אנו מתארים את פעולות השירות עבור תיוג פלורסנט tangentially גידול תאים על-ידי אלקטרופורציה ולאחר עבור הדמיה בצילום מואץ של התנועה תאים עם תוויות בתרבות שטוח-הר כדי להמחיש נודדות תא התנהגות tectum אופטיים לפתח הבחורה .
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
ויזואליזציה של נדידת תאים העוסקות ב Tectum אופטיים לפתח הבחורה
במאמר זה
סיכום
תקציר
הדמיה בצילום מואץ היא שיטה חזקה כדי לנתח בהתנהגות התא נודדים. לאחר התא פלורסנט תיוג, ניתן לרשום את התנועה של התאים עם תוויות בתרבות תחת מיקרוסקופ וידאו. לניתוח נדידת תאים במוח המתפתח, התרבות פרוסה משמש בדרך כלל כדי להתבונן נדידת תאים מקבילים למדור פרוסה, כגון נדידת תאים רדיאלי. עם זאת, ניתן להשיג מידע מוגבל השיטה התרבות פרוסה לנתח נדידת תאים בניצב המקטע פרוסה, כגון נדידת תאים וצורניים. כאן, אנו מציגים את הפרוטוקולים הדמיה בצילום מואץ להמחיש נדידת תאים העוסקות ב tectum אופטיים לפתח הבחורה. שילוב של התא תיוג על ידי אלקטרופורציה ב ovo ותרבות עוקבות שטוח-mount על תותב התרבות התא מאפשר זיהוי של התא נודדים, בתנועה במישור האופקי. יתר על כן, שיטת שלנו מקלה על גילוי של התנהגות תא בודד וגם פעולה קולקטיבית של קבוצת תאים בטווח הארוך. בשיטה זו ניתן להחיל באופן פוטנציאלי כדי לזהות את השינוי רציפים של התווית על-ידי פלורסנט המיקרו-המבנה, כולל התארכות עצב העקירה עצבית רקמות או תאים בתוך הרקמה ללא עצביות.
מבוא
המחקר של נדידת תאים מתקדמת עם טכניקה לקידום הדמיה בשידור חי. לאחר התא פלורסנט תיוג, התנועה הטמפורלי של תאים עם תוויות תרבות מאכל או ויוו ניתן להקליט תחת מיקרוסקופ וידאו. במחקר של התפתחות עצבית, שינויים מורפולוגיים של נדידת תאים או מתארך אקסונים יש כבר נותחה באמצעות הדמיה בצילום מואץ. עבור הדמיה יעיל, זה חיוני כדי להחיל שיטה מתאימה להכנה תא פלורסנט תיוג ורקמות, בהתבסס על מטרת ניסוי וניתוח. לניתוח נדידת תאים במוח המתפתח, התרבות פרוסה כבר בשימוש נפוץ להתבונן נדידת תאים מקבילים למדור פרוסה, כגון תא רדיאלי ההעברה1,2,3. מערכת התרבות פרוסה משמש גם לגילוי תא וצורניים ההעברה4,5, אבל זה לא מתאים לניתוח כיוונית במקרים שבו התאים לפזר בניצב בסעיף פרוסה.
Tectum סיב אופטי מורכב מבנה מרובה שכבות, שהוקמה על ידי נדידת תאים רדיאלי, וקולו במהלך התפתחות עובריים. היווצרות שכבה tectal תלוי בעיקר ההעברה רדיאלי של קודמן עצביים postmitotic תאים מאזור חדרית, היעד הסופי שלהם ברבדים בקורלציה עם תאריך הלידה שלהם ב אזור חדרית6. באשר וצורניים ההעברה, דיווחנו בעבר שני זרמים של העברות בשכבות הביניים ושיטחית ב tectum אופטיים המתפתח הבחורה. בשכבות הביניים במהלך E6-E8, התאים דו קוטבי עם תהליך ארוך המובילים ותהליך נגרר דק נודדים dorsally או ventrally לאורך fasciculus האקסון של אקסונים efferent tectal הפועלות dorso-ventrally7. לאחר העברה זו axophilic, התאים להבדיל לתוך הנוירונים multipolar הנמצא בשכבות העמוקות. בשכבות שטחיות במהלך E7-E14, התאים נודדים לפזר בצורה אופקית על ידי רפורמה תהליך המוביל מסועף ופיזור לתוך כיוונים מספר8. לאחר פיזור ההעברה, התאים האחרונים להבדיל בסופו של דבר לתוך הנוירונים שטחית מורפולוגיות שונות. בשני המקרים, תרבות שטוח-הר יעיל כדי לבחון את תנועת התא מקביל פני השטח pial.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול הדמיה בצילום מואץ להמחיש נדידת תאים לתעל פיתוח צ'יק tectum סיב אופטי7,8. שילוב של התא תיוג על ידי אלקטרופורציה ב ovo, ותרבות עוקבות שטוח-mount על הוספה התרבות תאים מאפשרת גילוי של כיוון התנועה והעברה תא נודדים. המטרה של שיטה זו היא כדי להקל על הזיהוי של שני התנהגות תא בודד לטווח הארוך, פעולה קולקטיבית של קבוצת תאים במישור האופקי.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. אלקטרופורציה ב Ovo
- להכין את הביטוי פלסמיד DNA תיוג פלורסנט בריכוז גבוה. לבודד דנ א מ- 200 מ של התרבות חיידקי בשיטת פירוק אלקליין תוך שימוש בעמודות אניון הבורסה לפי הפרוטוקול של היצרן (טבלה של חומרים). לערבב pCAGGS-EGFP pCAGGS-mCherryNuc-ריכוז סופי של 4 µg/µL כל.
