוא חשוב עבור השמדת כל אנדוטוקסין משחיתה.
  4. בעוד השקופיות הן קירור להפוך את פתרון fibronectin מניות של 1 מ"ג/מ"ל מים מזוקקים, דגירה זה במשך 30 דקות ב 37 ° C כדי להמיס. להפוך aliquots 100-µL. . לקבוע את aliquots לשימוש מיידי ומקפיאים את aliquots הנותרים לשימוש עתידי.
  5. לפתוח את הכיסוי החיצוני של רדיד אלומיניום לפני שמכניסים את השקופית זכוכית לתוך אבטחה ארון. ביצוע השלבים 2.6-2.7 ו- 2.9 אבטחה הקבינט.
  6. מניחים את השקופית זכוכית לתוך תבשיל תרבות עקרה תא 4-ובכן מלבני.
  7. לדלל fibronectin מטריים פתרון מניות עם מים מזוקקים. כל שקופית עם 1 מ"ל של fibronectin מדולל, טיפה על ידי ירידה, באמצעות פיפטה של המעיל. ודא כי כל השקופית מכוסה.
  8. דגירה השקופיות חממה תרביות רקמה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24-48 שעות.
  9. לאחר הדגירה, וארוקן את fibronectin בהטיית המנה התרבות התא 4-. טוב. להימנע מלגעת השקופית ישירות עם העצמות.

3. זריעה על גבי זכוכית תא שקופיות

  1. ספור תאי אנדותל אנושי-מעבר מוקדם (מעבר 2-5), זרע ~1.0 x 10 תאים6 על כל שקופית fibronectin מצופה זכוכית עם 1 מ"ל של מדיה (1.0 x 106 תאים למ"ל מדיה). זרע התאים 24 שעןת לפני היישום הצפויה של זרימה שכבתית אם אין טיפול אחר נמצא שיבוצע.
    הערה: מספרים אלה משמשים כמדריך עבור ניסויים עם 24 שעות של זרימה.
    1. התאם את צפיפות זריעה כדי להשיג של טפט confluent של תאים בזמנו של קציר תאים והפקת RNA.
  2. . תן את התאים לדבוק השקופית למשך 15 דקות ב 37 º C.
  3. להוסיף 3 מ"ל של מדיה בכל היטב של המנה התרבות התא כדי לכסות את השקופית, דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה עם 5% CO2.

4. Interfering קטן RNA (siRNA) תרביות תאים

  1. הכנה של תאים בשקופיות זכוכית לניסויים תרביות תאים וזרימה siRNA
    1. לפי התקנון בשלבים 2 (שקופית ציפוי) ו- 3 (תא זריעה על גבי מדרון זכוכית) עבור ציפוי לניסויים זרימה והכנה של שקופיות זכוכית.
    2. זרע תאים 24 שעות לפני הטיפול siRNA (48 שעות לפני היישום של זרימה שכבתית).
    3. זרע תאי אנדותל האנושי בתקשורת תרופתיים-750,000-1 x 106 תאים לכל שקופית כדי להשיג הנהרות 85-95% למחרת.
      הערה: HUVEC נמצאים בשימוש בפרוטוקול זה.
  2. הכנת קומפלקסים ריאגנט siRNA-השומנים מבוססי תקנים (לכל השקופיות)
    1. עיצוב מותאם אישית siRNAs או סדר premade siRNAs עבור הגן הרצוי של עניין.
      הערה: בצע את הפעולות הבאות באבטחה ארון.
    2. מוסיפים 6 µL של siRNA (20 מיקרומטר מניות) 414 µL של מדיום מופחת סרום (ראה טבלה של חומרים) ומערבבים בעדינות על-ידי pipetting.
    3. µL 49.5 של ריאגנט בעדינות מעורב המבוסס על השומנים תרביות תאים למהול (ראה טבלה של חומרים) ב- µL 130.5 של מדיום מופחת סרום.
    4. לערבב בעדינות, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
    5. לשלב siRNAs מדולל ריאגנט ליפיד המבוסס על תרביות תאים, מערבבים בעדינות, תקופת דגירה של 15 דקות בטמפרטורת החדר. מערבבים בעדינות כדי למנוע שיבוש מתחמי ריאגנט ליפיד המבוסס על תרביות תאים.
      הערה: הפתרון עשוי להופיע מעונן כטופס תסביכים.
    6. בעוד מתחמי יוצרים, להסיר את מדיום הגידול ולשטוף את התאים 1 x מופחת סרום בינונית.
    7. להוסיף 2.4 מ של מדיום מופחת סרום כל שקופית.
    8. הוסף 600 µL של מתחמי ריאגנט בעדינות מעורב siRNA-השומנים מבוססי תקנים בכל צלחת, סלע את הצלחת הלוך ושוב כדי לערבב. להבטיח הריכוז הסופי של siRNA 40 ננומטר. ודא כי השקופית מכוסה לגמרי.
    9. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות.
    10. להוסיף 1 מ"ל של התא ללא אנטיביוטיקה אנדותל הצמיחה המדיה המכילה 3 x ריכוז רגיל של סרום שור עוברית (FBS) מבלי להסיר את התערובת תרביות תאים.
    11. דגירה התאים ב 37 ° C עד מוכן לשימוש.

