מאמר שיטה

בידוד, קיבוע, Immunofluorescence הדמיה של העכבר בלוטת יותרת הכליה

DOI:

10.3791/58530

⸱

2 באוקטובר 2018

 , 
1Department of Internal Medicine (Division of Metabolism, Endocrinology, and Diabetes), University of Michigan Health System, 2Department of Cell and Developmental Biology, University of Michigan Health System, 3Department of Molecular and Integrative Physiology, University of Michigan Health System, 4Endocrine Oncology Program, University of Michigan Health System, 5Comprehensive Cancer Center, University of Michigan Health System

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מציגים שיטה כדי לבודד את בלוטת יותרת הכליה של עכברים, לתקן את הרקמות, סעיף אותם ולבצע immunofluorescence מכתים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Immunofluorescence היא טכניקה ומבוססת על גילוי של אנטיגנים ברקמות עם העבודה של נוגדנים fluorochrome מצומדת ויש קשת רחבה של יישומים. זיהוי של אנטיגנים מאפשרת אפיון וזיהוי של סוגי תאים מרובים. ממוקם מעל הכליות, כמוס על ידי שכבה של תאים mesenchymal, בלוטת יותרת הכליה הוא איבר האנדוקרינית הולחן על ידי שני ברקמות שונות עם מקורם embryological שונים, mesonephric ביניים, נגזר והמזודרם בקליפת המוח החיצונית, את עצבי קרסט-derived לשד פנימית. קליפת יותרת הכליה מפרישה סטרואידים (קרי, mineralocorticoids, glucocorticoids, הורמוני המין), ואילו ליבת יותרת הכליה מייצרת catecholamines (קרי, אדרנלין, ונוראדרנלין). בעת ביצוע מחקר בלוטת יותרת הכליה, חשוב להבדיל בין תאים ייחודיים עם פונקציות שונות. כאן אנו מספקים פרוטוקול שפותח במעבדה שלנו המתאר סדרה של שלבים רציפים הנדרש להשגת immunofluorescence מכתים לאפיין את סוגי התאים של בלוטת יותרת הכליה. אנו מתמקדים תחילה הקרע של בלוטות יותרת הכליה העכבר, הסרת שומן periadrenal ואחריו את הקיבעון, עיבוד, פרפין הטבעה של הרקמה מיקרוסקופית. לאחר מכן נתאר חלוקתה של אבני רקמה עם מיקרוטום רוטרי. לבסוף, אנו מפרטים עבור צביעת immunofluorescent של בלוטת יותרת הכליה שרכשנו כדי למזער את איגוד שאינם ספציפיים נוגדנים והן autofluorescence על מנת להשיג אות אופטימלית פרוטוקול.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אימונוהיסטוכימיה היא טכניקה לגילוי הרקמות מרכיבים עם השימוש של נוגדנים ספציפיים מולקולות התאית, טכניקות צביעת הבאים כדי לזהות את הנוגדנים מצומדת1. הליך immunohistochemical דורש קיבוע ספציפיים, עיבוד של רקמות שנקבעות לעיתים קרובות מדעית של אנטיגן ספציפי, רקמות, נוגדן מנוצל2. קיבעון הוא חיוני כדי לשמור על המדינה "מקורי" של הרקמות, ובכך שומר על סלולרי ללא פגע, subcellular מבנים ותבניות ביטוי. בהמשך הטמעת נהלים ועיבוד נדרשים להכין את הרקמה חלוקתה פרוסות דק המשמשים עבור היסטולוגית מחקרים שכללו אימונוהיסטוכימיה.

Immunostaining יכול להתבצע עם זיהוי הדפסות כסף או פלורסנט. זיהוי הדפסות כסף מחייבת הניצול של אנזים להמיר מצע מסיסים מוצר בצבע לא מסיסים. בעוד אנזים זה יכול להיות מצומדת כדי הנוגדן לזהות אנטיגן (נוגדן ראשוני), היא מצומדת לעתים קרובות יותר כדי הנוגדן לזהות נוגדן ראשוני (קרי, הנוגדן משנית). טכניקה זו היא רגישה מאוד; המוצר בצבע הנובע התגובה אנזימטי photostable ודורש רק מיקרוסקופ brightfield עבור הדמיה. עם זאת, immunostaining הדפסות כסף מתאים בהכרח כאשר מנסה להמחיש שני חלבונים לשפה משותפת, מאז בתצהיר של צבע אחד יכול להסוות בתצהיר של האחר. במקרה של שיתוף מכתים, immunofluorescence הוכיחה להיות יותר יתרון. כניסתו של immunofluorescence מיוחס אלברט ירקו ועמיתיו, שפיתח מערכת כדי לזהות אנטיגנים רקמות עם נוגדנים מסומנים fluorescein ותנסו לדמיין את אותם ברקמות משרטוטי תחת אור אולטרה סגול3. קרינה פלואורסצנטית זיהוי מבוסס על נוגדן מצומדת עם fluorophore הפולטת אור לאחר עירור. מכיוון שישנם מספר fluorophores עם פליטת באורכי גל שונים (עם חפיפה אין או הקטנה), שיטה זו זיהוי הינו אידיאלי עבור המחקרים של מספר חלבונים.

