השיטה הכמותית האוטומטית לקביעת שיעורי הסינתזה של חלבון מוחי בVivo

סיכום

סינתזה חלבונים היא תהליך ביולוגי קריטי עבור תאים. במוח, זה נדרש עבור שינויים גמישים. מדידת שיעורי סינתזה של חלבון במוח שלמה מחייבת שיקולים מתודולוגיים זהירים. כאן אנו מציגים את L-[1-¹⁴ג]-השיטה האוטומטית לאוצין כמותי לקביעת שיעורי הסינתזה של חלבון מוחי בvivo.

תקציר

סינתזה חלבון נדרש לפיתוח ותחזוקה של תפקוד עצבי והוא מעורב שינויים גמישים במערכת העצבים. יתר על כן, הוא חשב כי דיסתקנה של סינתזה חלבון במערכת העצבים עשוי להיות פנוטיפ ליבה בכמה הפרעות התפתחותיות. מדידה מדויקת של שיעורי סינתזה חלבון מוחין במודלים בעלי חיים חשוב להבנת הפרעות אלה. השיטה שפיתחנו תוכננה להיות מיושמת על חקר בעלי חיים מתעוררים ומתנהגים. זוהי שיטת אדיקסוגרפית כמותית, כך שהיא יכולה להניב שיעורי בכל אזורי המוח בו זמנית. השיטה מבוססת על שימוש בחומצת אמינו מנותב, L-[1-¹⁴ג]-לאוצין, ודגם קינטי של התנהגות ה-L-לאוצין במוח. בחרנו L-[1-¹⁴ג]-לאוצין כעוקב כי זה לא מוביל למוצרי חילוף חומרים חיצוניים עם תוויות. הוא משולב בחלבון או במהירות מטבוליזם כדי להניב ¹⁴CO₂ אשר מדולל בבריכה גדולה של ושות בלתי מתויג₂ במוח. השיטה ואת המודל גם לאפשר את התרומה של לאוצין בלתי מסומן נגזר רקמות פרוטפוליזיס של רקמת הבריכה מקודע לסינתזה חלבון. השיטה יש את הרזולוציה המרחבית כדי לקבוע את שיעורי סינתזה החלבון בתא ושכבות נוירופיל, כמו גם היפותלמי וגרעיני עצבי הגולגולת. כדי לקבל נתונים כמותיים אמין ולאחר, חשוב לדבוק בפרטים פרוצדורליים. כאן אנו מציגים את ההליכים המפורטים של השיטה האוטומטית הכמותית-[1-¹⁴ג]-שיטת לאוצין לקביעת שיעורי הסינתזה של החלבון בvivo.

מבוא

סינתזה חלבון הוא תהליך ביולוגי חשוב הנדרש עבור שינוי לטווח ארוך מסתגלת במערכת העצבים¹. מעכב הסינתזה של חלבון חוסם לטווח ארוך אחסון זיכרון בשני חסרי חוליות ובעלי חוליות². סינתזה של חלבון היא חיונית לתחזוקת השלבים המאוחרים של כמה צורות של הפוטנציאל לטווח ארוך (ltp) ודיכאון לטווח ארוך (בע מ)³, הישרדות עצבית במהלך פיתוח⁴, ולתחזוקה כללית של העצב וה חיבורים סינפטית⁵. מדידה של שיעורי סינתזה חלבון המוח עשוי להיות כלי חשוב שבו ללמוד שינויים גמישים, כמו גם הפרעות נוירותפתחותיות והפרעות הקשורות ללמידה וזיכרון.

פיתחנו שיטה לכמת שיעורי סינתזה חלבון מוחין בvivo בחיה ערה המציעה יתרונות הטבועות על פני טכניקות אחרות הערכת שיעורי vivo ex או ההכנות מחוץ לבית של רקמת המוח⁶. בראש ובראשונה, תחולתה למדידות במוח השלם בבעל חיים ער. זהו שיקול מפתח כי זה מאפשר מדידות עם מבנה סינפטית תפקוד במקום וללא חששות לאחר השפעות לאחר המוות. כמו-כן, הגישה האוטומטית הכמותית שאנו מעסיקים משיגה מידה גבוהה של לוקליזציה מרחבית. בעוד האנרגיה של ¹⁴ג הוא כזה שאנחנו לא יכולים להתאים את מכשיר המעקב ברמה subcellular או הסלולר, אנחנו יכולים למדוד את התעריפים בשכבות התא ואזורי מוח קטנים כגון גרעיני היפותלמי, עם בערך 25 יקרומטר רזולוציה⁷.