הערה: טיהור DNA פלסמיד נטולת אנדוטוקסין עשוי להיות המועדפת עבור אלקטרופורציה. - דגירה ביצי תרנגולת פורייה אופקית ב 38 ° C ב- 70% לחות יחסית.
- אחרי 2.5 ימים, לחסל את 5 מ של אלבומין (חלבון ביצה) מן הצד המחודד של הביצה באמצעות 20 מ"ל מזרק עם מחט בקוטר 18, לאטום את החור מחט עם הקלטת.
- לחתוך העליון של המעטפת ביצה עם מספריים מעוגלים כדי לפתוח חור 2 ס מ קוטר ולבדוק את השלב ההתפתחותי של העובר תחת stereomicroscope (שלב 17 / המבורגר והמילטון9). לאטום את החור שוב עם הקלטת.
הערה: שלב זה יכול להתבצע בכל עת במהלך E2.5-E3.0. שלבים 1.3 ו- 1.4 להנמיך את הרמה של העובר על הביצה כדי להימנע קובץ מצורף חזק של העובר גדל ואת כלי הדם כדי המעטפת העליונה. - המשך דגירה עד E5.5.
- לפני אלקטרופורציה, להכין µL 10 על פלסמיד שהוזכרו dna צבעוניים עם 0.5 µL מהר ירוק (25 מ"ג/מ"ל), 10 מ של פוספט בלוק buffered מלוחים (PBS) המכיל פניצילין (100 יחידות/mL) סטרפטומיצין (100 μg/mL), ואת micropipettes מסיבים זכוכית צינורות קפילר באמצעות מעבד micropipette. חותכים בקצה הדיסטלי micropipette כדי להפוך בגודל המתאים של הנקבובית בהתאם לכמות הדנ א להזרקה.
- חותכים את הקליפה העליונה אטום עם מספריים כדי לפתוח חור 2.5 ס מ קוטר ולהגדיר את הביצה stably תחת המיקרוסקופ סטריאו. הוסף מספר טיפות של PBS לתוך הביצית. לקלף את הקרום allantoic מכסה את העובר ללא דימום באמצעות מלקחיים בסדר שני. הסר את השפיר של ראשו של העובר.
- כשאתם מסובבים את הראש עם microspatula, מזריקים 0.1-1 μL של ה-DNA צבעוני לתוך חלל חדרית של tectum אופטיים שמאל באמצעות micropipette מחובר צינור שאיבה.
הערה: כמות ה-DNA מוזרק תלוי מטרת הניסוי. תמיסה מרוכזת של הדנ א צריך לשקוע וצרף לאורך הקיר חדרית. - המקום זוג אלקטרודות מסוג forcep (3 מ מ, מרובע אלקטרודות עם מרחק 7 מ מ) כך אזור היעד של tectumis סיב אופטי ממוקם בין (איור 1שלב 1).
הערה: ה-DNA היא electroporated לצד אנודת. - גובה דופק מראש של 30 V, ms עם מרווח של 5 אלפיות השנייה, ארבע פעימות עוקבות של 6 V 1, 5 מילי-שניות עם מרווח 10 ms באמצעות הגנרטור דופק.
הערה: התנאי אלקטרונית תלוי גודל ומרחק של האלקטרודות. זה צריך להיות מספיק חזק כדי להשיג יעילות תרביות תאים, אך זה חייב להיות צנוע מספיק כדי להבטיח להתפתחות תקינה של רקמת המטרה. - לאטום את החור עם הקלטת ולהמשיך הדגירה. משרים את האלקטרודות ב- PBS להסיר אלבומין במברשת interdental בצלחת פלסטיק. חזור על 1.7-1.11 עבור כל ביצה.
