שיטת פעילות אנדוטוקסין לאיתור דם כולו אנדוטוקמיה בחולים חולי אנוש

סיכום

בזאת אנו מציגים פרוטוקול למדוד במיטה את פעילות האנדוטוקסין של דגימות הדם האנושיות. הבדיקה של פעילות אנדוטוקסין היא מבחן פשוט לבצע והוא עשוי להיות ביוארקר שימושי בחולים באורח אנוש חולה עם אלח דם.

תקציר

ליפופוליסכריד, הידוע גם בשם אנדוטוקסין, הוא מרכיב בסיסי של חיידקים גראם שליליים וממלא תפקיד מכריע בפיתוח אלח דם והתחשמלות. הזיהוי המוקדם של תהליך מידבק המתפתח במהירות למחלה קריטית עשוי לבקש טיפול מהיר ואינטנסיבי יותר, ובכך עלול להוביל לתוצאות מטופלים טובים יותר. פעילות אנדוטוקסין (EA) ניתן להשתמש במיטה כסמן אמין של אנדוטוקסין מערכתית. הזיהוי של רמות פעילות אנדוטוקסין מוגבר הוכח שוב ושוב להיות משויך חומרת מחלה מוגברת אצל חולים עם אלח דם והתחשמלות. התהליך מהיר וקל לביצוע. בקצרה, לאחר הדגימה, מעורב של דם שלם מעורבב עם נוגדן אנטי אנדוטוקסין ועם LPS הוסיף. הפעילות האנדוטוקסין נמדדת כפרץ חמצוני יחסי של בינויטרופילים כפי שזוהה על ידי chemioluminescence. תפוקת הספק מתבטאת בקנה מידה מ -0 (נעדר) ל-1 (מקסימלי) ומסווגים כ-"נמוך" (< 0.4 יחידות), "ביניים" (0.4 – 0.59 יחידות), או "גבוהה" (≥ 0.6 יחידות). המתודולוגיה והרציונל המפורטים למימוש שיטת EA מדווחים בכתב יד זה.

מבוא

ליפופוליסכריד (LPS), הידוע גם בשם אנדוטוקסין, הוא רכיב מפתח של מבנה הממברנה של חיידקים גראם שליליים (GN). זה מפצה על 10% של קיר התא, להיות חיוני עבור שלמות הקרום החיצוני הומאוסטזיס. יתר על כן, הוא activator חזק של המארח מולדת המערכת החיסונית^1,2.

בחשיפה מחוץ לגופית של תאי מערכת החיסונית מולדים ל-LPS מוביל שינויים בביטוי של גנים מרובים³. המינהל של כמויות קטנות מאוד של lps במתנדבים אנושיים בריאים מפעיל את המפל של דלקת מערכתית חריפה, בעוד אלח דם והתחשמלות עלול להתעורר עם ריכוזי אנדוטוקסין גבוהה יותר^4,5.

אלח דם הוא מצב מסכן חיים אשר, אם לא מזוהה מיד, יכול להוביל לכישלון רב איברים ומוות. חולים ספיגה חייב להיות מטופלים בזמן, עם החייאה אגרסיבי, טיפול אנטיביוטי נאותה, בקרת מקור אופטימלית, ואסטרטגיות הנחיה תמיכה איברים. האבחנה של האטיולוגיה של אלח דם מבוססת בעיקר על זיהוי קליני וזיהוי הפתוגן מבוסס התרבות⁶. עם זאת, תוצאות של תרבויות מיקרוביאלית יכול לקחת עד 48 h ולא חד-משמעית של עד 30% מהמקרים⁷. הזדהות מוקדמת והתערבות עלולה להוביל לתוצאות מטופלים טובות יותר. בחולים בהם מחשוד אלח דם, החלטות מתקבלות לעתים קרובות על בסיס פרמטרים פיזיולוגיים וביוכימיים, ללא סימן ברור לאנדוטוקסין.

