מאמר שיטה

ניתוח הטמפורלי של רוברטסונית גרעינית-כדי-cytoplasmic של חלבון 1 וירוס הרפס סימפלקס מאת Immunofluorescent קונפוקלית

DOI:

10.3791/58504

⸱

4 בנובמבר 2018

 , 
1Department of Biological Sciences, Wayne State University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ICP0 עובר טרנסלוקציה גרעינית-כדי-cytoplasmic במהלך זיהום HSV-1. מנגנון מולקולרי של אירוע זה אינו ידוע. כאן נתאר את השימוש מיקרוסקופ קונפוקלי ככלי לכמת ICP0 בתנועת זיהום HSV-1, אשר מניחה את היסודות לניתוח באופן כמותי ICP0 רוברטסונית במחקרים מכניסטית בעתיד.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התא הנגוע חלבון 0 (ICP0) של נגיף הרפס סימפלקס 1 (HSV-1) הוא חלבון מוקדם מיידי המכיל ליגאז אוביקוויטין טבעת-סוג E3. הוא אחראי על השפלה proteasomal ושל גורמים מגבילים מארח את הפעלת גנים ויראליים עוקבות. ICP0 מכיל רצף הקנוני לוקליזציה גרעינית (שקל). הוא נכנס לגרעין מיד לאחר הסינתזה דה נובו , ביצוע תפקידיה הגנה אנטי-מארח בעיקר בגרעין. עם זאת, בהמשך זיהום, ICP0 נמצא אך ורק בציטופלסמה, רומז המופע של התקה גרעינית-כדי-cytoplasmic במהלך זיהום HSV-1. יש להניח ICP0 רוברטסונית מאפשר ICP0 לווסת את תפקידיה לפי מיקומים subcellular שלה-שלבים שונים זיהום. על מנת ניסחו את תפקוד ביולוגי ואת מנגנון רגולטורי של טרנסלוקציה גרעינית-כדי-cytoplasmic ICP0, לשנות את שיטת מיקרוסקופ immunofluorescent לעקוב אחר ICP0 סחר במהלך זיהום HSV-1. פרוטוקול זה כרוך immunofluorescent מכתים, מיקרוסקופ קונפוקלי הדמיה, גרעיני לעומת התפלגות cytoplasmic וניתוח. המטרה של פרוטוקול זה היא להתאים את מצב יציב קונאפוקלית מתמונות שצולמו מסלול הזמן לתוך תיעוד כמותית של התנועה ICP0 הזיהום lytic. אנו מציעים כי בשיטה זו ניתן להכליל לנתח באופן כמותי את גרעיני לעומת cytoplasmic לוקליזציה של חלבונים ויראלי או סלולר אחרים מבלי לערב את טכנולוגיית הדמיה בשידור חי.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נגיף הרפס סימפלקס 1 (HSV-1) גורם מגוון רחב של מתון למחלות מהרפס קשות, כולל הרפס labialis, הרפס, keratitis סטרומה של אנצפליטיס. לאחר נגוע, הווירוס יוצר דלקת סמויה לכל החיים בנוירונים הגרעינים. לעיתים, הווירוס ניתן להפעיל מחדש על ידי מסיבות שונות כגון חום, מתח, דיכוי המערכת החיסונית1, שמוביל הרפס חוזרים ונשנים. התא הנגוע חלבון 0 (ICP0) הוא מווסת ויראלי מפתח קריטי עבור זיהום HSV-1 lytic והן סמויה. זה transactivates וירוס במורד הגנים באמצעות עצירת מארח הגנות אנטי ויראליים מהותי/מולדת2,3. ICP0 יש פעילות ליגאז אוביקוויטין E3, אשר מטרות מספר גורמים תא פרוטאוזום תלוית השפלה3. זה גם אינטראקציה עם מסלולים שונים תא להסדיר את פעילותם ובעקבות כך להסטת מארח הגבלות אנטי-ויראלי3. ICP0 ידוע כדי לאתר תאים subcellular שונים כמו הזיהום ממשיך3,4,5. החלבון יש אות לוקליזציה גרעיני ליזין/ארגינין-עשיר (שקל) ממוקם ב שאריות 500 כדי 5066. על סינתזת דה נובו -זיהום HSV-1 מוקדם, ICP0 מיובא באופן מיידי הגרעין. הוא קודם זוהה-דינאמי גרעיני מבנה הנקרא תחום גרעיני 10 (ND10)7. אוביקוויטין E3 ליגאז פעילות ICP0 מפעיל את ההשפלה של ND10 מארגן חלבונים, חלבונים (PML) לוקמיה פרומיאלוציטית חלבון מנומר 100 kDa (Sp100)8,9,10. לאחר ההפסד של חלבונים המארגן, ND10 גרעיני גופות מפוזרים, ICP0 עובר פיזור כדי למלא את גרעין כל4,11.