אתגר אחד של מדידות vivo עם רדיומשדרים היא להבטיח כי radiolabel נמדד הוא במוצר של תגובת הריבית ולא הגיבו מקודדד או מוצרים אחרים מטבולית המסומנים בתווית⁶. בחרנו L-[1-¹⁴ג]-leucine כמו חומצת אמינו מעקב כי הוא משולב בחלבון או במהירות מטבוליזם כדי ¹⁴CO_2, אשר מדולל בבריכה גדולה של שיתוף בלתי מתויג₂ במוח כתוצאה משיעור גבוה של חילוף חומרים אנרגיה⁸. יתר על כן, כל ¹⁴ג ' לא משולבים לחלבון קיים בעיקר בחינם [¹⁴ג]-leucine, אשר במשך התקופה 60 min ניסיוני, הוא כמעט לחלוטין נקי מן הרקמה⁶. חלבונים הם לאחר מכן מקובעים רקמה עם פורמלין ולאחר מכן שטף עם מים כדי להסיר כל חינם [¹⁴ג]-לאוצין לפני האדיגרפיה האוטומטית.

שיקול חשוב נוסף הוא הנושא של דילול הפעילות הספציפית של בריכת חומצת אמינו מקודמת על ידי חומצות אמינו ללא תווית הנגזרות רקמות פרוטפוליזיס. הצגנו כי בעכברוש מבוגר עכבר, על 40% של בריכת לאוצין מקודמן לסינתזה חלבון במוח מגיע חומצות אמינו נגזר התמוטטות חלבונים⁶. זה חייב להיות כלול בחישוב של שיעורי האזור של סינתזה חלבון מוחין (rCPS) ויש לאשר במחקרים שבהם קשר זה עשוי להשתנות. הבסיס התיאורטי וההנחות של השיטה הוצגו בפרוטרוט במקומות אחרים⁶. במאמר זה, נתמקד בסוגיות הפרוצדוראליות של יישום מתודולוגיה זו.

שיטה זו הועסק לקביעת rcps בסנאים הקרקע⁹, כבשים¹⁰, רזוס קופים¹¹, חולדות^12,13,14,15,^{16 ,} מיכל ^{בן 17 ,} מיכל ^{בן 18 ,} מיכל ^{בן 19 ,} מיכל בן ^{20 , 21}, מודל העכבר של מורכב טרשת מורכבת²², מודל עכבר של תסמונת X שביר^23,24,25,26, שברירי X עכברים מוטציה²⁷, ו מ העכבר דגם של פנילקטונוריה²⁸. בכתב יד זה, אנו מציגים את ההליכים למדידה של Rssl עם vivo האוטומטי-[1-¹⁴ג]-שיטת הלוצין. אנו מציגים את השוכרים באזורי. המוח של עכבר שליטה ער אנו גם להדגים כי בניהול vivo של anisomycin, מעכב של תרגום, ביטול סינתזה חלבון במוח.

פרוטוקול

הערה: כל הליכי בעלי החיים אושרו על ידי המכון הלאומי לטיפול בבעלי חיים בריאות הנפש והשתמש הוועדה ובוצעו על פי המוסדות הלאומיים של הנחיות בריאות על הטיפול והשימוש בבעלי חיים.

מבט כולל על הפרוטוקול מוצג באיור 1.

1. קטטרים השתל בניתוח בווריד הירך ובעורק לניהול מעקב ואיסוף של דגימות דם עורקים מתוזמן, בהתאמה. ניתוח מוחלט לפחות 22 שעות. לפני הניהול של המעקב . ניתוח דורש בערך 1 להשלים

