Method Article

ויזואליזציה של נדידת תאים העוסקות ב Tectum אופטיים לפתח הבחורה

DOI:

10.3791/58506

⸱

October 24th, 2018

 ,  , 
1Department of Neuroanatomy and Embryology, School of Medicine, Fukushima Medical University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים את פעולות השירות עבור תיוג פלורסנט tangentially גידול תאים על-ידי אלקטרופורציה ולאחר עבור הדמיה בצילום מואץ של התנועה תאים עם תוויות בתרבות שטוח-הר כדי להמחיש נודדות תא התנהגות tectum אופטיים לפתח הבחורה .

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדמיה בצילום מואץ היא שיטה חזקה כדי לנתח בהתנהגות התא נודדים. לאחר התא פלורסנט תיוג, ניתן לרשום את התנועה של התאים עם תוויות בתרבות תחת מיקרוסקופ וידאו. לניתוח נדידת תאים במוח המתפתח, התרבות פרוסה משמש בדרך כלל כדי להתבונן נדידת תאים מקבילים למדור פרוסה, כגון נדידת תאים רדיאלי. עם זאת, ניתן להשיג מידע מוגבל השיטה התרבות פרוסה לנתח נדידת תאים בניצב המקטע פרוסה, כגון נדידת תאים וצורניים. כאן, אנו מציגים את הפרוטוקולים הדמיה בצילום מואץ להמחיש נדידת תאים העוסקות ב tectum אופטיים לפתח הבחורה. שילוב של התא תיוג על ידי אלקטרופורציה ב ovo ותרבות עוקבות שטוח-mount על תותב התרבות התא מאפשר זיהוי של התא נודדים, בתנועה במישור האופקי. יתר על כן, שיטת שלנו מקלה על גילוי של התנהגות תא בודד וגם פעולה קולקטיבית של קבוצת תאים בטווח הארוך. בשיטה זו ניתן להחיל באופן פוטנציאלי כדי לזהות את השינוי רציפים של התווית על-ידי פלורסנט המיקרו-המבנה, כולל התארכות עצב העקירה עצבית רקמות או תאים בתוך הרקמה ללא עצביות.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחקר של נדידת תאים מתקדמת עם טכניקה לקידום הדמיה בשידור חי. לאחר התא פלורסנט תיוג, התנועה הטמפורלי של תאים עם תוויות תרבות מאכל או ויוו ניתן להקליט תחת מיקרוסקופ וידאו. במחקר של התפתחות עצבית, שינויים מורפולוגיים של נדידת תאים או מתארך אקסונים יש כבר נותחה באמצעות הדמיה בצילום מואץ. עבור הדמיה יעיל, זה חיוני כדי להחיל שיטה מתאימה להכנה תא פלורסנט תיוג ורקמות, בהתבסס על מטרת ניסוי וניתוח. לניתוח נדידת תאים במוח המתפתח, התרבות פרוסה כבר בשימוש נפוץ להתבונן נדידת תאים מקבילים למדור פרוסה, כגון תא רדיאלי ההעברה1,2,3. מערכת התרבות פרוסה משמש גם לגילוי תא וצורניים ההעברה<....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. אלקטרופורציה ב Ovo