5. חישוב קצב הזרימה בהתבסס על גזירה הרצוי9

  1. לחשב את קצב הזרימה בהתבסס על הלחצים ההטיה הרצויה לפי המשוואה הבאה:
    figure-protocol-1
    כאן,
    Q הוא קצב הזרימה ב- mL/min;
    Τ הוא הלחץ ההטיה הרצויה dynes/ס מ2 (1 Pa = 10 dynes/cm2);
    w הוא ברוחב של התא במקביל-plate זרימה ב ס"מ;
    h הוא הגובה של התא במקביל-plate זרימה ב ס"מ;
    ממוצע הוא צמיגות של אמצעי התקשורת cP (g/cm·s).
    הערה: גזירה למינריות טיפוסי (הלא-פועמת) של זרימת עבודה זו מתבצעות בτ = 1 הרשות (10 dynes/cm2). ממוצע ניתן למדוד באמצעות מד צמיגות כגון מד צמיגות קונוס-ו-plate, יכול להשתנות בהתאם לתוכן של המדיה כולל סרום לתוספי נוספים9.
  2. כדי להשיג ספציפי τ (גזירה), להתאים את קצב הזרימה ו/או צמיגות. בקצבי זרימה גבוהים תאים חסיד ייתכן מביצועם של השקופית. שיעורי דגימה זרימה עם זרימה טיפוסי צ'יימברס מוצגים בטבלה 1.

6. הגדרת סביבה ייעודי עבור ניטור המערכת, במקביל-plate זרימה מרובים צ'יימברס (איור 2)

  1. להשתמש גדולה מחוממת יחידה/חממה עם מספר מדפים, גישה חשמל פנימית, דלתות זכוכית – המכונה החוף (מובנה סביבת מתכוונן CO2 ) וחום – לבית תאי זרימה מרובים בו-זמנית עבור ניסויים זה דורשים מאמץ גזירה והן השוואה ישירה בין שניים או יותר טיפולים או תפוקות (קרי, DNA, RNA, חלבון).
    הערה: חוף הים מאפשר ניטור תכופים של המעגל זרימה, כולל קצב הזרימה, ללא הפרעה תכופים של הסביבה.
  2. ודא CO נאותה2 זמין עבור הניסוי שהצג2 CO אינו פונקציונלי. ודא שהמגש מים בהתאם מלא, כך יהיו אוויר humidified.

7. הגדרת על מנגנוני זרימה במקביל-צלחת

הערה: עבור הייצור של לוחות מקבילים, נא עיין ליין. et al. 9.