1. לאסוף את החומרים הדרושים: מכשירי ניתוח סטרילי (מספריים כירורגי, מיקרו מספריים, מלקחיים, שלושה ווים כירורגיים), ציוד עבור הרדמה isofלוריאן (מכשיר אידוי, גז פעיל, פח הרדמה אטום, הרדמה קונוס האף), השלב ניתוח סטרילי, קוצץ פרווה, 70% אתנול, בטדין, גזה סטרילית, סרט כירורגי, מחממי ידיים מסחרי, מיקרוסקופ כירורגי, סטרילי 0.9% נתרן כלוריד (מלוחים), סטרילי הפארין 100 USP יחידות/mL ב 0.9% נתרן כלוריד (heparinized) תמיסת מלח), מעוקר 5 20-cm רצועות של 6-0 ספיגה נספג, מעוקר 25-ס מ קווצות של PE-8 ו-PE-10 צנתרים פוליאתילן עם קצה אחד לחתוך ב 45^o, סטרילי 1 cc מזרקים, סטרילי 32 למדוד מחטים, ציוד קאטרי, סטרילי 15-20 ס"מ החלול אל חלד מוט פלדה (2.5 מ"מ קוטר בפנים, 3 מ"מ קוטר בחוץ), הרדמה מקומית (bupi, ומשחה לידוקאין), ו מארז בעלי חיים עם הגדרת הנספח המסתובב (30 ס מ האביב באמצעות הכפתור, סיבוב, סיבוב הר וזרוע, 20 X 13 ס מ גליל ברור מכל).
2. . הכן את בעל החיים לניתוח
3. להבטיח כי השיטות הנאות וסטרילי משמשים כנדרש על ידי המוסד שלך.
   1. . שוקלים את החיה בעל החיים חייב להיות לפחות 25 גרם לניתוח מוצלח.
   2. מניחים את החיה בתוך תא פלקסיגלס אטום ומחבר את החדר למנגנון ההרדמה isofלוריאן. הגדר את קצב הזרימה ל 2.5 L/min עבור זכרים ו 3.0 L/min עבור נקבות של 1.5% isofלאנה ב O₂. לאחר בערך 2 דקות, להבטיח את העכבר מסומם כראוי על ידי חוסר רפלקס הנסיגה עם צביטה בבוהן.
   3. פעם הרגעה, להסיר את העכבר מן התא ולהניח אותו בתנוחה נוטה עם פניו בתוך קונוס האף הרדמה. להגדיר חרוט האף כדי לקבל גז מן המאאדה ולהחזיר גז לזבל את הגז. הנבלות ייתפסו את. מסנני הפחם בפילטר
   4. השתמש קוצץ לגלח את הפרווה בין להבים הכתף. הקפד לעקר כראוי את האזור מגולח, לסירוגין שלוש פעמים בין הבטאדין לבין חלוק אתנול.
   5. להעיף את העכבר מעל לתוך מיקום פרקדן שמירה על הפנים בקונוס האף. הדבק את הרגל השמאלית לשלב הניתוח והשתמש בקוצץ כדי לגלח פרווה מהירך הפנימית השמאלית אל הבטן השמאלית העליונה. הקפד לעקר כראוי את האזור מגולח, לסירוגין שלוש פעמים בין הבטאדין לבין חלוק אתנול.
   6. שקופית מחמם ידיים זמין מסחרית שהופעלה, עטוף גזה, מתחת לעכבר. הקלטת את הרגל הימנית. על שלב הניתוח
4. . הכנס צנתר לווריד הירך השמאלי
   1. בעזרת מיקרוסקופ ניתוחי, השתמש במספריים כירורגיים כדי לבצע חתך של 1 ס מ מהחלק המדיאלי העליון של הירך השמאלית לכיוון האמצע, חשיפת עורק הירך והווריד.
   2. למשוך עור רופף עם ווים העור כירורגי כדי לחשוף עוד יותר את שלפוחיות.
   3. החל סטרילי 0.9% נתרן כלוריד לשטח חשוף כדי לשמור על לחות נאותה.
   4. באמצעות מלקחיים כדי לנתח בוטה, הפרדת רקמת החיבור סביב חלק קטן של עורק הירך והווריד. בזהירות, הפרד את העורק והווריד (איור 2).