בלוטת יותרת הכליה הוא איבר לזווג הממוקם מעל הכליה, המאופיינת על ידי שני מרכיבים נפרדים embryologically מוקף קפסולה mesenchymal. קליפת יותרת הכליה החיצוני, נגזר והמזודרם ביניים, mesonephric מפריש הורמונים סטרואידים בעוד לשד פנימית, נגזר על הרכס העצבי, מייצרת catecholamines כולל אדרנלין ונוראדרנלין, דופמין. קליפת יותרת הכליה בהיסטולוגיה והן מבחינה תפקודית מחולקת לשלושה אזורים קונצנטריים, עם כל אזור מפריש מחלקות שונות של הורמונים סטרואידים: glomerulosa zona החיצוני (zG) מייצרת mineralocorticoids המווסתים הומאוסטזיס אלקטרוליט, קרישה תוך-כלית כרך; fasciculata zona האמצעי (zF), ישירות מתחת zG, מפריש glucocorticoids המתווכות את תגובת המתח דרך הגיוס של מאגרי האנרגיה כדי להגדיל גלוקוז; וסקס reticularis zona הפנימי (zR), אשר משלב מבשרי סטרואידים (קרי, דהידרואפיאנדרוסטרון (DHEAS))4.

גיוון ב- adrenocortical zonation קיים בין המינים: לדוגמה, ס. מאסכאלאס חסרה את zR. ייחודי כמחנכת X-האזור של מסיה musculus הוא שריד של קליפת המוח העוברי מאופיין על ידי תאים קטנים השומנים עלוב עם acidophilic cytoplasms5. אזור X נעלמת בגיל ההתבגרות בעכברים זכרים, לאחר ההריון הראשון בעכברים נקבה, או בהדרגה והגויות ב הנקבות-bred לא6,7. יתר על כן, tortuosity ואת עובי המוצגים zG שסומנו וריאציה בין המינים אינה ארגון של תאי גזע וקדמון היקפיים, סמוך zG. העכברוש, בניגוד מכרסמים אחרים, יש אזור מובחן גלוי (זו) בין zG המיקלע זד אף כי פונקציות כמו אזור תא גזע ו/או אזור של ארעי הגברה אבות. אם זו היא ייחודית חולדות או פשוט יותר מאורגן בצורה בולטת אשכול של תאים הוא לא ידוע8,9.

תאים של קליפת יותרת הכליה מכילים טיפות השומנים המאחסנים אסטרים כולסטרול לשרת כמבשר הורמונים סטרואידים כל10,11.  המונח "steroidogenesis" מגדיר את תהליך הייצור של הורמונים סטרואידים מ כולסטרול דרך סדרה של תגובות אנזימטיות המערבות את הפעילות של פקטור שחלת בקר 1 (SF1), אשר הביטוי הוא סמן של פוטנציאל שחלת בקר. בלוטת יותרת הכליה, ביטוי Sf1 קיים רק בתאים של קליפת12. אדם מעניין למצוא הביטוי של ביוטין אנדוגני תאים adrenocortical עם פוטנציאל שחלת בקר13. זה אמנם יכול להיות הגורם של רקע גבוה יותר מבוססות-ביוטין/streptavidin שיטות מוכתמים, עקב הגילוי של ביוטין אנדוגני על ידי נוגדנים מצומדת עם streptavidin, מאפיין זה יכול להיות מועסק גם כדי להבדיל את שחלת בקר תאים של אוכלוסיות אחרות בתוך בלוטת יותרת הכליה, קרי, אנדותל, דרכים, ואת תאי לשד.

Innervated על ידי נוירונים preganglionic אוהדת ליבת יותרת הכליה מאופיין על ידי תאים basophilic עם ציטופלזמה פרטנית המכיל אפינפרין ונוראפינפרין. לשד תאים נקראים "chromaffin" בשל תכולה גבוהה של catecholamines בצורת פיגמנט חום לאחר חמצון14. טירוזין hydroxylase (ה) הוא האנזים מזרז את הצעד הגבלת קצב הסינתזה של catecholamines ו, ב בלוטת יותרת הכליה, מתבטאת רק לשד ה-15.

כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור הבידוד של העכבר בלוטת יותרת הכליה, עיבודם להטבעת פרפין, חלוקתה, ואת שיטה לבצע immunofluorescence מכתים במקטעי האדרנל כדי לזהות את סוגי הסלולר המהוות קליפת יותרת הכליה ואת לשד. פרוטוקול זה הוא תקן במעבדה שלנו עבור immunostaining עם מספר נוגדנים בשימוש שגרתי במחקר שלנו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל השיטות בוצעו על פי פרוטוקולים המאושרות כמוסד תחת auspice הוועדה האוניברסיטה על שימוש ובעלי טיפול ב אוניברסיטת מישיגן.