  1. אוטוקלב הזרם קאמרית צלחות, אגירה, dampener, אבובים ו Luers עבור הגדרת הקאמרית לכל הזרימה במקביל-plate כמצוין בטבלה מס ' 2.
  2. הקמה של ההרכבה לולאת זרם (איור 3).
    1. מניחים מגבות סטריליות בטיחות ביולוגית בארון. להרכיב מערכת loop הזרימה, קודם בלי התא במקביל-plate זרימה, בארון בטיחות ביולוגית.
    2. לחבר את מכלול אבובים על המאגר:
      1. הכנס צינור קשיח #14 לתוך חור אחד וצינורות שני #14 רך לתוך החורים שני אחרים בתוך הכיפה של המאגר זרימה. ודא כי באחד הצינורות רך נוגע בתחתית של המאגר כמו אבובים יצוא .
      2. במקום "1/16" זכר סכינים סטריליים בסוף #14 קשה צינור ולצרף מסנן סטרילי כמו אוורור.
      3. במקום "1/16" הנשי סכינים סטריליים בסוף #14 רך תזרים צינור, בא מן המאגר, וצירוף של צימוד 4-way.
        הערה: עבור ניתוח ביטוי גנטי או מחקרים אחרים. איפה perfusates לא צריך להיות שנאספו, 2-way stopcocks יכול לשמש במקום stopcocks 4-way בפרוטוקול זה.
      4. במקום "1/16" סכינים סטריליים זכר בסוף הצינור תזרים רכים #14, בא מן המאגר.
    3. להתחבר לאורך צינור זרימה יוצאת של מאגר מים משאבת אבובים: במקום "1/16" סכינים סטריליים הנשי בכל קצה של שפופרת קשה #13 (משאבת צינור). לחבר את הצינור תזרים רכים #14 מן המאגר הצינור הקשיח #13 על ידי התחברות "1/16" Luers זכר ונקבה ביחד.
    4. לחבר את צינור משאבת עם אבובים "גשר dampener": מקום 1/8" סכינים סטריליים זכר ו- 1/8" הנשי סכינים סטריליים בקצה אחד של צינור רך #16. מחבר "1/16" סכינים סטריליים הנשי של #13 קשה הצינור (בסוף יצוא לאורך צינור המשאבה) עם "1/8 זכר סכינים סטריליים של הצינור רך #16.
    5. להרכיב צינורות עבור dampener זרם: מקום "3/16" זכר סכינים סטריליים בקצה אחד של הצנרת רך #25, חזור על הפעולה עבור הצד השני של dampener הזרימה. לצרף הפנויות של הצינורות רך #25 בכל צד של dampener הזרימה.
    6. לחבר את הצנרת "גשר dampener" עם אבובים עבור dampener זרם: חיבור צינור רך #25 מתוך dampener זרימה עם הצינור רך #16 של "גשר dampener" באמצעות "1/8 סכינים סטריליים נקבה מן הצד #16"גשר dampener", את ה" 3/16 להציב כבר את "זכר סכינים סטריליים מן הצד צינור #25 dampener רך.
    7. להרכיב צינורות 'קאמרית bridge':
      1. מקום 1/8" סכינים סטריליים נקבה ו- 1/8" זכר סכינים סטריליים בקצה אחד של צינור רך #16 ('קאמרית גשר צינורות).
      2. מחבר "1/8 סכינים סטריליים הנשי של 'הגשר הקאמרית" עם "3/16" זכר סכינים סטריליים על הצינור רך #25 בסוף dampener זרימה חופשית.
      3. ב- "1/8 זכר סכינים סטריליים (סיום חופשי) של הצנרת 'קאמרית bridge', המקום של צימוד 4-way.
    8. לחבר את צימוד 4-way מהקצה חינם 'קאמרית bridge' צימוד 4-way מן המאגר תזרים רכים הצנרת (מתוך שלב 7.2.2.3). לסגור את stopcocks.
    9. הוסף מדיה המאגר ואת dampener. לחשיפה 48-h להטיית מתח, להוסיף 35 מ של המדיה המאגר ואת מ"ל 25 עד dampener. לכוון את עוצמת הקול של המדיה על סמך את משך הניסוי הזרימה ואת מספר התאים נזרע.