   5. השתמש מלקחיים כדי חוט מגדיל אחד של תפר נספג (סטרנד) תחת שני וריד הירך והעורק בנקודה הצדדית ביותר של החתך. , משוך את התפר בחצי הדרך. כך שקצותיו יהיו שווים
   6. בנקודה הטובה ביותר אל המפשעה, השתמש מלקחיים כדי חוט תפר שני (סטרנד ב) תחת רק את וריד הירך. לקשור בעדינות חצי קשר שישמש כדי להגביל את זרימת הדם.
   7. בנקודה בין סטרנד ו סטרנד, להשתמש מלקחיים כדי חוט תפר שלישי (סטרנד C) תחת רק וריד הירך. לקשור בעדינות קשר מלא שישמש כדי להגביל את זרימת הדם. . תיזהר לא לקרוע את הווריד
   8. בעדינות למשוך על סטרנד ב להגביל את זרימת הדם. השתמש בהדימום כדי למשוך בעדינות את סטרנד ב כדי לשמור על זרימת דם מוגבלת.
   9. חותכים חור קטן באזור המוגבל של וריד הירך עם מיקרו מספריים ובזהירות להכניס את הקצה הזוויתי של צינורות PE-8 (שרוקן בעבר עם הפלין תמיסת מלח) לכיוון סטרנד B. לאחר הכנסתו, שחרר את המתח של סטרנד ב ולהנחות את הקטטר במעלה הווריד. תהדק את סטרנד מסביב. לווריד שמכיל את הצנתר
   10. באמצעות סטרנד C, לקשור קשר נוסף סביב הקטטר. ודא שהקשר זה אינו תופס את עורק הירך.
   11. בעדינות למשוך חזרה על חבית מזרק למלא באופן חלקי אבובים עם דם כדי להבטיח את הקטטר הושתל כראוי.
5. בעקבות אותו ההליך, להכניס צנתר PE-10 לעורק הירך השמאלי.
6. . הליך כירורגי מלא
   1. ברגע שני וריד הירך ואת העורקים העורק כבר מאובטח, עניבה סטרנד לתוך קשר סביב שני קטטרים.
   2. חותכים את כל התפרים עודף ולהסיר ווים העור. לשטוף את קטטר העורקים עם המלח heparinized כדי למנוע קרישה. לצרוב את קצות שני הקטטרים כדי ליצור חותם.
   3. מניחים את העכבר בתנוחה נוטה לעשות חתך קטן בבסיס הצוואר ולהחיל תמיסת מלח על האזור חשוף.
   4. . מחתך הצוואר ועד לחתך הירך נחש את הקטטרים דרך המוט החלול והחוצה מחתך הצוואר. . הסר את המוט החלול השתלת קטטרים משנית תמנע מעכברים להזיק לקטטרים.
   5. החלת בופיטין לצידי הפצע. . תסגור את חתך הירך עם תפר תוסיף משחה לידוקאין. מעל פצע סגור
   6. הנחש את הקטטרים דרך שפופרת החלול 30 ס מ (האביב באמצעות) ותפר את הכפתור של הקפיץ מתחת לעור. החלת בופיטין לצידי הפצע. תפר את הכפתור של הקפיץ מתחת לעור. תוסיף משחה לידוקאין. מעל פצע סגור
   7. להזיז את העכבר לתוך מיכל גלילי ברור (20 ס"מ גבוה, 13 ס"מ קוטר) עם הר מסתובב וזרוע לבית החיה בתקופת ההחלמה. מניחים מחמם ידיים מתחת למיכל כדי לשמור על החיה חמה.
   8. לעזאזל על החלק העליון של האביב להסתובב מסתובב ולאבטח את הסיבוב אל הזרוע המסתובב מוצמד המיכל גלילי. ודא שלעכבר יש טווח תנועה מלא וניתן לגשת לקטטרים.
   9. מניחים מכסה משופע שאינו מפריע למנגנון המסתובב על המתחם החי. עיין באיור 3 עבור הכיוונון המלא.
   10. לאפשר לעכבר להתאושש. מומלץ לפחות 22 שעות.