המדידה של פעילות אנדוטוקסין (EA) ניתן להשיג באמצעות שיטת מסחרית (ראה טבלת חומרים) בדם שלם. זה יכול לשמש בסמנים של אנדוספמיה מערכתית עבור ריבוד מוקדם של חומרת המחלה, במיוחד בחולים בסיכון לפיתוח הלם ספיגה⁸. הטיפול שימש כדי להנחות Polymyxin B הרבה תרפיה לאחרונה שפורסמה פעמיים סמיות מבוקר אקראי ניסוי קליני בחולים עם הלם ספיגה⁹. בחולים חולי נפש, המחקר מדיק הראה מוגברת רמות EA להיות משויך לתפקוד איברים מרובים, יחידת טיפול נמרץ (טיפול נמרץ) אורך של שהייה, ואת התמותה¹⁰.

שונה מאוד. שיטת Limulus אמבות ליפוסט (לל א), כמו ג'ל-קריש, turbidimetric, או מבחן כרומוגניים, כבר הרבה יותר מאומץ לעתים קרובות להערכת הנסיוב האנדוטוקסין. הוא מבוסס על היכולת של אנדוטוקסין כדי לגרום קרישה של המוליש של סרטן הפרסה, לימוליוס פוליפהימוס. עם זאת, לבחינה זו יש מגבלות מסוימות במונחים של ספציפיות. בפרט, זה יכול להיות גם מופעל על ידי מוצרים מחיידקים אחרים מאשר אנדוטוקסין, כגון רכיבים של הקיר תא פטרייתי, וזה יכול להיות מעוכב על ידי חלבונים שונים פלזמה האדם¹¹.

בעשור האחרון המדידה של EA פותחה ואומתה בתור ביואריקר של במחזור אנדוטוקסין. לעומת מבחן לל א, EA הוא מהיר וקל יותר ליישם בסביבה הקלינית. יתר על כן, זה הוכח להיות מדויק יותר מאשר בדם שלם, עם רגישות מוגברת וספציפיות, הן מבחנה ב vivo¹².

למרות היישום הראשוני שלה ככלי אבחון מוקדם לזיהוי מהיר של חיידקים GN כמו סוכנים סיבתי אלח דם, רמת EA גם נחקרו בתור ביוארקר של חומרת המחלה. בהקשר זה, זה הוכח להיות שימושי במיוחד כדי להעריך את מצב זילוח בשל מחלה קריטית שוטפת, כגון הלם ספיגה או תסמונת לאחר הלב מעצר¹³. לאחרונה, מאז התפתחות מערכות המופיליה, תוצאת EA חיובית הוצע גם ככלי סינון כדי לזהות במדויק מועמדים פוטנציאליים עבור טיפול כזה¹⁴. ערכנו לאחרונה מחקר התצפית רטרוספקטיבי על שכיחות ומשמעות קלינית של רמות גבוהות מוקדם של EA ב 107 חולים עם הלם ספיגה. בשורה עם תוצאות אחרונות אחרות, גילינו כי EA הוא סמן מבטיח של חומרת המחלה בחולים עם הלם ספיגה¹⁵.

מטרת כתב היד הנוכחי היא לתאר את השיטה לביצוע שיטת EA, במיטה או במעבדה, ולתאר את השימוש הפוטנציאלי שלה בתרחיש מייצג של הלם זיהומי. טכניקה זו יכולה לזהות את הפעילות LPS על ידי מדידת פרץ חמצוני משופר ב נויטרופילים בעקבות הטרמה שלהם על ידי מכלולי אנטי-אנדוטוקסין נוגדן ו-LPS. פרץ הנשימה המוגבר מזוהה על ידי כימומטר וכמות האור הנפלט נחשבת פרופורציונלית לכמות האנדוטוקסין בדגימת הדם. הצורך מחייב כמה ריאגנטים, לוקח בערך 30 דקות לבצע ומשתמש מעט כמו 40 μL של דם שלם¹².