    10. להביא מערכת loop הזרימה שהורכב המשאבה על החוף. המקום הצינור הקשיח #13 (משאבת אבובים) לראש המשאבה ואבטח אותו. פתח את stopcocks.
    11. הפעל את המשאבה ולאחר לאט להגדיל את מהירות המשאבה. תן את המדיה לזרום דרך מערכת loop. בדוק כל דליפה או חסימה (למשל, הצטברות הלחץ). ודא כי המדיה זורם בחזרה למאגר המים.
  3. הקמה של ההרכבה קאמרית זרימה
    1. מקום 1/8" הנשי סכינים סטריליים בקצה אחד של 16 # רכים צינור וצירוף של צימוד 4-way. לצרף את קצה הצינורית חינם לצד הנכון של הפלטה (תזרים בצד).
    2. מקום 1/8" זכר סכינים סטריליים בקצה אחד של 16 # רכים צינור וצירוף של צימוד 4-way. לצרף את קצה הצינורית חינם בצד שמאל של הפלטה (יצוא בצד).
    3. מקום 1/8" סכינים סטריליים זכר ו- 1/8" הנשי סכינים סטריליים בקצה אחד של צינור רך #16 (בועה מלכודת צינורות). לצרף את הצנרור בועה השמנה באמצעות "1/8 זכר סכינים סטריליים. צימוד 4-way לצרף הקצה השני של צינורות דרך "1/8 סכינים סטריליים הנשי.
    4. באמצעות פינצטה סטרילי, להעביר השקופית נזרע תא זכוכית מתוך קערה התרבות התא 4-ובכן ההפסקה על צלחת התחתון. ודא שפונה מעלה, לצד נזרע תא של השקופית זכוכית.
    5. באמצעות מזרק 10-mL, להוסיף 10 מ של מדיה חמה צלחת התחתון בתוך הקו האדום אטם סביב הצלחת. לאפשר את מדיה זורמת דרך השקופית בלבד לכסות את התאים. הימנע הוספת מדיה ישירות על גבי השקופית.
    6. הנח בעדינות את הפלטה על צלחת התחתון, יישור מצד אחד לשני. הימנע המבוא של בועות אוויר. בורג הלוחות יחדיו באופן הדוק.
    7. להסיר בועות אוויר מן המלכודת בועה על-ידי פתיחה של צימוד מצד ימין (תזרים) של הצלחת ומרוקן בעדינות 20 מ של מדיה חמים באמצעות מזרק 30-mL. ודא שצימוד בצד שמאל (יצוא) של הצלחת סגורה כי התקשורת הוא זורם דרך צימוד מלכודת בועות (פתוח). למחוק את התקשורת סמוקות.
    8. לסגור את צימוד על המלכודת בועה ולפתוח את צימוד בצד שמאל (יצוא) של התא. לרומם בצד שמאל (יצוא) של התא כדי בזווית של 45° ותוציאו בעדינות 20 מ של מדיה חמים באמצעות מזרק 30-mL מצד ימין (תזרים) של התא כדי להסיר בועות אוויר מן החדר. בועות, ניתן לאבחן דרך החלון. למחוק את התקשורת סמוקות.
    9. לסגור את stopcocks משני הצדדים של הקאמרית, קאפ. לבדוק את התאים על ידי מיקרוסקופ.
    10. תחבורה התא אל החוף עם מערכת loop שהורכב בעבר.
    11. לאט לאט להאט את מהירות המשאבה, להשהות את המשאבה. לסגור את stopcocks על מערכת loop זרימה כדי למנוע דליפה.
    12. התחבר התא, לולאה מערכת יחד דרך stopcocks. פתח את כל stopcocks.
    13. אט-אט להגדיל את מהירות המשאבה ולבחון את הסידור בגין כל דליפה או חסימה. ודא שהמדיה מסתובב בכיוון אחד וחוזר אל המאגר.
    14. מניחים את חיישן הזרימה על הצנרת 'קאמרית bridge' ממוקם בצד תזרים של התא. ודא כי החיישן הוא מונחה כראוי בכיוון של זרימה.
    15. כוון את מהירות המשאבה כדי לקבל קצב הזרימה זה מחושב בעבר, בהתבסס על הלחץ ההטיה הרצויה.
      הערה: קצב הזרימה עשוי להשתנות בהתאם הגובה ואת הרוחב של כל חדר, כמו גם את צמיגות של המדיה.
    16. להפעיל את הטנק2 CO כדי להשיג 5% CO2 ומניחים על מגש מים בתוך החוף.