1. הכנה לניתוח

  1. ביום לפני הניתוח, להכין 4% paraformaldehyde (PFA) / פוספט buffered תמיסת מלח (PBS). במקרה של aliquots קפואים, המשך להפשיר אחד ולאחסן ב 4 º C.
    הערה: 4% PFA אינה יציבה עבור יותר מ 48 שעות.
    התראה: PFA רעיל, יש למנוע מגע עם העור והעיניים, להיפטר בכלי המתאים לאוויר.
  2. ביום של הניתוח, להכין מכשירי הניתוח על ידי לחיטוי את המספריים וחדים עם 70% אתנול (EtOH) ולתת להם ומניחים על מגבת נייר.
  3. המקום מלא צלחת 24-ובכן עם PBS 1 x (1 מ"ל/טוב מספיקה) ב דלי קרח.
    הערה: האדרנלים יישמרו בצלחת זה תרבות רב טוב לאחר הניתוח.

2. בלוטת יותרת הכליה לנתיחה

  1. המתת חסד העכבר בעקבות פרוטוקולים סטנדרטיים אושרה על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים שימוש הוועדה (IACUC). שיטה המשני של המתת חסד כדי להבטיח מוות (לדוגמה עריפה) נדרש.
    1. כי המתת חסד מאת איזופלוריין יתר, הנח את העכבר בחדר מלא עם ואדים איזופלוריין עד הנשימה נפסקת ולאחר מכן תסיר את העכבר מן החדר, להניח אותו על משטח ולבצע נקע בצוואר הרחם.
      הערה: רוב שיטות המתת חסד לגרום מצוקה לחיה, אינם מתאימים ללימודי מתח כי הם יכולים להוסיף את המשתנה מבלבלים של הפעלה של הציר יותרת-הכליה ושל שחרור קטכולאמין מדולרי. במקרה זה, עריפת ראש היא הטכניקה הציע לאמץ.
  2. שכב פרקדן על העכבר, לעקר את אזור החתך על הבטן ועל האגפים עם 70% EtOH.
    הערה: בעת גילוח הפרווה יגדל עקרות, עבור יישום מסוים זה זה לא הכרחי.
  3. לחתוך את העור באמצע הבטן בעזרת מספריים, להפריד את העור הצפק, כן, עדיף את העכבר על-ידי התכווצות העור סביב החתך ומושך אותו בכיוונים מנוגדים (סימטרית ו- rostral). ואז חתך של הצפק עד שהגיע האגף האחורי ימינה ושמאלה.
  4. הסרת חיתוך בלוטת יותרת הכליה מאתר סביב הרקמה שמסביב adipose ולמקם אותו בצלחת 24-multiwell מלא עם 1 x PBS ושמר על קרח.

3. פרי-יותרת הכליה להסרת שומן

  1. תחת מיקרוסקופ ויבתר, למקם את יותרת הכליה על זכוכית בסיס או צלחת פטרי בצלחת הבמה, למקם את מקור האור, בחר את רמת ההגדלה ולהתאים המוקד כדי לקבל תצוגה ברורה של האדרנל כולו.
    הערה: ההגדלה בשימוש יכול להשתנות בהתאם להעדפות האישיות. ההגדלה סך של 30 X עם עדשה תוכנית 1 X, זום 3 X, עינית 10 X מאפשרת להמחיש את בלוטת כולו עם שדה ראייה טובה.
  2. להסיר במהירות את רקמות השומן סמוכים עם שתי מחטים 25 גרם, הימנעות התייבשות של יותרת הכליה. אם זה יקרה לפני כל השומן יוסר, מהלך יותרת הכליה בחזרה לתוך הבאר המכיל PBS 1 x 1-2 דקות, ולאחר מכן המשך עם תהליך ההסרה השמן.
  3. לשטוף 2 x למשך 2 דקות ב- 1 x PBS.