2. להכין את L-[1-¹⁴ג] הפתרון הלוצין להזרקה 16% (w/v) 5-sulfosalicylic חומצה (SSA) מייבשים פתרון עבור דגימות פלזמה deproteinizing. בפתרון SSA, כולל גם 0.04 mM norleucine ו-1 μCi/mL [H³] leucine כתקנים פנימיים עבור ניתוח חומצת אמינו ניתוח של ריכוז מעקב בשברים פלזמה מסיסים בחומצה, בהתאמה. אחסן את ה-SSA עד חודשיים ב -4 ° c.

1. רכישת מסחרית זמין L-[1-¹⁴ג] לאוצין (50-60 mCi/ממול), אשר נמכר כפתרון ב 2% אתנול או 0.1 N HCl. לפוצץ פעילות ידועה של מכשיר מעקב תחת זרם עדין של חנקן ולהוות מחדש בפתרון של תמיסת מלח רגיל סטרילי עשוי עד לריכוז של 100 μCi/mL.

3. ניהול L-[1-¹⁴ג] לאוצין באופן מידי ואיסוף דגימות דם עורקים.

1. לאסוף את החומרים הדרושים: 18 1.5 mL מיקרוצינוריות עבור דגימות פלזמה מנירוסטה (להוסיף 70 mL של מים מיוהים לכל צינור), 17 250mL בקבוקון זכוכית מוסיף (15 מוסיף לאוסף של דגימות דם עורקים 2 מוסיף עבור אוסף של דם שטח מת להיות . מוזרק מחדש כדי להגביל את האוסף של דם עודף ומיותר, קטן, דק בקבוקון זכוכית מוסיף עם תחתונים מחודדות המאפשרים ליטוף נגיש של פלזמה סופרנטאנט מומלץ), 2 צינורות מיקרוקפילר (32 X 0.8 מ"מ, למדידת המטקריט), 1 הפארין ו ליתיום פלואוריד-מצופה שפופרת מיקרוצנטריפוגה (כדי למנוע קרישה וגליקולזיס, בהתאמה), הומוסטטיסטיקה (לכסות את הטיפים עם אבובים tygon כך מלחציים לא יזיק לצינורות PE), הגלוקוז דם צג, לחץ דם מתמר, 1 mL מזרקים סטרילי (עבור הריקות מלוחים), ופתרון המתת הרדמה מסחרית (מדולל 1:1 במים המליחים (עבור עכברים)).
2. ודא שהחיה נמצאת במצב פיזיולוגי רגיל בתחילת הניסוי.
   1. קלאמפ צינורות העורקים על 2 ס מ מהסוף לחתוך את הקצה, יצירת פתיחה לדם לזרום. לאחר מכן unclamp אבובים ולאסוף דם החלל המתים ((30 מ ל) כדי לאסוף כל מלוחים שיורית ו/או דם מן הקודם מצייר), ו, בצינור נפרד, לאסוף דגימת בקרה (כ. 30 μL), דגימות המטוקריט (כמחצית הנפח שפופרת נימי), ו גלוקוז (כ-20 μL).
   2. מדידת המטוקריט על ידי חיבור קצה אחד עם מרק איטום וצנטריפוגה עבור 1 דקות ב 4500 x g. למדוד את היחס של עוצמת הקול של תאים אדומים לנפח הדם הכולל. אם לחיה יש המטוקריט מתחת ל -30%, אל תמשיך במחקר.
   3. השתמש בצג הגלוקוז בדם זמין מסחרית כדי למדוד את רמת הגלוקוז בטיפת דם.
   4. בקרת צנטריפוגה מדגם עבור 2 דקות ב 18,000 x g כדי להפריד פלזמה. בדיקות פלסמה deproteinize כדלקמן: להוסיף 5 μL של פלזמה כדי 70 μL של מים הממוכי ב 1.5 mL microtube, להוסיף 25 μL של 16% הפתרון SSA מערבולת. הניחו על הקרח 30 דקות לפני ההקפאה על הקרח היבש.
   5. החזר דם החלל המתים אל החיה דרך קו הורידים, ואחריו סומק מלוחים heparinized כדי למנוע אובדן עודף דם.
   6. לחבר את קו העורקים מתמר לחץ דם למדוד מתכוון לחץ דם עורקי.
   7. לאחר נטילת דגימות להיות בטוח מחדש להדק את הקו העורקי ולשטוף את הקו עם קטן (50 mL) נפח של תמיסת מלח heparinized.
3. מעקב באופן מידי ואיסוף דגימות דם עורקים מתוזמן.
   1. השתמש במחבר Y כדי לצרף מזרק אחד עם מעקב (100μCi/ק"ג) ומזרק אחד עם 50 מ"ל מלוחים סטרילי כדי לרוקן את קו הורידים לאחר הזרקת מעקב. חבר את המחבר Y לקו הורידים.
   2. הפעל את המחקר על ידי הפעלת בו שעון עצירה והזרקת המעקב. ריקון קו הורידים עם תמיסת מלח (100mL) מיד לאחר ההזרקה.
   3. לאסוף דגימות דם 1-7 ברציפות במהלך 2 הדקות הראשונות של הניסוי באותו אופן. לאחר איסוף המדגם השביעי, לאסוף 30 מטרים μL החלל דם לפני כל מדגם שנותר. דגימות 8-14 נאספים ב 3, 5, 10, 15, 30, 45, ו 60 דקות, בהתאמה.
   4. עבד דגימות דם מיד לאחר האיסוף, כפי שתואר עבור דגימת הבקרה. , אם יש עיכוב. הניחו את הדגימות על הקרח הכנס בזהירות דם חלל מתים לתוך העורק דרך קטטר העורקים וסומק עם הפארין תמיסת מלח.
   5. בשלב מסוים במהלך הניסוי, תהליך שלושה סטנדרטים פנימיים על ידי הוספת 25 μL 16% SSA, 0.04 mM norleucine, ו 1 mCi/mL [³H] leucine כדי 75 μl מים, מערבולת ומקום על הקרח.
   6. לאחר איסוף המדגם ה -14 ב 60 דקות, הכנס כ-0.2 מ ל המתת-הרדמה-D לתוך קו הורידים כדי להרדים את החיה. . להקליט את שעת המוות
   7. להוציא את החיה מההר המסתובב ולהסיר ממתחם החיות. הסר בזהירות את המוח, הניחו על רדיד אלומיניום, והקפא על קרח יבש. לא להקפיא מוח עם חנקן נוזלי כמו מוח עלול לפצח. המוח בחנות, דגימות, ותקנים פנימיים ב-80 ° c עד מוכן לעיבוד. ניתן לבצע עיבוד בכל נקודה לאחר מכן.