8. קציר של תאים החילוץ של RNA מן החדר זרימה

  1. לאחר סיום תקופת הזמן הרצוי של זרימה, לאט להנמיך את מהירות משאבת סחרור ל- 0, מכבה את החשמל. לסגור את כל stopcocks פתוחים ובמהירות להסיר את התא ואת הצנרת המצורפת עם צימוד בכל קצה.
  2. לקחת את החדר benchtop נקי, בעדינות להתיר כל הברגים כדי להסיר את הפלטה. באמצעות פינצטה פינצטה, להסיר את השקופית זכוכית צלחת התחתון ומניחים אותו לתוך תבשיל תרביות רקמה של קוטר 100 מ מ.
  3. לשטוף את השקופית הכוללת 10 מ ל תמיסת מלח קרות באגירה פוספט (PBS)- / - וסמנו את התאים במיקרוסקופ כדי לאשר תא הדבקות ויישור בכיוון של זרימה.
  4. האחות של PBS מהצלחת ולהעביר את השקופית צלחת בקוטר 100 מ מ נקי. הוסף µL 350 פירוק מאגר החילוץ RNA קיט (ראה טבלה של חומרים), המכילה 1/100 מערכו של בטא-mercaptoethanol, לשקופית.
    התראה: להוסיף בטא-mercaptoethanol בשכונה fume כימי.
  5. לגרד את התאים מחוץ לשקופית באמצעות המגרד של התא פוליאתילן להבים. להטות את המנה תרביות רקמה, המאפשר את הנוזל למאגר בתחתית, ולהסיר את השקופית זכוכית עם מלקחיים. Pipette תא lysate לתוך צינור 1.5-mL ולשמור אותו בקרח.
  6. לדלל התייחסות אקסוגני מניות RNA (לוציפראז RNA) 0.0025 ng/µL באמצעות דילול טורי לפני הוספתו לפקודה המדגם. לדוגמה, אם ריכוז מניות µg 1/µL, לדילול 1/400,000 נדרש בכדי להגיע 0.0025 ng / µL. µL להוסיף 10 של מדולל לוציפראז RNA כל מדגם של תא lysate בידוד RNA במורד הזרם וניתוח.
  7. להמשיך עם פרוטוקול החילוץ RNA לפי הוראות היצרן, או להקפיא את lysate ב-80 מעלות צלזיוס עד תוכל להמשיך עם מיצוי.

9. חישוב של היעילות של החילוץ-RNA ו- cDNA סינתזה

הערה: לחשב את היעילות לוציפראז לאחר RT-qPCR על-ידי השוואת התשואה התיאורטית, התשואה ניסיוני.

  1. לקבוע את התשואה התיאורטית של לוציפראז RNA.
    1. לקבוע את הסכום הכולל של עותקים לוציפראז הוסיף לדגימה. (הוספת 0.025 ng/דגימה = 2.73 x 107 עותקים של לוציפראז RNA לדגימה לפני חילוץ רנ א.)
    2. לחשב את המסה המולקולרית של לוציפראז RNA באמצעות של מסה מולקולרית ממוצעת לכל נוקלאוטיד של 330 גרם/מול ו הכפלתו באורך של גחלילית לוציפראז RNA, 1652 נוקלאוטידים.
    3. לחלק את כמות לוציפראז RNA הוסיף (0.025 ng) עבור כל דגימה לפני החילוץ-RNA על ידי המסה המולקולרית להניב את הכמות טוחנת. לאחר מכן, להכפיל את זה ב מספר אבוגדרו של להניב את העותקים הוסיף לדגימה.
    4. לחשב את התשואה התיאורטית של העותקים לוציפראז עבור כל תגובה RT-qPCR באמצעות המשוואה:
      figure-protocol-2
  2. לחשב את התשואה ניסיוני עבור ההעתקים לוציפראז עבור כל תגובה RT-qPCR באמצעות פלסמיד לוציפראז ליצירת עיקול רגיל עבור RT-qPCR.
  3. לחשב את היעילות לוציפראז (%) באמצעות המשוואה:
    figure-protocol-3

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

לינאריזציה מוצלחת של פלסמיד לוציפראז באמצעות אנזימי הגבלה אושר על-ידי מוצרי מתעכל פועל על ג'ל agarose (איור 1). הגודל של המוצר ליניארית אושר באמצעות סולמות DNA ו by comparison with פלסמיד נימולים.

