כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי להעריך את תקינות מחסום דם-testis על ידי הזרקת אינולין-FITC לתוך האשכים. זוהי שיטה יעילה ויוו ללמוד שלמות מחסום דם testis. זה יכול להיות בסכנה על ידי אלמנטים גנטיים וסביבתיים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
שיטת In Vivo ללמוד העכבר דם Testis מכשול שלמות
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
יצירת זרע הוא הפיתוח של spermatogonia לתוך spermatozoa בוגרת ב בקוריאנית וכמה של בזרמה. תהליך זה נתמך על ידי צמתי תא סרטולי-מחסום דם-testis (BTB), אשר היא המכשול הכי צפופה רקמות בגוף יונקים segregates האפיתל וכמה לתוך שני תאים, על הבסיס של adluminal. BTB יוצרת microenvironment ייחודי בתאי הנבט, מיוזה אני / II ועל ההתפתחות של postmeiotic spermatids לתוך spermatozoa דרך spermiogenesis. כאן, אנו מתארים וזמינותו אמין כדי לפקח BTB שלמות של העכבר testis ויוו. BTB שלם חוסם פעפוע של FITC מצומדת אינולין מן הבסיס כדי תא הפסגה של בקוריאנית וכמה. טכניקה זו מתאימה ללמוד מועמדים הגן, וירוסים או חשיפה לרעלים סביבתיים שעשויים להשפיע על תפקוד BTB או תקינות, עם הליך קל, דרישה מינימלית של היכולות הכירורגיים לעומת שיטות אלטרנטיביות.
מבוא
בתרבית של יצירת זרע נחשב תהליך מובנה מאוד שמקיף התחדשות עצמית spermatogonial ובידול דרך spermatocytes לתוך spermatozoa הפלואידי באמצעות מיטוזה, מיוזה, spermiogenesis, שבמהלכו דרמטי שינויים ביוכימיים, מורפולוגיים להתרחש. מתפתחות בתאי הנבט מועברים בהדרגה מבסיס של צנורית וכמה לכיוון לומן. תהליך זה מוסדר על ידי תאים תאים הקשר בין בתאי הנבט סרטולי תאים1,2. התאים Sertoli הסמוכים טופס BTB הממוקמת ליד בסיס צנורית וכמה. BTB מחלק פיזית האפיתל של הבסיס, תא של adluminal. בשלבים השמיני - התשיעי של מחזור אפיתל, preleptotene/leptotene spermatocytes מן התאים הבזליים לנדוד בין BTB, להזין את התאים adluminal3
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הניסויים שבוצעו אושרו על ידי ועדת נאנג'ינג הרפואי האוניברסיטאי. זכר C57BL/6 הוחזקו בתנאים מבוקרים photoperiod ועכברים סופקו עם מים ואוכל.
1. תכשירים
-
נימים microinjection
- השתמש microinjection נימים עם הקוטר החיצוני, dimeter הפנימית, אורך של 1.0 מ מ, מ מ 0.8 ס מ 10.0, בהתאמה.
- משוך נימים זכוכית עם פולר נימי (איור 1 א'). לבדוק ולהתאים את ההגדרות בהתאם המכונה פולר קפילרי נמצא בשימוש.
- לשבור את הטיפים פיפטה עם מלקחיים להשתמש כדי להשיג נימים של קוטר 50-מיקרומטר בקצה.
הערה: הטיפים עשוי להיות ארוך מדי לחדור בזרמה. - לחדד את הטיפ בזווית של 30 מעלות....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
הסידור ניסיוני עבור ביצוע וזמינותו שלמות BTB מוצג באיור1. משוך, חידוד נימים microinjection עם נימי פולר, micropipette beveler, בהתאמה (איור 1A וג 1). ברים, מערכות אינסטלציה חימום וציוד microinjection מומחשים איור 1B ו- 1 D.
איור 2 מציג חלק מהשלבים מפתח עבור ההזרקה של אינולין-FI.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
יצירת זרע לוקח מקום האפיתל וכמה, הוא תהליך מאוד מסודר ודינמי נשלטת על ידי בתאי הנבט ותאים סומטיים (למשל, התאים Sertoli)13. המבנה BTB, אשר נבנה על ידי תאי סרטולי, מחלק וכמה האפיתל של הבסיס, תא של הפסגה. הפיתוח של meiotic, הפלואידי בתאי הנבט מתרחשת בתוך התא הפסגה המהווה מכשול אימונולוגי של14.
הפונקציה BTB יכול להתפשר על ידי חשיפה לרעלים או עקב פגמים בגנים המעורבים היווצרות של צמתי תא, המוביל אל פוריות הגבר על מנת לבחון BTB שלמות, .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמך על ידי ה-R המפתח הלאומית & D התוכנית של סין (2016YFA0500902), את נבחרת מדעי הטבע קרן של סין (31471228, 31771653), קרן המדע ג'יאנגסו עבור חוקרים צעירים מכובד (BK20150047), מדעי הטבע קרן של מחוז ג'יאנגסו (BK20140897, 14KJA180005), התוכנית יזמיים וחדשניים של מחוז ג'יאנגסו אל K.Z.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| חולץ נימי | SUTTER INSTRUMENT (USA) | P-97 | |
| 10x PBS | Hyclone (ארה"ב) | SH30258.01 | דילול ל-1& ב-ddH2O |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma (ארה"ב) | F6057 | |
| שקופיות מיקרוסקופ הידבקות | CITOGLAS (סין) | 80312-3161 | |
| קדמיום כלוריד | סיגמא (ארה"ב) | 655198-5G | |
| מיקרוסקופ קונפוקלי | Zeiss (גרמניה) | LSM700 | |
| נייר נטול אבק | קימברלי-קלארק (ארה"ב) | 34120 | |
| אינולין-FITC | Sigma (ארה"ב) | F3272 | |
| נימי מיקרו-הזרקה | Zhengtianyi (סין) | BJ-40 | 1.0 מ"מ ופעמים; 0.8 מ"מ ופעמים; 100 מ"מ |
| מיקרופיפטה beveler | NARISHIGE (יפן) | EG-400 | |
| OCT | SAKURA (יפן) | 4583 | |
| Paraformaldehyde | Sigma (ארה"ב) | P6148 | |
| Pentobarbital נתרן | Merck (גרמניה) | P11011 | |
| מכונת גילוח | יאשן (סין) | ||
| מיקרוסקופ סטריאו | ניקון (יפן) | SMZ1000 | |
| סוכרוז | Sangon Biotech (סין) | A610498 | |
| מכשירים כירורגיים | חזקים יותר (סין) | מספריים, מלקחיים, מחזיק מחט | |
| מזרק | KDL (סין) | 20163150518 | 0.45 מ"מ ופעמים; 0.16 מ"מ RW LB |
| תנור תרמוסטטי | KELL (נאנג'ינג, סין) | KEL-2010 | |
| <חזק>10x TBS, pH 7.6 | |||
| 0.2 מ' Tris | Sangon Biotech (סין) | A600194 | |
| 1.37 מ' Nacl | Sangon Biotech (סין) | A610476 |
מקורות
- Mruk, D. D., Cheng, C. Y. Sertoli-Sertoli and Sertoli-germ cell interactions and their significance in germ cell movement in the seminiferous epithelium during spermatogenesis. Endocrine Reviews. 25 (5), 747-806 (2004).
- Wen, Q., et al.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