מעניין, לאחר תחילתה של שכפול ה-DNA ויראלי, ICP0 נעלמת מהגרעין. הוא אך ורק נמצא בציטופלסמה, רומז המופע של התקה גרעינית-כדי-cytoplasmic בשלהי HSV-1 זיהום4,12. הדרישה של שכפול ה-DNA מרמז על מעורבות אפשרית protein(s) ויראלי מאוחר בקידום רוברטסונית cytoplasmic של HSV-1 ICP04,12. מסתבר ICP0 סחר בין תאים שונים במהלך זיהום מסמיכה ICP0 כדי לווסת את האינטראקציות שלה כדי מסלולים סלולריים שונים בצורה מרחבית-טמפורלית, לכן הקואורדינטות שלה פונקציות מרובות משובח לכוון את האיזון בין lytic, החבויים HSV-1 זיהום13. כדי להבין טוב יותר את ICP0 multifunctionality ואת התיאום של תחומים פונקציונליים ICP0 לאורך כל הזיהום lytic, ניתחנו בקפידה הבסיס המולקולרי של טרנסלוקציה ICP0 דינמי12. לערוך מחקרים מכניסטית שדווחה בעבר12, אנחנו החלת שיטת צביעת immunofluorescent להמחיש לוקליזציה subcellular ICP0 על מצב זיהום שונים תחת מיקרוסקופ קונפוקלי. גם פיתחנו פרוטוקול כמותיים כדי לנתח גרעיני לעומת cytoplasmic חלוקת ICP0 שימוש בתוכנה קונפוקלי. אוכלוסיית תאים נגועים HSV-1 היה ייערכו לאורך כל שלבי הזיהום, המגמות של התנועה ICP0 נותחו, תחת טיפולים ביוכימיים שונים12. כאן נתאר פרוטוקול מפורט את המסמכים ICP0 רוברטסונית ב זיהום HSV-1. אנו מציעים כי שיטה זו יכולה להיות מאומץ כשיטה כללית ללמוד גרעיני לעומת cytoplasmic רוברטסונית אחרים חלבונים ויראלי או סלולרי, אשר יכול לשמש אלטרנטיבה הדמיה בשידור חי טכניקת דימות בשידור חי הוא לא מתאים בשל בעיות כגון תיוג שיטה, עוצמת אות או חלבון שפע.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. תא זריעה, זיהום בנגיף

  1. ב- 20 – 24 שעות לפני זיהום בנגיף, זרע 5 x 104 תאי פיברובלסט עובריים אמבריולוגיה (הל) או תאים אחרים להיבדק בשקופית מעד. ובכן 4 11 מ"מ במדיום הגידול (של Dulbecco ששינה נשר בינוני (DMEM) בתוספת 10% שור עוברית סרום (FBS)). דגירה התאים ב 37 ° C עם 5% פחמן דו-חמצני (CO2).
    הערה: כל טוב צריך 70-80% תא confluency בזמנו של זיהום.
  2. ביום הבא, להסיר את מדיום הגידול, להדביק את התאים עם וירוסים בינוני-199 בטווח של 4 – 10 pfu תא. דגירה תאים הנגועים בנגיף עבור h 1-37 מעלות צלזיוס. תנערו את השקופית במהלך תקופת הדגירה.
  3. לאחר הדגירה 1 h, הסר בינוני-199, להשלים עם מדיום הגידול.
    הערה: תרופות שמפריעות שלבים שונים זיהום ניתן להוסיף בשלב זה או לפני הקליטה ויראלי.
  4. דגירה של תאים הנגועים בנגיף ב 37 ° C עם 5% CO2 עבור אורכים שונים של התקופה זיהום.