לנו יש להתאים את הסידור קאמרית במקביל-plate זרימה של ליין. et al. 9 לניסויים הדורשים תנאים מרובים/טיפולים עם גזירה או גזירה תנאים מרובים. אנו משתמשים סביבה ייעודי, החוף, אש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מאמץ גזירה הוא מצב הפיזיולוגיות ממיקרו הפונקציה אנדותל, בחלקו, על-ידי המשפיעים על מצב יציב ג'ין ביטוי2,5. מודלים של הכונה בתנאים שונים של גזירה יתרום להבנה גדולה יותר של פונקציית אנדותל. זרימת עבודה מעשית זו כוללת מעגל זרימה באמצעות תא הזרימה במקביל-plate מקורי ליין. et al. 9 , מייצג למינריות, שאינם פועמת זרימה. הסידור הכללי נועדה להקל על הניסויים אשר דורשים תאי זרימה מרובים ולצמצם את השתנות ניסיוני בהגדרה זו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי CIHR מגב 142307 P.A.M. H.S.J.M. הוא הנמען של קנדי מוסדות של הבריאות מחקר תוכנית אימונים במלגת רפואה רגנרטיבית. H.S.J.M., A.N.S., K.H.K. ו- M.K.D. הם הנמענים המלכה אליזבת השנייה לתואר שני מלגות המדע והטכנולוגיה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.05% Trypsin-EDTAgibco25300-062
10 מ"ל מזרקBD302995
10 מ"מ2 צלחת תרבותSarstedt83.3902
30 מ"ל מזרקBD302832
4 כיווני StopcocksדיסקופיקסD500
רדיד
BEACHDarwin Chambers CompanyMN: HO85, SN: 4947549
מגרדי
CO2 מטרBioSphenix, Ltd.MN: P120, SN: 0342
CO2 חיישןBioSphenix, Ltd.MN: C700, SN: 52852
מים מזוקקיםgibco15230-170
תמיסת מלח חוצצת פוספט של Dulbecco (DPBS) -/-gibco14190-144
גידול תאי אנדותל בינוני 2תא פרומוC-22011
צמיחת תאי אנדותל בינוני 2 תוסף תערובת תוספיםפרומוC-39216
פיברונקטין (טהור)11051407001
(0.20 אום)Sarstedt83.1826.001
בולם זרימה ו-CapU of T חנות
מד זרימה: 400 SeriesConsole Transonic Scisense Inc.T402
מסדרת 400Scisense Inc.מאגר זרימה TS410
ו-CapU של חנות
חיישן זרימהTransonic Scisense Inc.ME4PXL
Isotemp 737F תנורפישר סיינטיפיקFI-737F
J בדJ
בד מיקרוסקופ שקופיות (25 x 75 x 1 מ"מ)Fisherfinest12-544-4
נרתיק עיקור ניירמשאבת Cardinal Health92713
(Masterflex L/S Economy Drive)Cole-Parmer7554-90
ראש משאבה (Masterflex L/S Easy Load)Cole-Parmer7518-00
מלבני 4 בארות צלחתתרמו מדעי267061
פינצטה
<חזק>שם<חזק>חברה<חזק>מספר קטלוגי<חזק>הערות
<חזק>צינורות
Masterflex C-Flex L/S 25 צינורות רכיםCole-Parmer06424-25
Masterflex C-Flex L/S 14 צינורות רכיםCole-Parmer06424-14
Masterflex C-Flex L/S 16 צינורות רכיםCole-Parmer06424-16
Masterflex PharMed BPT L/S 13 צינורות קשיםCole-Parmer06508-13
Masterflex PharMed BPT L/S 14 צינורות קשיחיםCole-Parmer06508-14
שםCompanyCatalog NumberComments
<strong>
3/16" זכר LuerCole-Parmer45518-08עבור צינורות #25
1/8 אינץ' זכר LuerCole-Parmer30800-24עבור #16 צינורות
1/8 אינץ' נקבהLuer Cole-Parmer30800-08עבור #16 צינורות
1/16 אינץ' זכר LuerCole-Parmer45518-00עבור #14 צינורות
1/16 אינץ' נקבה LuerCole-Parmer45508-00עבור #14 צינורות
שםחברה<חזק>מספר קטלוגי><חזק>הערות
><חזק>ריאגנטים נוקדאון
אוליגופקטמין ריאגנטInvitrogen12252-011
Opti-MEM I סרום מופחתבינוני gibco31985-070
שם< strong>CompanyCatalog NumberComments
in vitro שעתוק
Generuler 1kb+ סולם DNAThermo ScientificSM1331
MEGAclear KitAmbionAM1908
mMESSSEGE mMACHINE SP6 ערכת תמלולאמביוןAM1340
pSP-luc +PromegaE4471
סולם DNA מפותל סופרניו אינגלנד BioLabs Inc.N0472S
UltraPure AgaroseInvitrogen16500-500
UltraPure Ethidium BromideInvitrogen15585011
XhoI אנזים הגבלהניו אינגלנד BioLabs Inc.R0146S
שםחברהמספר קטלוגיתגובות
RNA מיצוי
בטא-מרקפטואתנולSigmaM3148-100mL
RNeasy Mini KitQiagen74104
אלומיניוםתאים תא מסנן סיגמא-אולדריץ'ניפוח זכוכיתמד זרימה : צינורות טרנסוניקניפוח זכוכית T