4. ברקמה והטבעה

  1. לתקן את הרקמות 4% מחברים/PBS ב 4 ° C בפלטפורמה נדנדה 2 h.
  2. להסיר את 4% PFA ושטוף את הרקמות עם PBS 1 x, x 3 למשך 15 דקות כל ב 4 º C.
    התראה: PFA רעיל והוא פסולת מסוכנת; זה צריך להיות בזהירות תחת ברדס כימי ו הושלך לתוך מיכל פסולת מסוכנת.
  3. דגירה ריגושים ב- 50% EtOH ב 4 ° C בפלטפורמה נדנדה 2 h.
  4. דגירה ריגושים ב 70% EtOH ב 4 ° C על פלטפורמה נדנדה למשך תקופה מינימלית של 2 h.
    הערה: אם לא ממשיך בתהליך עיבוד להטבעת רקמה, ריגושים שניתן לאחסן ב 70% EtOH ב 4 º C. הימנעות לאחסון לטווח ארוך ב- 70% EtOH ונינוחה רקמות לעיבוד בהקדם האפשרי התשואות דגימות באיכות טובה יותר.
  5. להכין את יותרת הכליה עיבוד על ידי גלישת אותו בתחבושת הקפתו בממחטת הטבעה קלטת הרקמה. מקום בקלטת בצנצנת מלא 70% EtOH החנות ב 4 ° C עד מוכנה להעביר את המעבד רקמות. הכנס את הקלטת לתוך רקמות המעבד מתוכנת כפי שדווח בטבלה 1 ולהפעיל את התוכנית.
  6. להעביר את הקלטת אל תחנה ההטבעה מלאה פרפין מומסת ב 65 º C. אם תחנה הקירור אינה זמינה, מקם מגש הצינון קר לידו.
  7. תווית תבנית להטבעה ופתח את הרקמה הטבעה קלטת. באמצעות זוג מלקחיים, לפתוח את הגזה ולמקם את יותרת הכליה בעדינות במיקום הרצוי במרכז הבסיס ב להטבעה. יוצקים פרפין מומסת על יותרת הכליה. במידת הצורך, להחזיק את יותרת הכליה עם מלקחיים כדי לאבטח את מעמדה עובש אחרת זה יכול לנוע בתוך העובש.
  8. בעדינות להזיז את להטבעה למגש קירור ולא לחכות עד התקשות של הפרפין. לאחר מכן, כדי להקל על חלוקתה, לאחסן בתבניות ההטבעה במקום קריר.

5. חלוקתה עם מיקרוטום רוטרי

  1. בדוק האזמל הקטן נקי לפני שמתחילים, שינקה את כל שאריות שהושלכו פרפין, להבטיח כי הסכין (או להב) הוא מחודד, שמן מנגנון פנימי ומשכו לחלוטין המחזיק בלוק במידת הצורך.
  2. תווית של סדרת שקופיות מיקרוסקופ (טעונה באופן חיובי או מצופה למניעת איבוד רקמות (ראה טבלה של חומרים)), לפרוס אותם על סט חם שקופיות ב 37 מעלות צלזיוס, לוותר על סוג בלוק 1 מים הנדסה גנטית על כל שקופית.
  3. לקבוע סעיף עובי 5 מיקרומטר.
  4. הכנס את הלהב מיקרוטום בעל להב, לקבוע את הזווית של הלהב, לוודא כי הלהב המסיסה בחוזקה לתוך המחזיק ולבדוק את הסיווג של פרפין בלוק על בלוק מחזיק.
  5. להביא בעל לחסום את מעמדה הגבוה ביותר, במידת האפשר, לנעול את ידית ההפעלה, להסיר את הבלוק פרפין העובש ולמקם אותו לתוך המחזיק לחסום כדי לאבטח אותו בחוזקה עם המלחציים. הזווית של הקו המרכזי של הלהב עם השטח פונה של גוש צריך להיות בערך 20°. במידת הצורך, להסתגל לבלוק פראפין.
    זהירות: הלהב היא חדה.
  6. אם בעבר נעולה, לפתוח את ההגה ביד ולהוריד את הבלוק פרפין עד שהפנים שלה ברמה עם קצה הלהב מיקרוטום. לסובב את ההגה ביד עם קצב קבוע. לבצע חיתוך הראשונית כדי להסיר את הפרפין, ולחשוף את יותרת הכליה.
  7. תמשיך לסובב את הגלגל יד, סעיף עד תום יותרת הכליה. השתמש במיקרוסקופ brightfield או לנתח כדי לבדוק נוכחות של רקמת בסעיפים. לנתק את רצועת הכלים של הלהב, עם העזרה של עוד זוג מלקחיים הניחו אותו על המים הניח על השקופית זכוכית. זה עשוי להיות שימושי כדי למקם את רצועת הכלים על משטח, למתוח אותו בקפידה ולאחר מכן לטעון אותה בשקופית.
  8. תן את השקופיות יבש על הכיריים. לאחר מכן להניח אותם על מגש שקופיות, לאפות בתנור בחום של 37 ° C בין לילה או יותר אם מים זה עדיין קיים. לאחר יבש, אחסן את השקופיות בתיבה שקופית בטמפרטורת החדר.
  9. . תניח את כל הציוד בשימוש ולנקות את האזמל הקטן.