2. שטוח-הר תרבות על תותב תא
- יום אחד לפני התרבות שטוח-הר, להכין את תותב תרבות תא מצופה. לצוף קצת מוסיף התרבות התא למים מזוקקים בלוק בצלחת בתרבות תא ס מ-10. לטעון פתרון של µg/mL laminin 8 ו- 80 µg/mL פולי-L-ליזין לכסות את הכיסויים ולעזוב את הכיסויים צפים בחממה תרבות CO2 תאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
הערה: למחרת, המכסים מצופים שניתן לאחסן ב 4 º C. - ביום של התרבות-E7.0, הסר תותב הפתרון laminin-פולי-L-ליזין ולמקם את תותב בקערת זכוכית התחתון (איור 1שלב 2) מלא 1.1 מ של תרבות בינונית (60% מופחת סרום בינוני, 20% F12, סרום שור עוברית 10%, 10 נסיוב החתיכה %, 50 יחידות/mL פניצילין, 50 סטרפטומיצין μg/mL). לשמור את המנה בחממה תא תרבות CO2 ב 37 º C.
הערה: המדיום יכול לשמש לאורך כל תקופת תרבות במשך שלושה ימים ללא שינוי. - להכין את ההגדרה של תרבות. הגדר היחידה קאמרית לח מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך עם זרם הגז של 40% O2 ו 5% CO2 (גז בקר) ב 38 ° C (בקר טמפרטורה).
- חותכים את הראש של העובר עם מספריים. לצבוט את הראש החוצה עם המלקחיים בתוך תמיסת מלח מאוזנת הנקס קר כקרח (HBSS) בקערה התרבות תאים 6 ס מ.
- לבודד את tectum electroporated סיב אופטי באמצעות מלקחיים בסדר שני. להעביר את tectum עם טפי פלסטיק לתוך תבשיל אחר מלא HBSS קר כקרח. השתמש את צלחת זכוכית והקעורות מבוסס עם סיליקון שחור כמו צלוחית לחיתוך.
- בדוק את המיקום של תיוג תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי זריחה. לגזור tectal רקמות המקיפים את האזור תיוג עם סכין השתלה. ודא את הכיוון של הרקמה ב tectum (קדמי-אחוריים, הגבי הגחוני /).
- להעביר הרקמה שכותרתו עם טפי פלסטיק הכנס כך הצד פיא מצורפת את הכנס. להניח את הרקמה tectal בכיוון הרצוי ולהסיר עודפי HBSS (איור 1שלב 2).
- חזור על 2.4-2.7 לשם הכנת רקמות אחרות באותו הכנס. מקם את המנה בבית הבליעה prewarmed ב מיקרוסקופ קונפוקלי הפוכה (איור 1בשלב 3).
3. זמן לשגות הדמיה
- בדוק את תוויות פלורסנט ולהתמקד בתחום מיקרוסקופיים. מיקרוסקופ קונפוקלי הפוכה. להתחיל את היחידות לייזר קונפוקלי ונסה הדגימה את הסריקה קונאפוקלית כדי להתאים את הכיוון והמיקום של הרקמה לאורך ציר ה-y, X בשטח. השתמש ה-X של 10 או 20 X עדשה אובייקטיבי ללא שמן טבילה.
- בחר את גודל סריקה (למשל, 512 x 512 dpi). להחליט את מרווח הזמן ואת טווח הכולל של הסריקה קונאפוקלית לאורך ציר z. לקחת מרווח של 5 או 10 מיקרומטר עבור הטווח 100 מיקרומטר. להחליט את מרווח הזמן של הדמיה קונאפוקלית, הכולל הדמיה משך (למשל, 10 דקות מרווחי מעל 48 שעות).
הערה: כדי להימנע לייזר phototoxicity, לאסור סריקה גודל סריקה גבוהה עם z-הפסקות קצרות עבור z ארוך-הטווח, או עם מרווחי זמן קצר במהלך משך זמן הדמיה. לדוגמה, בשעת החלת גודל סריקה גבוהה (למשל, 1024 1024 x dpi), להקטין את מספר סריקות לאורך ציר z. - ערכת הפרמטרים של הריצות קונאפוקלית תוכנית 3.2 שמתואר ולהתחיל הדמיה.
- לאחר ההדמיה, לשלב את התמונות קונאפוקלית על ציר z שונים כדי לספק תמונות z-מחסנית עם התאמת מוקד משובח בכל נקודת זמן.