4. ניתוח ריכוזי הלוצין והאני-[1-¹⁴ג] לאוצין בדגימות פלסמה.

1. הפשרת דגימות ותקנים פנימיים על קרח, מערבולת, ו צנטריפוגה 18,000 x g עבור 5 דקות ב 2 ° c. שבר סופרנטאנט יכיל את הלוצין ללא התווית והניתן לביטול התווית.
2. העבר 40 μL של הסופרנטאנט לבקבוקון בקבוקון נוזלי והוסף קוקטייל בגוון טעמים. כינור מתפורר לדקה (DPM) של ³H ו- ¹⁴ג באמצעות שלוש הטעמים הנוזליים ועקומת כיבוי המיועדת לתווית בו כפולה בו (³H ו ^-14ג) ספירה.
3. כדי לכמת ריכוזים לאוצין פלזמה, להשתמש במערכת מערכת האבחון עם טור החליפין נתרן לאחר הטור ולאחר עמודה עם או-phthaldehyde זיהוי פלואורומטרי.
   1. הגדר את המפרט למפרטים הבאים: פלואורומטר עירור של 330 ננומטר ופליטה של 465 nm. השלב הנייד מורכב האלואנט נתרן, pH 7.40, ו הנתרן האלואנט + 5% sulfolane, pH 3.15. הגדר את קצב זרימת המאגר של 0.400 mL/min וקצב זרימת הכלי ללעג ל-0.300 mL/min. הגדר את טמפרטורת העמודה ל-48 ° c וטמפרטורת הכור ל45 ° c.
   2. כיול את המערכת עם מגוון ריכוזי חומצות אמינו (כולל נורלוצין) בין 30 ל-500 pmol/10mL. עקומת הכיול היא קווית. ריכוזי חומצות אמינו של בדיקות 10 מ"ל הזרקת הדגימות ליפול בתוך טווחים של עקומת כיול זה.

5. ביצוע האדיגרפיה אוטומטית כמותית.

1. הכינו סעיפים במוח 20 יקרומטר בעובי לאדיגרפיה אוטומטית. מוח מדור באמצעות קריוסטט ב-20 ° c.
2. הפשרת מקטעי מוח סדרתיים. על שקופיות מצופות ג'לטין . האוויר יבש
3. לשטוף שקופיות 5 שינויים של 10% פורמלין עבור 30 דקות לשינוי, ואחריו זרימה רציפה של מים מוהים עבור 1 h. לכסות את השקופיות באופן רופף עם נייר כסף כדי למנוע אבק ולאפשר ייבוש עבור 24 h.
4. מומלץ לארגן שקופיות בקלטת צילום רנטגן (קלטות המתאימות לממוגרפיה של 20x25 ס מ) יחד עם סט של [¹⁴ג] תקני מתילטיאקריל, שהוכשלו בעבר כנגד רקמת הריכוזים הידועים של ¹⁴מילים כ כמתואר²⁹. תקנים ניתן לרכוש מסחרית, אך להבטיח כי הם מכסים מגוון של 2-300 mCi/g של רקמות מכויל כנגד 20 מיקרומטר רקמת עובי. תחת safelight אדום, המקום פיסת סרט ממוגרפיה, בצד אמולסיה למטה, על גבי סעיפים.
5. חותם את הקלטות ומקום בשק שחור ולאחסן בארון במשך 40-45 ימים.
6. פיתוח סרטים לפי כיווני היצרן. הערה: התפתחות הסרט האוטומטי אינה מומלצת מכיוון שהרקע עשוי להיות לא אחיד ויכול להשפיע על כימות.