6. immunofluorescence

  1. בחר את השקופיות עבור immunostaining ומניחים בעל שקופיות.
  2. על פלטה חמה, להביא גביע מלא ציטראט 0.01M ב- pH 2.0 לרתיחה. היקף המאגר תלוי בגודל כוס כימית, חייב להיות מספיק לכיסוי הסעיפים של השקופיות במהלך רותחים (כמה אידוי צריך להילקח בחשבון). מכסים את. הספל עם רדיד אלומיניום.
    הערה: שיטות אחרות לאחזור אנטיגן הם זמינים (ראה דיון).
  3. Deparaffinize השקופיות קסילן 100% 2 x עבור 5 דקות כל אחד. נוזלים בין השקופיות באמצעות הסדרה הבאה: 100% EtOH 2 x עבור 5 דקות, 70% EtOH 2 x עבור 5 דקות, הקלד 1 הנדסה גנטית מים במשך 5 דקות.
    הערה: לאחר deparaffinization, חשוב לא לתת הסעיפים לייבש: מקטעי רקמת חייב תמיד להיות מכוסה מאגרי או פתרונות עד סוף ההליך או מבנה רקמות עלולים להיפגע.
  4. לאחזור אנטיגן, למקם את השקופיות בעל שקופית מתכת, הכנס אותו. הספל עם רותחים ציטראט ללא רדיד האלומיניום. . תן לו לרתוח במשך 10 דקות.
  5. להסיר את הספל הכיריים ולתת לזה להתקרר במשך 20 דקות לוודא כי הסעיפים בלוטת יותרת הכליה, מכוסים עדיין המאגר.
  6. להכין את הפתרון חסימה. אם משתמש ההכתמה זמינים מסחרית קיט מועסקים עבור נציג תוצאות (ראה את הטבלה של חומרים), צינור להוסיף 1.25 מ ל 1 x PBS, טיפה 1 (שווה ל µL כ- 45) של ריאגנט חסימת Ig עכבר ו- 5% של עז נורמלית בסרום. אחסן את הפתרון חסימה ב 4 ° C או על קרח תוך כדי עבודה.
    הערה: הסרום בשימוש תלויה המארח מינים של הנוגדן משני. כאן שימשו נוגדנים משניים העולות עז. עבור נוגדנים אחרים, ריכוזים שונים בסרום ייתכן שיהיה צורך. מדעית לקבוע ריכוז סרום הנכונה על ידי בדיקה כמה ריכוזים.
  7. להעביר את השקופיות לתוך צנצנת Coplin המכיל 1 x PBS ושטוף מין 3 x 10 כל אחד על כיסא נדנדה עם נדנדה עדין.
  8. היכונו ההכתמה תא humidified.
  9. . בעדינות, לנער את PBS משקופית אחת; נגב התחתון שקופיות עם מגבון נטולת כדי להסיר את עודפי PBS.
  10. באמצעות סימן מיוחד עבור שקופיות עם תכונות הידרופוביות, לצייר עיגול סביב כל מקטע בלוטת יותרת הכליה, לוודא כי המשטח זכוכית הוא יבש כדי למנוע הפצת של הפתרון דיו בסעיף. במידת הצורך, בזהירות לנגב היבש פני השטח. מקם את השקופית תא humidified.
  11. . מהר, פיפטה 50 µL (או מספיק כדי לכסות חלקים) של חסימת פתרון לתוך כל מקטע. תקופת דגירה של h 1 בטמפרטורת החדר.
    הערה: חסימת פתרון האחסון הדרוש עשויים להשתנות; חשוב כי הסעיפים מכוסים היטב עם הפתרון.
  12. הכנת הפתרון diluent הערכה זמינים מסחרית עם 7.5 mL ל- PBS 1 x, 600 µL של חלבון להתרכז סרום עז נורמלי מניות של פתרון ו- 5% (או כל אחרים סרום וריכוז בשימוש הפתרון חסימה). אחסן את הפתרון diluent ב 4 ° C או על קרח תוך כדי עבודה.
  13. הכינו את הפתרונות נוגדן ראשוני דילול הנוגדנים העיקרי בריכוזים המתאימים בהפתרון diluent. עבור שיתוף מכתים, להוסיף את aliquot של כל נוגדן צינור חדש ומערבבים בעדינות. במקום נוגדנים ופתרונות נוגדן על הקרח עד מוכן לשימוש.
    הערה: כאן אנחנו מועסקים נוגדן anti-SF1 העולות ארנב, נוגדן anti-TH העולות העכבר. כדי להכין הנוגדן פתרונות עבודה בצע בהמלצת.