מקורות

  1. Aird, W. C. Endothelial cell heterogeneity. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (1), (2012).
  2. Baeyens, N., Bandyopadhyay, C., Coon, B. G., Yun, S., Schwartz, M. A. Endothelial fluid shear stress sensing in vascular health and disease. Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 821-828 (2016).
  3. Garcia-Cardena, G., Comander, J., Anderson, K. R., Blackman, B. R., Gimbrone, M. A. Biomechanical activation of vascular endothelium as a determinant of its functional phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (8), 4478-4485 (2001).
  4. Cybulsky, M. I., Marsden, P. A. Effect of disturbed blood flow on endothelial cell gene expression: a role for changes in RNA processing. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (9), 1806-1808 (2014).
  5. Man, H. S. J., et al. Angiogenic patterning by STEEL, an endothelial-enriched long noncoding RNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2401-2406 (2018).
  6. Won, D., et al. Relative reduction of endothelial nitric-oxide synthase expression and transcription in atherosclerosis-prone regions of the mouse aorta and in an in vitro model of disturbed flow. The American Journal of Pathology. 171 (5), 1691-1704 (2007).
  7. Baeyens, N., et al. Vascular remodeling is governed by a VEGFR3-dependent fluid shear stress set point. eLIFE. 4, 04645(2015).
  8. Davies, P. F., Civelek, M., Fang, Y., Fleming, I. The atherosusceptible endothelium: endothelial phenotypes in complex haemodynamic shear stress regions in vivo. Cardiovascular Research. 99 (2), 315-327 (2013).
  9. Lane, W. O., et al. Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress. Journal of Visualized Experiments. (59), 3349(2012).
  10. Gray, K. M., Stroka, K. M. Vascular endothelial cell mechanosensing: New insights gained from biomimetic microfluidic models. Seminars in Cell and Developmental Biology. 71, 106-117 (2017).
  11. Bussolari, S. R., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. Apparatus for subjecting living cells to fluid shear stress. Review of Scientific Instruments. 53 (12), 1851-1854 (1982).
  12. Resnick, N., Gimbrone, M. A. Hemodynamic forces are complex regulators of endothelial gene expression. The FASEB Journal. 9 (10), 874-882 (1995).
  13. Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis. The Journal of the American Medical Association. 282 (21), 2035-2042 (1999).
  14. DeStefano, J. G., Xu, Z. S., Williams, A. J., Yimam, N., Searson, P. C. Effect of shear stress on iPSC-derived human brain microvascular endothelial cells (dhBMECs). Fluids and Barriers of the CNS. 14 (1), 20(2017).
  15. Thormar, H. G., et al. Importance of the efficiency of double-stranded DNA formation in cDNA synthesis for the imprecision of microarray expression analysis. Clinical Chemistry. 59 (4), 667-674 (2013).
  16. Johnston, S., Gallaher, Z., Czaja, K. Exogenous reference gene normalization for real-time reverse transcription-polymerase chain reaction analysis under dynamic endogenous transcription. Neural Regenation Research. 7 (14), 1064-1072 (2012).
  17. Vaughan-Shaw, P. G., et al. A simple method to overcome the inhibitory effect of heparin on DNA amplification. Cellular Oncology (Dordrecht). 38 (6), 493-495 (2015).
  18. Collins, C., et al. Haemodynamic and extracellular matrix cues regulate the mechanical phenotype and stiffness of aortic endothelial cells. Nature Communications. 5, 3984(2014).
  19. Fichtlscherer, S., et al. Circulating microRNAs in patients with coronary artery disease. Circulation Research. 107 (5), 677-684 (2010).
  20. Smith, R. D., Brown, B., Ikonomi, P., Schechter, A. N. Exogenous reference RNA for normalization of real-time quantitative PCR. Biotechniques. 34 (1), 88-91 (2003).
  21. Kohn, J. C., et al. Cooperative effects of matrix stiffness and fluid shear stress on endothelial cell behavior. Biophysical Journal. 108 (3), 471-478 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

RNARNAPCR
ניתוח ביטוי גנטי של תאי אנדותל נחשף להטיית מתח באמצעות מרובות במקביל-plate זרימה צ'יימברס
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.