  1. להכין את הביטוי פלסמיד DNA תיוג פלורסנט בריכוז גבוה. לבודד דנ א מ- 200 מ של התרבות חיידקי בשיטת פירוק אלקליין תוך שימוש בעמודות אניון הבורסה לפי הפרוטוקול של היצרן (טבלה של חומרים). לערבב pCAGGS-EGFP pCAGGS-mCherryNuc-ריכוז סופי של 4 µg/µL כל.
    הערה: טיהור DNA פלסמיד נטולת אנדוטוקסין עשוי להיות המועדפת עבור אלקטרופורציה.
  2. דגירה ביצי תרנגולת פורייה אופקית ב 38 ° C ב- 70% לחות יחסית.
  3. אחרי 2.5 ימים, לחסל את 5 מ של אלבומין (חלבון ביצה) מן הצד המחודד של הביצה באמצעות 20 מ"ל מזרק עם מחט בקוטר 18, לאטום את החור מחט עם הקלטת.
  4. לחתוך העליון של המעטפת ביצה עם מספריים מעוגלים כדי לפתוח חור 2 ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור 2 מציג את ההעברה וצורניים שטחית מטמיעים בתרבות שטוח-הר בזמן שחלף (0, 9, 18, 27 h) לאחר תחילת הקלטה. הסרט 1 הוא סרט בצילום מואץ של מינימום 10-מרווחי על פני תקופה של 28 שעות ו 50 דקות. במסגרת נבחרת עבור התמקדות התאים נודדים מהפינה השמאלית התחתונה עם תוויות של המסגרת למרחב ללא תווית (איור 3 א). התנועה ההמונית של התאים נודדים (GFP; לוח השמאלי העליון, סרט 1), יכ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול המתואר לעיל ממוטבת לגילוי נדידת תאים שכבות שטחיות6,8. הוא ישים לגילוי שכבה אמצעית ההעברה נחלים (סרט 5)6,7, רק על ידי הסטה העיתוי של אלקטרופורציה (E5.5 כדי E4.5) ואת תחילתה של תרבות והדמיה (E7.0 כדי E6.0).

ההליך הציג מורכב תא תיוג אלקטרופורציה ב ovo, תרבות שטוח-הר, זמן לשגות קונאפוקלית הדמיה (איור 1

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מספר גרנט KAKENHI JSPS 15 06740 K כדי לעותר

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<חזק>חומרים
NucleoBond Xtra Midi Plus EFMACHEREY-NAGEL740422.5ערכת טיהור DNA פלסמיד ללא אנדוטוקסין
20 מ"ל מזרקTERUMOSS-20ESZ
18 מד מחטTERUMONN-1838R
מהיר ירוקWako061-00031
100x פניצילין וסטרפטומיציןGibco15140-122
צינור נימי זכוכיתNarishigeG-1
תרבית תאים הכנסMilliporeMillicell CM-ORG
למיניןSIGMAL2020ציפוי של תרבית הכנס
פולי-L-ליזיןמכון פפטיד3075ציפוי של תרבית הכנס
צלחת תחתונה מזכוכיתMatsunamiD11130H
Opti-MEMGibco31985-070מדיום תרבית
F12Gibco11765-054תרבית
בינונית סרום בקר עובריGibco12483סרום
אפרוחGibco16110082תרבית בינונית
10xHBSSGibco14065-056
סכין מיקרוכירורגיתהתמחויות כירורגיות שיתוף פעולה72-1501
<חזק>שם<חזק>חברה<חזק>מספר קטלוגי<חזק>הערות
<חזק>ציוד<חזק>
מספריים מעוקליםכאחדמס' 11
מעבד מיקרופיפטהמכשיר SUTTERP97 / IVF
אלקטרודה מסוג מלקחייםBEXLF646P3x3
מחולל דופקBEXCUY21EXאלקטרופורטור
פלואורסצנטי מיקרוסקופ סטריאוסקופיLeicaMZ16F
מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוךבקר
בקר טמפרטורה TokkenMIGM/OL-2
Tokai HitMI-IBC
לייזר קונפוקלייחידה אולימפוסFV300
בינוני גז אולימפוס IX81

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Marín, O., Rubenstein, J. L. R. Cell migration in the forebrain. Annual Reviews of Neuroscience. 26, 441-483 (2003).
  2. Nadarajah, B., Alifragis, P., Wong, R. O. L., Parnavelas, J. G. Neuronal migration in the developing cerebral cortex: Observations based on real-time ima....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Tangential Cell MigrationChick Optic TectumTime lapse ImagingIn Ovo ElectroporationFlat mount CultureConfocal MicroscopyCell Culture InsertFluorescent LabelingNeuronal Cell MigrationParticle Tracking

Related Articles