2. קיבוע ו- Permeabilization

  1. בזמן זיהום נכונה, לשטוף את התאים הנגועים בתמיסת באגירה פוספט (PBS) 3 פעמים ובמהירות להוסיף 200 μL של 4% paraformaldehyde להתמחויות ב- PBS. דגירה התאים עם paraformaldehyde למשך 8-10 דקות בטמפרטורת החדר, כדי לתקן את התאים היטב בכל.
  2. האחות paraformaldehyde ולשטוף את הבארות עם μL 200 ל- PBS במשך 3 פעמים. לגמרי מחוק לגמרי PBS לאחר לשטוף את 3rd .
  3. להוסיף 100 μL של 0.2% ללא יונית חומרים פעילי שטח בכל טוב כדי permeabilize את התאים למשך 5 – 10 דקות.
  4. האחות של חומרים פעילי שטח ללא יונית ולשטוף הבארות עם μL 200 ל- PBS במשך 3 פעמים.

3. immunofluorescent מכתים

  1. לגמרי מחוק לגמרי PBS להוסיף 200 μL מאגר חסימה (1% אלבומין שור (BSA) ו- 5% סרום סוס ב- PBS) מכל קידוח, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 1 h או ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  2. הוסף השפעול נקבע ריכוז נוגדן ראשוני (ארנב anti-ICP0 נוגדן polyclonal12) במאגר חסימה, דגירה נוגדן ראשוני בטמפרטורת החדר במשך שעתיים או ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  3. לשטוף עם מאגר חסימה 3 פעמים עם הדגירה 10 דקות. להוסיף עז מצומדת אלקסה 594 ארנב אנטי משני נוגדנים (1:400 מדולל במאגר חסימה), דגירה השקופיות בטמפרטורת החדר מאובטח. ואז לשטוף את השקופיות 3 פעמים עם מאגר חסימה במרווח 10 דקות.
  4. סוף סוף לשטוף את השקופית פעם אחת עם PBS להסיר BSA שיורית ואת הסוס סרום.
  5. הוסף טיפה אחת של הרכבה antifade בינוני עם 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) כדי לטעון את השקופית לאטום אותו עם coverslip באמצעות לק שקוף.

4. קונאפוקלית הדמיה

  1. עם מיקרוסקופ קונפוקלי, להגדיר את אורך הגל-590 – 650 nm 594 אלקסה, 410 – 520 nm עבור דאפי. בחר תבנית תמונה על 1024 x 1024 קו ממוצע של 8 לרכוש תמונות ברזולוציה גבוהה.
  2. לנתח כל טוב על השקופית 4-ובכן תחת מיקרוסקופ קונפוקלי. לרכוש תמונות תא נציג תחת המטרה X 100, כפי שמוצג באיור 1 ו- 2 איור.
  3. ספירת מספר גדול של תאים, סעו תמונות של שדות ברציפות תחת המטרה X 40.
    הערה: זה דורש 5 – 10 תמונות לצבור יותר מ-200 תאים נגועים של כל נקודת הזמן של כל זיהום.
  4. ניסוי, לצלם תמונות עם פרמטרים קונאפוקלית קבוע עבור כל צורך דגימות לצורך השוואה.

