מאמר שיטה

מדידה רציפה לא פולשנית של פעילויות לב והתנהגותיים סרטני

DOI:

10.3791/58555

⸱

6 בפברואר 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Faculty of Fisheries and Protection of Waters, South Bohemian Research Center of Aquaculture and Biodiversity of Hydrocenoses, University of South Bohemia in České Budĕjovice

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מציג מערכת של אפידמיולוגיה סביבתית לא פולשנית הקלטה רציפה וניתוחים של סרטני הלב ופעילות גינקולוגיות. מערכת זו כוללת חיישן אופטי אינפרא אדום, מודול מעקב וידאו וכן תוכנה להערכת סרטני פעימות זה משקף את מצבו פיזיולוגיים, מאפיינת התנהגות סרטני במהלך פעימת לב תנודות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כצבתותיו הוא יצור הימית מרכזי המשמש כמודל ביולוגי מעשית עבור מחקרים פיזיולוגיים ורגשיים של חסרי חוליות והן כסמן ביולוגי שימושי על איכות המים. אף-על-פי סרטני לא יכול לציין ישירות חומרים הגורמים להידרדרות באיכות המים, הם יכול מיד (תוך כמה שניות) להזהיר בני אדם התדרדרות באיכות המים באמצעות שינויים חריפה לפעילות הלב והתנהגותיים.

במחקר זה, אנו מציגים שיטה לא פולשנית, כי הוא פשוט מספיק כדי להיות מיושמת בתנאים שונים עקב שילוב של פשטות ואמינות במודל אחד.

גישה זו, שבו מיושמים על אורגניזמים ביולוגיים לתוך תהליכי הערכת הסביבה, מספק אזעקת אמין ובזמן התראה על ולמניעת התדרדרות חריפה מים סביבה אמביינט. לכן, המערכת לא פולשנית המבוססת על סרטני פיזיולוגיים, הפרמטר ethological הקלטות נחקר איתור שינויים בסביבה הימית. מערכת זו תוחל עכשיו-שיכר מקומי לפיקוח על איכות המים המשמשים לייצור משקאות, אך ניתן להשתמש בכל טיפול במים, אספקת מתקן לבקרת איכות מים רציפה, בזמן אמת, מעבדה רגיל חקירות של פיזיולוגיה של הלב סרטני והתנהגות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הנושא של היישומים של אורגניזמים ימיים, כמו דגם אורגניזמים שונים מעבדה חקירות1,2 והן כלי לניטור מים טבעי/סביבתיים ותעשייתיים איכות3,4 , מופיע להילמד היטב. עם זאת, נושא זה הוא עדיין עניין ראוי לציון על בני אדם, ללא קשר אם הם שייכים לקהילה המדעית או מקצועות אחרים. למרות קיומו של מספר שיטות מתקדמות לניטור מסוימים פרמטרים (מה שנקרא "סמנים ביולוגיים")5,6,7,8, הדרישות החשובות ביותר עבור בחירה מחוון מורכב משלושה גורמים פשוטה: הפשטות (i), (ii) אמינות וזמינות כללי (iii).

סרטני, בתור נציג חיוני של צומח מים מתוקים, מבדיל עצמו כי הוא נמצא ברחבי העולם, היא נפוצה,, ברוב המקרים9, כולל של השריון קשה וגדולים מספיק מתאים מניפולציה. מה שייך לקבוצה של חסרי חוליות גבוהה לספק מספיק ופיתוח של מערכות פיזיולוגיות חיוניות האיברים המתאימים, במקביל, שמירה על הארגון פשוט יחסית10.

שיטות בהתבסס על ההערכה של מגוון פרמטרים ביולוגי ו/או התנהגותיות של crayfishes, כמתואר בספרות המדעית, תרמו משמעותית להתפתחות של לימודי אפידמיולוגיה סביבתית, סרטני באופן כללי. רוב השיטות פולשני זמין כעת עבור מדידת קצב הלב סרטני מבוססים על הקלטות רל המחייבים של הליך כירורגי מורכב ומדויק11,12,13; מניפולציות כאלה יכולה לגרום ללחץ משמעותי על ועשויה הסתגלות ממושכת על ידי סרטני. כמו כן, לא ידוע כמה זמן סרטני יכול לשאת אלקטרודות כאלה והאם זה בהצלחה הנשירה כשהוא נושא כזה מצורף. השיטות לא פולשנית שתואר מבוססים על הקלטות plethysmographic, אשר הינם מסובכים על ידי חומרה מורכבות ודורשים מעגל מיזוג סינון אות14 , הגברה או רכיבים אופטיים מדויקים ויקרים15 ,16.