פרוטוקול

הפרוטוקול מתנהל בהתאם להנחיות המוסדיות הנוגעות לטיפול בדגימות אנושיות ולאחר הליכי הניתוח הסטנדרטיים הנוכחיים של המעבדה הקלינית שלנו. השימוש בנתוני EA ומידע קליני של חולים נבדק עוקב אחר ההנחיות של ועדת האתיקה של המחקר האנושי של המוסד שלנו.

1. ציוד מעבדה וערכת שיטת הערכה

1. אחסן את ערכת EA ב-2 – 8 ° צ' כאשר לא בשימוש.
2. כל מבחן EA מורכב 5 סוגים שונים של צינורות; השתמש בכל אחד מהם עבור חלק אחר של הבדיקה (ראה סעיף 2).
   1. השימוש הצינור1 (הצינור "שליטה") כדי למדוד את הפעילות הבזליים של פרץ חמצוני לא ספציפיים של החולה נויטרופילים בהעדר נוגדן ספציפי.
   2. השימוש צינור2 ("לדגום" צינור) כדי למדוד את פרץ חמצוני בתגובה לקומפלקס LPS-נוגדן.
   3. השימוש צינור3 ("מקס" צינור) כדי למדוד את פרץ חמצוני מקסימלי של החולה נויטרופילים בתגובה עודף אנדוטוקסין.
   4. השתמש ב4 הצינור ("LPS") כמקור של אנסוגני אנדוטוקסין.
   5. השתמש ב5 הצינור (מצנטר) לאחסון דם.
      הערה: כפילויות של צינורות1,2 ו3 מסופקים עבור סך של 8 צינורות לשימוש עבור כל דגימת דם נבדק (בקבוק מגיב EA ומבחן בקרת איכות ניתן להשתמש עבור כל הבדיקות הכלולות בכיס).
3. לאסוף דגימות דם החולה בצינורות סטרילי המכיל נוגד קרישה EDTA. לאחסן דגימות דם בטמפרטורת החדר לפני הפעלת בדיקת EA.
4. לפני תחילת הבדיקה, הפעל את כימומטר ואת שייקר החממה. חמם את החממה לטמפרטורה של 37 ° c.
5. באופן אידיאלי, להתחיל לעבד את המדגם בתוך 30 דקות מאוסף הדם.