- צרף תמונות z-מחסנית בנקודת זמן שונים ולבנות סרט זמן לשגות בפורמט AVI.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
איור 2 מציג את ההעברה וצורניים שטחית מטמיעים בתרבות שטוח-הר בזמן שחלף (0, 9, 18, 27 h) לאחר תחילת הקלטה. הסרט 1 הוא סרט בצילום מואץ של מינימום 10-מרווחי על פני תקופה של 28 שעות ו 50 דקות. במסגרת נבחרת עבור התמקדות התאים נודדים מהפינה השמאלית התחתונה עם תוויות של המסגרת למרחב ללא תווית (איור 3 א). התנועה ההמונית של התאים נודדים (GFP; לוח השמאלי העליון, סרט 1), יכ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הפרוטוקול המתואר לעיל ממוטבת לגילוי נדידת תאים שכבות שטחיות6,8. הוא ישים לגילוי שכבה אמצעית ההעברה נחלים (סרט 5)6,7, רק על ידי הסטה העיתוי של אלקטרופורציה (E5.5 כדי E4.5) ואת תחילתה של תרבות והדמיה (E7.0 כדי E6.0).
ההליך הציג מורכב תא תיוג אלקטרופורציה ב ovo, תרבות שטוח-הר, זמן לשגות קונאפוקלית הדמיה (איור 1
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי מספר גרנט KAKENHI JSPS 15 06740 K כדי לעותר
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <חזק>חומרים | |||
| NucleoBond Xtra Midi Plus EF | MACHEREY-NAGEL | 740422.5 | ערכת טיהור DNA פלסמיד ללא אנדוטוקסין |
| 20 מ"ל מזרק | TERUMO | SS-20ESZ | |
| 18 מד מחט | TERUMO | NN-1838R | |
| מהיר ירוק | Wako | 061-00031 | |
| 100x פניצילין וסטרפטומיצין | Gibco | 15140-122 | |
| צינור נימי זכוכית | Narishige | G-1 | |
| תרבית תאים הכנס | Millipore | Millicell CM-ORG | |
| למינין | SIGMA | L2020 | ציפוי של תרבית הכנס |
| פולי-L-ליזין | מכון פפטיד | 3075 | ציפוי של תרבית הכנס |
| צלחת תחתונה מזכוכית | Matsunami | D11130H | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | מדיום תרבית |
| F12 | Gibco | 11765-054 | תרבית |
| בינונית סרום בקר עוברי | Gibco | 12483 | סרום |
| אפרוח | Gibco | 16110082 | תרבית בינונית |
| 10xHBSS | Gibco | 14065-056 | |
| סכין מיקרוכירורגית | התמחויות כירורגיות שיתוף פעולה | 72-1501 | |
| <חזק>שם | <חזק>חברה | <חזק>מספר קטלוגי | <חזק>הערות |
| <חזק>ציוד<חזק> | |||
| מספריים מעוקלים | כאחד | מס' 11 | |
| מעבד מיקרופיפטה | מכשיר SUTTER | P97 / IVF | |
| אלקטרודה מסוג מלקחיים | BEX | LF646P3x3 | |
| מחולל דופק | BEX | CUY21EX | אלקטרופורטור |
| פלואורסצנטי מיקרוסקופ סטריאוסקופי | Leica | MZ16F | |
| מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך | בקר | ||
| בקר טמפרטורה Tokken | MIGM/OL-2 | ||
| Tokai Hit | MI-IBC | ||
| לייזר קונפוקלי | יחידה אולימפוס | FV300 |
מקורות
- Marín, O., Rubenstein, J. L. R. Cell migration in the forebrain. Annual Reviews of Neuroscience. 26, 441-483 (2003).
- Nadarajah, B., Alifragis, P., Wong, R. O. L., Parnavelas, J. G. Neuronal migration in the developing cerebral cortex: Observations based on real-time imaging. Cerebral Cortex. 13, 607-611 (2003).
- Tabata, H., Nakajima, K. Multipolar migration: the third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex. Journal of Neuroscience. 23, 9996-10001 (2003).
- Martini, F. J., et al. Biased selection of leading process branches mediates chemotaxis during tangential neuronal migration. Development. 136, 41-50 (2009).
- Polleux, F., Whitford, K. L., Dijkhuizen, P. A., Vitalis, T., Ghosh, A. Control of cortical interneuron migration by neurotrophins and PI3-kinase signaling. Development. 129, 3147-3160 (2002).
- Watanabe, Y., Yaginuma, H. Tangential cell migration during layer formation of chick optic tectum. Development, Growth and Differentiation. 57, 539-543 (2015).
- Watanabe, Y., Sakuma, C., Yaginuma, H. NRP1-mediated Sema3A signals coordinate laminar formation in the developing chick optic tectum. Development. 141, 3572-3582 (2014).
- Watanabe, Y., Sakuma, C., Yaginuma, H. Dispersing movement of neuronal tangential migration in superficial layers of the developing chick optic tectum. Developmental Biology. 437, 131-139 (2018).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).
- Cordelières, F. P., et al. Automated cell tracking and analysis in phase-contrast videos (iTrack4U): development of Java software based on combined mean-shift processes. PLOS One. 8, e81266(2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