6. לנתח תמונות.

הערה: תוכנית מסחרית זמין עבור ניתוח תמונה בשילוב עם מצלמת CCD ותיבת אור פלורסנט עם תאורה מומלצת אפילו. הצפיפות האופטית היחסית בסרט המואר מזוהה על ידי מצלמת CCD.

1. בנו עקומת כיול של דחיסות אופטית (OD) v. רקמה ¹⁴C ריכוז המבוסס על הדים של הקבוצה של התקנים מכויל על הסרט. התאם נתונים אלה (כולל הריק או הרקע) למשוואה פולינומיאלית. משוואה פולינומיאלית בדרגה שנייה או שלישית מתאימה מאוד.
2. כדי לנתח אזורי מוח ספציפיים, לאתר את אזור הריבית (ROI) בשישה עד שמונה סעיפים על ידי השוואה עם אטלס המוח. הקלט את ה-ODs של הפיקסלים בתוך ROI בכל המקטעים, ובהתבסס על עקומת הכיול, חשב את הריכוז של הרקמה ¹⁴C בכל פיקסל. לחשב את הרקמה הממוצעת ¹⁴C ריכוז ב-ROI.

7. חישוב של rCPS מחשב rCPS כל ROI באמצעות המשוואה הבאה:

כאשר P * (t) הוא ריכוז הרקמה הממוצעת משוקלל של ¹⁴ג ב ROI, c_p(t) ו-C^*_P(t) הם ריכוזי פלזמה העורקים של לאוצין ומתויג בזמן, t, t הוא הזמן שהחיה מתה ( כ 60 דקות), ו λ הוא שבריר של לאוצין בבריכה קודמן הרקמה שמגיעה מן הפלזמה. הערכה של λ מבוצעת בניסוי נפרד ⁶. λ כבר הוערך ב WT, Fmr1 נוק, tsc^+/-, ו pku עכברים ^6,22,25,28. אם הניסוי כולל שינויים גנטיים או תרופתי שעשויים להשפיע על שיעורי סינתזה חלבונים, השפלה, או חילוף החומרים של leucine, λ יש להעריך תחת התנאים החדשים.

תוצאות

כאן אנו מראים ניסוי מייצג הממחיש את ההשפעות של הממשל הקודם של חלבון סינתזה מעכבי על rCPS. Anisomycin בתמיסת מלח רגיל היה מנוהל מבוגר C57/BL6 זכר פראי-סוג העכבר תת-עורי (100 mg/ק"ג) 30 דקות לפני החניכה של הנחישות rCPS. ההשפעות של הטיפול anisomycin לעומת הרכב מטופלים בקרת בעל חיים להראות כי rCPS הוא כמעט בלתי ניתן לגילוי בעכבר anisomycin מטופלים (איור 4). נתונים אלה מייצגים אימות כי vivo האוטומטי-[1-¹⁴ג]-שיטת לאוצין מודד שיעורי סינתזה של חלבון במוח.<...