    1. עבור הפתרון עובד SF1, בשפופרת אחת, להוסיף 1 µL של נוגדן anti-SF1 µL 999 של פתרון diluent (הריכוז הסופי של 1.5 µg/mL). הפתרון עובד TH, בשפופרת, להוסיף 1 נוגדן anti-TH µL ב 499 µL של פתרון diluent (ריכוז הסופי המשוער של 2-6 µg/mL).
    2. SF1 + TH פיפטה נוגדן עבודה מיקס, בשפופרת טריים, 250 µL של הפתרון עובד SF1 ו- µL 250 של הפתרון עובד TH. מערבבים בעדינות על-ידי pipetting. לאחסן בקירור.
  14. להעביר את השקופיות בצנצנת Coplin המכיל 1 x PBS ולשטוף x 3 עבור 5 דקות על כיסא נדנדה עם נדנדה עדין.
  15. המקום השקופיות חזרה אל החדר humidified לאחר לנגב עודף של PBS, פיפטה SF1 + TH נוגדן עבודה מיקס (או פתרון אחר נוגדן ראשוני) על כל סעיף, לסגור את תא humidified ולהשאיר את זה בן לילה ב 4 º C.
  16. למחרת, להעביר השקופיות לתוך Coplin צנצנת המכילה 1 x PBS ולשטוף 3 x למשך 15 דקות על כיסא נדנדה עם נדנדה עדין.
  17. בעת שטיפת השקופיות, להכין את הפתרון נוגדנים משניים בפתרון diluent באמצעות הריכוז המתאים. אם מבצע משותף מכתים, מוסיפים כמות שווה של כל פתרון נוגדנים משניים צינור חדש. מערבבים בעדינות על-ידי pipetting. לאחסן בקירור. להגן על הצינורות מפני אור, לאחסן בקירור עד מוכן לשימוש.
    הערה: כאן, הנוגדנים משני בשימוש הם 488 ננומטר פלורסנט התווית על-ידי צבע אנטי עכבר העולות עז 549 פלורסנט התווית על-ידי צבע אנטי-ארנב העולות עז. הפתרון נוגדנים משניים הוכן על-ידי הוספת 0.5 µL של כל נוגדן משני µL 799 בפתרון diluent (סופי ריכוזים של 1.2 µg/mL).
  18. למקם את השקופיות חזרה בבית הבליעה humidified לאחר הסרת העודפים של PBS, במהירות pipette פתרון נוגדנים משניים על הסעיפים בלוטת יותרת הכליה, סגור תא humidified, להגן מפני אור. תקופת דגירה של h 1 בטמפרטורת החדר.
  19. לשטוף את השקופיות בצנצנת Coplin עם 1 x PBS ולשטוף 3 x למשך 15 דקות על כיסא נדנדה עם נדנדה עדין, מוודא להגן עליהם מפני אור.
  20. להכין את 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) פתרון עבור צביעת גרעינית: 1 µL של דאפי (20 מ"ג/מ"ל) ב 1 מ"ל של PBS 1 x.
    הערה: כחול-פלורסנט counterstain גרעיני גם ניתן להשיג באמצעות Hoechst לצבוע.
  21. פיפטה דאפי פתרון על הסעיפים בלוטת יותרת הכליה, מכסה של אור, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 7 דקות.
  22. לשטוף את השקופיות בצנצנת Coplin עם 1 x PBS ולשטוף x 3 עבור 5 דקות על כיסא נדנדה עם נדנדה עדין תוך הגנה על השקופיות מפני אור.
  23. באזור מפני אור ישיר, תשכב זכוכית מכסה, פיפטה 60 µL או כ- 3 טיפות של הסוכן הרכבה מתאים immunofluorescence על פני הזכוכית המכסה.
  24. נגב בעדינות את כף שקופית עם מגבון נטולת מוך, עמדה השקופית עם הפנים למטה לעבר הזכוכית המכסה, מקביל לו, כל-כך הסעיפים רקמות הפנים הזכוכית המכסה עם הסוכן גובר עליו. בקלילות לחצו על השקופית על הזכוכית הכיסוי וודא כי אין בועת אוויר לכוד בין הזכוכית המכסה את השקופית.
    1. במידת הצורך, הפעילו לחץ נוסף כדי להסיר את בועות האוויר ואת עודף של הסוכן הרכבה.
  25. תשכב על השקופית מיכל כהה, התרופה בטמפרטורת החדר למשך תקופה מינימלית של 24 שעות (או הזמן המצוין דף המידע של הסוכן הרכבה בשימוש), לאחר מכן המשך הדמיה.