5. ניתוח גרעיני לעומת התפלגות Cytoplasmic

  1. פרוייקט פתוח עם תוכנת היישום קונפוקלי. בחר תמונה שממנו תאים צריך להיות ייערכו להפצה גרעיני לעומת cytoplasmic של ICP0.
  2. לחץ על הכרטיסיה "כמות" בתפריט העליון ובחר "למיין ROIs" מתפריט כלים.
  3. לצייר קו האורך לרוחב התא כדי להיות מנותח על-ידי בחירה "לצייר קו" בתפריט העליון.
    הערה: היסטוגרמה יופיעו מציג את עוצמת קרינה פלואורסצנטית לאורך הקו הן ICP0 והן דאפי. ההיסטוגרמה, הקו הכחול מייצג את דאפי פיקסלים, מסמן את הגבול של הגרעין ואילו הקו האדום מייצג ICP0 פיקסלים.
  4. בהתבסס על רקע מכתים, להגדיר את סף קבוע עבור ICP0 בעוצמה לנתח את התפלגות subcellular ICP0 ניסוי.
    1. כפי שהודגם ב איור 2, אם האדום אות בממוצע מתחת לסף באזור גרעיני אך מעל הסף מגבולות כחול, לסווג את האות אדום כמו ממוקם ברובו בציטופלסמה.
    2. אם האות האדום מעל הסף לאורך כל הגרעין ומעבר לגבול סימן כחול, לקבץ את האות אדום כמו גרעין בתוספת cytoplasmic לוקליזציה.
    3. אם האות האדום מעל הסף בגרעין, אך בממוצע נמצא מתחתיה מחוץ לגבול סימן כחול, לקבץ את האות אדום כמו גרעיני לוקליזציה.
  5. משיבים יותר מ-200 תאים נגועים מהדגימה כל זיהום שונים ושעה מגרש גרף עמודות כדי להדגים ICP0 תנועה על-פי זמן (איור 3).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי להבין את הבסיס המולקולרי של תפקודים ביולוגיים של ICP0 סחר במהלך זיהום HSV-1, אנו משתמשים בשיטת מיקרוסקופ immunofluorescent כדי לנתח את התפלגות subcellular ICP0-דלקת שונים שלבים. איור 1 מציג את התאים נציג עם לוקליזציה ייחודית ICP0 בהמשך זיהום. כדי לכמת את הגרעין-כדי-cytoplasmic טרנסלוקציה של ICP0, אנחנו מנתחים ICP0 הפצה יחסית הגרעין מאת לסיווג תאים נגועים לשלוש קבוצות: לוקליזציה גרעינית, לוקליזציה cytoplasmic ו (לוקליזציה גרעיני פלוס cytoplasmic

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה שימש ללמוד רוברטסונית גרעינית-כדי-cytoplasmic של HSV-1 ICP0. ICP0 עובר סחר subcellular במהלך זיהום HSV-1 (איור 1). סביר להניח, ICP0 מקיים אינטראקציה עם מסלולים שונים תא כדי לבצע פונקציות שונות במקומות שונים. פעולה זו מאפשרת ICP0 לחידוד שלה פונקציות מרובות משיכת עם הפונדקאי. האנושי13. עם זאת, איך ICP0 מרכזת את פונקציות מרובות בצורה מרחבית-טמפורלית לא טוב נחקרה. עם פרוטוקול מיקרוסקופ פלואורסצנטי שתוארו לעיל, התחלנו לנתח את הבסיס המולקולרי של טרנסלוקציה גרעינ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים תמיכה כספית מ גרנט NIH (RO1AI118992) מוענק גו Haidong. אנו מודים המתקן הדמיה, מיקרוסקופיה הליבה Cytometry משאבים (MICR) באוניברסיטת וויין לקבלת תמיכה טכנית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<תאים >ווירוסים חזקים
פיברובלסטים של ריאות עובריות אנושיות (תאי HEL)ד"ר תומאס א. שנק (אוניברסיטת פרינסטון)תאי HEL גודלו ב-DMEM בתוספת 10%
ציר נגיפי FBS HSV-1 (זן F)ד"ר ברנרד רויזמן מעבדה
<חזק>בינוני
דולבקו s שונה Eagle' s בינוני (DMEM)Invitrogen  11965-092
סרום בקר עוברי (FBS)SigmaF0926-500 מ"ל
בינוני-199 (10x)Gibco11825-015
<חזק>ריאגנטים
4- באר 11 מ"מ שקופיות מדורגותCel-Line/Thermofisher Scientific  30-149H-BLACK
16% תמיסת פרפורמלדהיד (w/v) ללא מתנולThermo Scientific28908
טריטון X-100ריאגנטים פישרBP151-1C0
סרום בקר אבומין (BSA)CalbiochemCAS 9048-46-8
סרום סוסיםSigmaH1270
תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) (137 מ"מ NaCl, 2.7 מ"מ KCl, 10 מ"מ Na2HPO4, pH7.4)מעבדת ד"ר היידונג גו
NaCl           פישר ביוריאגנטBP358-212
KH<תת>2PO<תת>4                       פישר ביוריאגנטBP362-500
KCl                         פישר סיינטיפיק BP366-500
Na2HPO4                         פישר ביוריאגנטBP332-500
מאגר חוסם (PBS עם 1% BSA ו-5% סרום סוסים)ד"ר היידונג גו מעבדה
Rabiit Anti-ICP0 נוגדןד"ר היידונג גו מעבדה
PML (PG-M3)-עכבר חד-שבטי IgGסנטה קרוז ביוטכנולוגיהSC-966
Alexa Fluor 594-עז נגד ארנב IgGinvitrogenA11012
Alexa Fluor 488-עז נגד עכבר IgGinvitrogenA11001
Vectashield Mouting מדיום עם מעבדות וקטור DAPIH-1200
פסטר פיפטהפישר מותג13-678-20D
לקסאלי הנסן
<חזק>ציוד
מיקרוסקופקונפוקליLeica SP8
תוכנה קונפוקליתLeica LAS X חבילת
תוכנת אקסלמיקרוסופט אקסל
HERAcell 150i חממת CO2תרמו מדעיקוד הזמנה 51026282
יישומים