2. שיטת פעילות אנדוטוקסין

1. הכן את צינורות הבדיקה EA עבור דגימת הדם של כל חולה אתה צריך לבדוק. . שימו את הצינורות בארונות הצינורות לאחר מכן הסר את האותיות.
2. באמצעות combipipette, פיפטה a 1 mL נפח של מגיב EA מן הבקבוק לתוך צינורות1 (שפופרת הבקרה),2 (שפופרת לדוגמה) ו3 (שפופרת Max), כל אחד בשכפול.
   הערה: הפיפטה במורד הצד של הצינור כדי למנוע התזת התמיסה בחזרה.
3. מערבבים את דגימת הדם של המטופל באמצעות היפוך עדין של צינור הדם במשך 20 פעמים. אז, פיפטה 0.5 mL של דם החולה לתוך הצינור4 (שפופרת LPS max) ו5 צינור (שפופרת Aliquot). . צינור מערבולת4 ל -10 ס מ
4. לשים את מתלה הצינורות עם כל צינורות בדיקת EA ב שייקר החממה. סגור את המכסה ואת הדגירה עבור 10 דקות בטמפרטורה של 37 ° c.
5. פתח את המכסה ולהסיר את ארונות הצינורות מתוך השייקר החממה. צינור מערבולת5 (שפופרת מצנטר). באמצעות עצה סטרילית, פיפטה 40 μL של דם לתוך צינורות1 ו2, בשכפול.
6. צינור מערבולת4 (שפופרת LPS). שימוש באותו קצה הצינורות, פיפטה 40 μL של דם מצינור4 לתוך צינור3 (מקסימום שפופרת), בשכפול.
7. מערבולת ששת צינורות הבדיקה הסופיים (1,2,3, וכפילויות המתאימות), ואז למקם אותם בחזרה לארונות שלהם.
   הערה: ודא כי כל הצינורות מורטים באותה כמות זמן.
8. לשים את המדפים הצינור בחזרה לתוך שייקר הדגירה ולסגור את המכסה. להגדיר את שייקר הדגירה ב 100 סל ד, ואז להתחיל את התנועה 14 דקות.
9. הכנס את כרטיס השבבים של EA עם התווית למטר הכימי והתחל בהקשה. אחרי 14 דקות דגירה, בצע את ההוראות המוצגות על כימומטר כדי לקרוא את צינורות EA בסדר הנכון.
10. בעדינות מערבולת כל צינור 10 s לפני הצבת אותו על מחזיק המדגם של כימומטר. פתח את המגירה לדוגמה ומניחים את הצינור1 במחזיק הדגימה. לאחר מכן, סגור את המגירה לדוגמה והמתן לקריאה של יחידת האור היחסית (RLU).
11. חזור על שלב 2.10 עבור צינור 2 ושפופרת 3.
12. חזור על שלב 2.10 עבור צינורות כפולים 1, 2, ו-3.
    הערה: נסה מערבולת כל הצינורות לאותו כמות זמן במהלך השלבים 2.10 – 2.12.
13. לאחר כל הצינורות עובדו, שים לב כי תוצאות EA יחושב ויודפס באופן אוטומטי. רמות מבוטאים כיחידות EA ומייצגות את הממוצע של דטרמינציות כפולות מאותן דגימות.
14. חזור על שלבים 2.2 כדי 2.13 עבור כל דגימת דם שצריך להיבדק.
15. לאחר השלמת הבחינה, לאחסן את צינורות הבדיקה הנותרים וריאגנטים EA ב 2 – 8 ° צ' עבור עד 30 ימים.

תוצאות

גבר בן 72 הוסמך למחלקה לשעת חירום (ED) של בית חולים עירוני אקדמי. כמה ימים קודם לכן הוא הציג לרופא המטפל העיקרי שלו מתלונן על שריפת שתן. טיפול קצר במסלול עם פוספומצין אוראלי היה מומלץ. ההיסטוריה הרפואית שלו כללה יתר לחץ דם, סוכרת סוג 2 מסובכת היפרפלזיה שפיר של הערמונית. התרופות שלו כללו enalapril, atorvastatin, טאמסוולוסין ומטפורמין.

בשנת ED, הוא היה אדיש, מבולבל כאשר התעורר. הטמפרטורה שלו הייתה 39.1 ° c, שיעור הלב היה 125 פעימו...

דיון

הלם ספיגה עדיין משויך כיום לתמותה גבוה כמו 40%, למרות שיעור זה משתנה בהתאם לדוחות נחשב¹⁶. הצורך הרומן ובסמנים טוב יותר הוא דגלו על ידי רוב המומחים בתחומים כדי לסייע מטפלים באבחון מוקדם, ניהול טוב יותר, והתחזיות של חולים עם הלם ספיגה⁶.

ביצוע מבחן EA אינו דורש ידע טכני קודם או ציוד מעבדה מתוחכם, וכל ספק בריאות יכול בקלות ובמהירות ללמוד כיצד להפעיל אותו. זיהוי הבקשה של EA במחזור גבוה עשוי לעזור בסיכון של החולה שתקן, המפעיל גישה טיפולית מוקדם ואגרסיב...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ערכת EAA	ספקטרל מדיקל בע"מ	חבילת EAAST-20	עם 20 בדיקות + 1 בקרת איכות
Smart Line TL	Berthold	EAASL	שייקר אינקובטור לומינומטר
	GRANT	ES-20	שייקר מיני אינקובטור
Vortexer	VWR	444-2790	מכשיר מערבולת