7. הדמיה

הערה: מיקרוסקופ פלורסצנטיות מחובר למצלמה נדרש עבור זיהוי ולכידה של קרינה פלואורסצנטית הנפלטת הרקמות לאחר עירור באורכי גל נחוש. אמנם ברור, חשוב לזכור לבחור המשני נוגדן מצומדת עם fluorochromes של מי עירור ספקטרום הפליטה תואמים הציוד זמין. הדמיה הגדרות משתנים בהתאם המיקרוסקופ התוכנה ששימשה עבור לכידת תמונות. ישנם כמה כללים בסיסיים החלים הדמיה מקטעים בלוטת יותרת הכליה, כגון שתוודא כי זמן החשיפה, המצלמה לקבל הגדרות, ומעוטרים מקור אור בעוצמה קבועה.

  1. הפעל את מקור האור של המצלמה, להפעיל את תוכנת הדמיה בעקבות הוראות היצרן.
    הערה: סדר הפעולות הללו עשויות להשתנות בהתאם הציוד בשימוש.
  2. לאבטח את השקופית על הבמה, פתח את התריס ולהשתמש בודקים עיניות מיקרוסקופ גרעיני מכתימים (דאפי) וערוץ הגדלה נמוכה (4 X) כדי לזהות את הרקמה בשקופית: סעיפים יותרת הכליה הם קטנים, ויזואליזציה שלהם עשויים לדרוש קצת זמן.
  3. לשנות הגדלה גבוהה יותר (10 X), פוקוס, לסגור את התריס.
    הערה: חשוב להימנע רב שלא לצורך תערוכות תחת אור זה יכול לגרום photobleaching, וכתוצאה מכך לאבדן קשר.
  4. שימוש בפקודות תוכנה, בחר את המטרה (10 X) וערוץ בשימוש (דאפי), להתאים את זמן החשיפה (1 יכול להיות מותאם s, אם האות הוא חזק או חלש מדי). אם הוא זמין, מוגדר binning עבור הדמיה חיה (לא רכישה) '2 X 2', המרה להרוויח עד 'בינוני', במהירות readout MHz ' 20'. אם התוכנה ששימשה אינו מציג את סרגל קנה מידה בסוף ההדמיה, בחר באפשרות סרגל קנה מידה ' מתפריט ' ומקם את הבר במקום הרצוי.
  5. פתח הצמצם, להתאים מחדש את המוקד במידת הצורך ולאחר להחליף ערוצים (FITC, TRITC, דאפי). אם המיקרוסקופ היא לא אוטומטית, לצלם יותרת הכליה בכל אחד מהערוצים מבלי להזיז את הבמה וודא להתאים את הבחירה של הערוץ בשימוש. לסגור את התריס פעם סיים.
    הערה: רשום את ההגדרות המועסקים למקרה התוכנה שומר באופן אוטומטי אותם.
  6. שמור את התמונות.
    הערה: תמונות הממוזג ניתן לעיתים קרובות ליצור בעזרת התוכנה של המיקרוסקופ או חבילות תוכנה אחרות עורך גרפיקה.
  7. חזור על הדמיה עבור אזורים אחרים של המקטע ו/או עם הגדלה גבוהה יותר.
    הערה: X 20 הגדלה לעתים קרובות דורשת זמן חשיפה קצר יותר (קרי, 800 ms).
  8. בסוף הדמיה, תכבה את כל הציוד בסדר הנכון.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור 1 מייצג תיאור סכמטי של פרוטוקול כל המתואר לעיל. בלוטת יותרת הכליה נקצרים מן העכברים, רקמת שומן הסמוכה הסרת תחת מיקרוסקופ ויבתר ו יותרת הכליה ואז המתוקנים ב- 4% מחברים. לאחר שלב זה, האנדרנלין, המוטבעות פרפין, מעובדים למחלקה עם מיקרוטום לחתוך את האיבר פרוסות דק אשר מופקדים על שקופיות מיקרוסקופ. לאחר הייבוש של המקטעים, immunofluorescence מבוצעת, הסעיפים הם צילמו את המיקרוסקופ.

הסרת שומן סמוכים (

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר שיטה בידודו של העכבר יותרת הכליה יחד עם ההכנה, צביעה של העכבר פרפין-מוטבע משרטוטי האדרנלים.

לעומת פרוטוקולים אחרים שבדקנו, פרוטוקול immunofluorescence זה הוכיח מתאים עבור הרוב המכריע של נוגדנים בשימוש המעבדה שלנו. עם זאת, במקרים מסוימים זה עשוי לדרוש כמה התאמות כדי לשפר את התוצאות מוכתמים. משתנה אחד זה יכול בקלות להיות שונה ונבדק הוא האורך של קיבעון. במעבדה שלנו, הדגירה ב- 4% PFA יכול לנוע בין 1 h כדי 4h, ואילו במעבדות אחרות הזמן קיבוע מורחב ל 12 – 24 h16

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים ד ר פרהיוט אבבה זובייר על ההערות המועילות שלו וסיוע טכני בהקמה של פרוטוקול זה. עבודה זו נתמכה על ידי במכון הלאומי של סוכרת, העיכול, מחלות כליה, נבחרת מוסדות של הבריאות מחקר גרנט 2R01-DK062027 (ל G.D.H).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צלחת תרבית תאים 24 בארותNest Biotechnology Co.0412B
מחטים חד פעמיות 25 גרם x 5/8 אינץ'אקסל אינטרנשיונל26403
פרפורמלדהיד (PFA)סיגמא-אולדריץ' P6148
Paraplast פלוס McCormik Scientific39502004פרפין להטמעת רקמות
קלטות ביופסיה של שנדון II עם מכסה מחובר1001097 תרמו מדעיותלעיבוד רקמות
להבי מיקרוטום בפרופיל גבוהAccu-Edge4685להבי נירוסטה חד פעמיים
תבניות הטמעת רקמות פלסטיק חד פעמיות מתקלפותPolysciences Inc.18986קטום, 22 מ"מ מרובע עליון מחודד ל-12 מ"מ תחתון
Superfrost Plus מיקרוסקופ שקופיותפישרברנד12-550-1575 מ"מ x 25 מ"מ x 1 מ"מ
קסילןפישר כימיקלX5P1GAL 
200 הוכחה אתנולDecon Labs, Inc.
רפידות גזה Certi-Pad בטיחות מוסמכת Mfg, Inc231-2103 אינץ' x 3. רפידות גזה סטריליות ללא לטקס
ערכת M.O.M מעבדות וקטורBMK-2202לאיתור נוגדנים ראשוניים של עכבר על רקמת עכבר
KimWipesKimtech 34155מגבונים 4.4 אינץ' x 8.4 אינץ'
Super PAP PENInvitrogen 00-8899עט לציור על שקופיות
כיסוי מיקרוסקופ זכוכית Fisherbrand12-544-Dגודל: 22 x 50 x 1.5
DAPISigmaD9542 (מוכן בציר של 20 מ"ג/מ"ל)
ProLong Gold antifade reagentבדיקות מולקולריותP36930סוכן הרכבה עבור אימונופלואורסצנציה
X-cite סדרת 120QLumen Dynamicsמקור אור
Coolsnap Myoפוטומטריהמצלמה
Optiphot-2 מיקרוטום מיקרוסקופניקון
אופטיות
LeicaEG1150 H 
מעבד רקמות LeicaASP300S
סרום עיזים רגילSigmaG9023
עכבר אנטי-THMilliporeMAB318נוגדן ראשוני
ארנב אנטי-SF1Ab קבוצת פרוטאינטק (PTGlabs)  בהתאמה אישיתנוגדן ראשוני
Alexa-488 עכבר IgG  עז מוגדלתJackson ImmunoResearch115-545-003 נוגדן משני
Dylight-549 ארנב IgG עז שגדלהג'קסון ImmunoResearch111-505-003נוגדן משני
חומצה ציטראט נטולת מיםפישר כימיקלA940-500
NIS-יסודות מחקר בסיסי תוכנת Nikonלהדמיה
קלטות בדרך משקע רקמות אמריקאי