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Whitley, R., Kimberlin, D. W., Prober, C. G., et al. Pathogenesis and disease. Human Herpesviruses: Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis. Arvin, A., et al. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2007).
  2. Roizman, B., Knipe, D. M., Whitley, R. J., et al. Herpes simplex viruses. Fields' Virology. Knipe, D. M. , 6th Edition, Lippincott-Williams & Wilkins. USA. 1823-1897 (2013).
  3. Gu, H. Infected cell protein 0 functional domains and their coordination in herpes simplex virus replication. World Journal of Virology. 5 (1), 1-13 (2016).
  4. Lopez, P., Van Sant, C., Roizman, B. Requirements for the nuclear-cytoplasmic translocation of infected-cell protein 0 of herpes simplex virus 1. Journal of Virology. 75 (8), 3832-3840 (2001).
  5. Kawaguchi, Y., Van Sant, C., Roizman, B. Herpes simplex virus 1 alpha regulatory protein ICP0 interacts with and stabilizes the cell cycle regulator cyclin D3. Journal of Virology. 71 (10), 7328-7336 (1997).
  6. Mullen, M. A., Ciufo, D. M., Hayward, G. S. Mapping of intracellular localization domains and evidence for colocalization interactions between the IE110 and IE175 nuclear transactivator proteins of herpes simplex virus. Journal of Virology. 68 (5), 3250-3266 (1994).
  7. Maul, G. G., Everett, R. D. The nuclear location of PML, a cellular member of the C3HC4 zinc-binding domain protein family, is rearranged during herpes simplex virus infection by the C3HC4 viral protein ICP0. Journal of General Virology. 75 (6), 1223-1233 (1994).
  8. Chelbi-Alix, M. K., de The, H. Herpes virus induced proteasome-dependent degradation of the nuclear bodies-associated PML and Sp100 proteins. Oncogene. 18 (4), 935-941 (1999).
  9. Zheng, Y., Samrat, S. K., Gu, H. A Tale of Two PMLs: Elements Regulating a Differential Substrate Recognition by the ICP0 E3 Ubiquitin Ligase of Herpes Simplex Virus 1. Journal of Virology. 90 (23), 10875-10885 (2016).
  10. Lanfranca, M. P., Mostafa, H. H., Davido, D. J. HSV-1 ICP0: An E3 Ubiquitin Ligase That Counteracts Host Intrinsic and Innate Immunity. Cells. 3 (2), 438-454 (2014).
  11. Zheng, Y., Gu, H. Identification of three redundant segments responsible for herpes simplex virus 1 ICP0 to fuse with ND10 nuclear bodies. Journal of Virology. 89 (8), 4214-4226 (2015).
  12. Samrat, S. K., Ha, B. L., Zheng, Y., Gu, H. Characterization of Elements Regulating the Nuclear-to-Cytoplasmic Translocation of ICP0 in Late Herpes Simplex Virus 1 Infection. Journal of Virology. 92 (2), e01673-e01617 (2018).
  13. Gu, H. What role does cytoplasmic ICP0 play in HSV-1 infection? Future Virology. 13 (6), (2018).
  14. Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
  15. Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy - tips and tools. Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).
  16. Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Fluorescent proteins as a toolkit for in vivo imaging. Trends in Biotechnology. 23 (12), 605-613 (2005).
  17. Teng, K. W., et al. Labeling proteins inside living cells using external fluorophores for microscopy. Elife. 5, e20378(2016).
  18. Stephens, D. J., Allan, V. J. Light microscopy techniques for live cell imaging. Science. 300 (5616), 82-86 (2003).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

ICP0 HSV 1DAPI

מאמרים קשורים