דיון

אנו מציגים שיטה כמותית לקביעת שיעורי האזור של סינתזה חלבון מוחין (rCPS) בvivo בבעלי חיים ניסיוניים. לשיטה זו יתרונות ניכרים בשיטות הקיימות: 1. מדידות מועצמות בחיה המתתעוררת, ולכן הן משקפות תהליכים מתמשכים במוח התפקודי. 2. מדידות מושמעות באמצעות כמותי אוטומטי מאפשר את היכולת לקבוע rCPS בכל האזורים ואזורי המשנה של המוח בו זמנית. 3. המודל הקינטי של השיטה לוקח בחשבון את האפשרות של מיחזור של חומצות אמינו ללא תווית שנגזר השפלה חלבון הרקמה ואת השפעתו על הבריכה קודמן עבור סינתזה חלבון⁶.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
עכברים	מעבדת ג'קסון	003024	Fmr1 נוקאאוט זוגות רבייה
Anisomycin	Tocris Bioscience	1290
Microhematocrit Tubes	Drummond Scientific	1-000-3200-H	צינורות נימיים
Critoseal איטום צינורות נימיים	Leica Microsystems	39215003	איטום מרק
זכוכית מוסיף	Agilent	5183-2089	המשמש לאיסוף דגימות דם
Digi-Med Blood Pressure Analyzer	Micro-Med Inc.	מנתח לחץ דם	BPA-400
Bayer Breeze 2 מערכת ניטור סוכר בדם	Bayer Breeze	9570A	מד סוכר
מזרק אטום לגזים	המילטון ושות'.	1710	מזרק זכוכית טוברקולין
HeatMax HotHands-2 מחממי ידיים	HeatMax	דגם HH2	רפידות חימום
Heparin Lock Flush Solution	Fresenius Kabi USA, LLC	504505	heparin מלח
מיכל בעלי חיים ברור	Instech	MTANK / W	מתחם בעלי חיים
קשירה קפיץ	Instech	PS62	צינור קטטר / חיבור מכרסם
מסתובב	Instech	375/25	ווים לקשירת קפיץ
זרוע מסתובבת ותושבת	Instech	SMCLA	לסיבוב ומארז בעלי חיים
כפתור קשירה	Instech	VAB62BS/22	מתחבר לתחתית קשירה קפיצית
צינור נירוסטה	מיוצר בבית	N/A	המשמש לנחש צנתרים דרך עכבר
Matrx VIP 3000	Matrx	91305430	וופורייזר איזופלורן
Isoflurane	Stoelting Co.	50207	סופח איזופלורן/הלוטן
קוצץ	גימור אוסטר	דגם 59
ווי עור כירורגיים	תוצרת בית (??)	לא ישים (??)
0.9% נתרן כלורי מלח	APP Pharmaceuticals LLC	918610
מלקחיים	כלים מדעיים עדינים	11274-20
מספריים כירורגיים	כלי מדע עדינים	14058-11
מיקרומספריים	מדע עדינים	15000-00
תפרי משי כירורגיים אחדים	AD כירורגי	#S-S618R13	6-0 USP,
צינורות פוליאתילן PE-8	SAI Infusion Technologies	PE-8-25
מזרק	בקטון דיקינסון ושות'.	309659	1 סמ"ק/מ"ל
PE-10	קליי אדמס	427400
MCID Analysis	Imaging Research Inc.	גרסה 7.0	ניתוח צפיפות אופטית
שקופיות מצופות ג'לטין (75x25 מ"מ)	FD Neurotechnologies	PO101
Cryostat	Leica	CM1850
Super RX-N סרט רנטגן רפואי	Fuji	47410-19291
היפרקסטות (8x10 אינץ')	Amersham Pharmacia Biotech	11649
[1-14C] לאוצין	Moravek	MC404E
צינור מיקרוצנטריפוגה	Sarstedt Aktiengesellschaft & Co.	72.692.005	משמש לדה-פרוטאיניזציה של דגימות דם
פיפטה פסטר זכוכית	Wheaton	357335
צמר זכוכית	סיגמא-אולדריץ'	18421
חנקן	NIH מרכז אספקה	6830009737285
נוזל נצנוץ	CytoScint	882453
מונה סינטלציה נוזלי	Packard Tri-Carb	2250CA
מנתח חומצות אמינו	Pickering Laboratories	Pinnacle PCX
HPLC unit	Agilent Technologies	1260 Infinity	כולל 1260 משאבה ביו-אינרטית
מיקרוסקופ כירורגי	Wild Heerbrugg	M650
חומצה סולפוסליצילית	Sigma-Aldrich	MKBS1634V	5-sulfosalicylic acid dihydrate
Norleucine	Sigma	N8513
1.0 N HCl	סיגמא-אולדריץ'	H9892
[H3]לאוצין	Moraevk	MC672
צינור פלקון	תרמו סיינטיפיק		339652 50 מ"ל צינורות צנטריפוגה חרוטיים
שעון עצר	Heuer Microsplit	דגם 1000	1/100 דקות
פתרון המתת חסד	וטרינר אחד	H6438
נורת'רן לייט דיוק אימינטור	מחקר הדמיה בע"מ	דגם B95	קופסת אור פלורסנט
Micro-NIKKOR 55 מ"מ f/2.8	מצלמת CDD	של Nikon	1442