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brandtzaeg, P. The increasing power of immunohistochemistry and immunocytochemistry. Journal of Immunological Methods. 216 (1-2), 49-67 (1998).
  2. Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomark Insights. 5, 9-20 (2010).
  3. Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).
  4. Lerario, A. M., Finco, I., LaPensee, C., Hammer, G. D. Molecular Mechanisms of Stem/ Progenitor Cell Maintenance in the Adrenal Cortex. Frontiers in Endocrinology. 8, (2017).
  5. Yates, R., et al. Adrenocortical Development, Maintenance, and Disease. Endocrine Gland Development and Disease. 106, 239-312 (2013).
  6. Jones, I. C. Variation in the Mouse Adrenal Cortex with Special Reference to the Zona Reticularis and to Brown Degeneration, Together with a Discussion of the Cell Migration Theory. Quarterly Journal of Microscopical Science. 89 (1), 53(1948).
  7. Sucheston, M. E. C., Samuel, M. The Transient-Zone in the Human and Mouse Adrenal Gland. The Ohio Journal of Science. 72, n2 (March, 1972) 120-126 (1972).
  8. Guasti, L., Paul, A., Laufer, E., King, P. Localization of Sonic hedgehog secreting and receiving cells in the developing and adult rat adrenal cortex. Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 117-122 (2011).
  9. Pihlajoki, M., Dorner, J., Cochran, R. S., Heikinheimo, M., Wilson, D. B. Adrenocortical zonation, renewal, and remodeling. Frontiers in Endocrinology. 6, 27(2015).
  10. Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid Droplets Finally Get a Little R-E-S-P-E-C-T. Cell. 139 (5), 855-860 (2009).
  11. Shen, W. J., Azhar, S., Kraemer, F. B. Lipid droplets and steroidogenic cells. Experimental Cell Research. 340 (2), 209-214 (2016).
  12. Finco, I., LaPensee, C. R., Krill, K. T., Hammer, G. D. Hedgehog signaling and steroidogenesis. Annual Review of Physiology. 77, 105-129 (2015).
  13. Paul, A., Laufer, E. Endogenous biotin as a marker of adrenocortical cells with steroidogenic potential. Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 133-140 (2011).
  14. Lowe, J., Anderson, P. Stevens & Lowe's Human Histology, 4th Edition. , Elsevier/Mosby. 263-285 (2015).
  15. Nagatsu, T. Genes for human catecholamine-synthesizing enzymes. Neuroscience Research. 12 (2), 315-345 (1991).
  16. Berthon, A., et al. Age-dependent effects of Armc5 haploinsufficiency on adrenocortical function. Human Molecular Geneticst. 26 (18), 3495-3507 (2017).
  17. Brown, C. Antigen retrieval methods for immunohistochemistry. Toxicologic Pathology. 26 (6), 830-831 (1998).
  18. Billinton, N., Knight, A. W. Seeing the wood through the trees: a review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence. Analytical Biochemistry. 291 (2), 175-197 (2001).
  19. Hirsch, R. E., San George, R. C., Nagel, R. L. Intrinsic fluorometric determination of the stable state of aggregation in hemoglobins. Analytical Biochemistry. 149 (2), 415-420 (1985).
  20. Whittington, N. C., Wray, S. Suppression of Red Blood Cell Autofluorescence for Immunocytochemistry on Fixed Embryonic Mouse Tissue. Current Protocols in Neuroscience. 81, 28(2017).
  21. Watson, J. Suppressing autofluorescence of erythrocytes. Biotechnic & Histochemistry. 86 (3), 207(2011).
  22. Epp, J. R., et al. Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs. eNeuro. 2 (3), (2015).
  23. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

DAPI

מאמרים קשורים