במחקר זה, אנחנו תיאר גישה זו תורמת תוצאות הקיים ומציע חלופות חדשות לשיפור הנוכחי הליכים מדידה של קצב הלב סרטני. בין היתרונות, ישנם (i) קובץ מצורף מהירה, לא פולשנית שאינה דורשת הסתגלות ממושכת פיזיולוגיים; (ii) יכולת של crayfishes לשאת את החיישן בתוך תקופה של מספר חודשים החל משיר כדי משיר; (iii) את התוכנה מסוגלת ניטור בזמן אמת דום לב, פעילויות התנהגותיות, הערכת והנתונים שהתקבלו במקביל סרטני מרובים; (iv) מחיר ייצור נמוכה ופשטות. מערכת אפידמיולוגיה סביבתית נתאר מאפשרת את לא פולשנית רציפה ניטור של סרטני הלב ואת גינקולוגיות פעילויות בהתבסס על שינויים במאפיינים etho-פיזיולוגיים של crayfishes. מערכת זו ניתן ליישם בקלות בדיקות מעבדה סרטני פיזיולוגיה של הלב ו/או אתולוגיה, בנוסף ביישומים תעשייתיים לפיקוח על איכות המים במתקני טיפול ואספקת מים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. סרטן נהרות בחירה

  1. כדי להחיל בהצלחה הגישה הנוכחית על סרטני, בחר את דגימות למבוגרים בהתאמה עם גדלים השריון מספקת (שהוא באורך השריון לפחות 30 מ מ) עבור חיישן מצורף, חזותית לבחון אותו על היעדר של מחלות, ולבדוק בין אם זה מרים שני chelae כאשר זה נגע. הפרמטרים הנ ל מצביעות על מצב זכאי לבריאות סרטני.
    הערה: אם מספר סרטנים צפויים להשתמש במשפט נחשפים לאותם התנאים, קבוצת הניסוי צריך להיווצר מבוסס על מספר פרמטרים: (i) משקל ואורך דומה; (ii) קצב הלב דומות; (iii) מבטאים את פעילות לילית; (iv) צריכת מזון רגיל; (v) הבין-משיר מחזור17. . לפעמים, קשה להגדיר אם סרטני הוא קרוב משיר על ידי המדידות קצב הלב או בדיקות חזותיות או מישוש בלבד; לכן, הבדיקות של תכולת החלבון הכולל hemolymph של סרטני יכול להיות מועיל. תכולת החלבון צפוי להיות גבוה, כאשר סרטני קרובה יותר משיר מאשר המדינה בין-molting18.

2. רישום של פעילות לבבית סרטני והתנהגות

  1. על מנת למדוד noninvasively סרטני הלב המחירים, preliminarily להכין את החיישן עבור הליך זה. לפני זה לשים כצבתותיו לתוך הטנק עם מים ולתת לו להתאקלם שם לכמה ימים, כמו הכנת חיישן19 גם ייקח כמה ימים.
    1. כמה axially של IR דיודות פולטות אור (LED) עם phototransistor הבוקר לצרף את מעגל חיישן אופטי על-פני לוח; זה ידרוש ספק כוח של 5 V. עבור חיבור ה-LED, הצב Ω 200 הנגד על הלוח חיישן אינפרא-אדום; על מנת לחבר את phototransistor, במקום 220 Ω הנגד על הלוח.
    2. כשאני מחובר את סרטני, הפלט חיישן הוא מווסת על ידי כמות hemolymph ממלא את שריר הלב סרטני, מחליקי של התקרית אור מן ה-LED. על מנת למנוע הפרעה הדדית של האור על ידי ה-LED מואר IR ו- IR משתקף האור מהלב סרטני, אשר מתקבל על ידי phototransistor, במקום קיר קטן (0.5 x 1.5 x 4 מ מ, עובי x גובה x רוחב) עשוי מפלסטיק שחור בתמיסה בין ה-LED של phototransistor.
    3. במקום ה-LED במארז עמיד למים, לכסות את המשטח של החיישן עם הג'ל מבודד עמיד למים מן הצד הסמוך השריון כדי להגן על הרכיבים האלקטרוניים מפני נזק אפשרי (איור 1). תן את הג'ל להתייבש במשך 3 ימים כדי להשיג סגולות ההגנה הטובה ביותר שלה.
    4. עבור אות אנלוגי, כבלים גמישים דק (בערך 3 מ' אורכו) לצרף החיישן, להתחבר לממיר אנלוגי-לדיגיטלי (ADC); מכאן, אות סרוקים יועברו אל מחשב אישי על ממשק ה-USB, ב אשר הצבע המידע אודות סרטני פעילות לבבית נשמר, ניתח ב בזמן אמת עם תוכנה מיוחדת (ראה טבלה של חומרים), ואוחסנו עבור ניתוח מפורט בהמשך.
  2. ברגע החיישן מוכן, לצרף אותו סרטני. כדי לעשות זאת, הפעל את המחשב והפעל את התוכנה. לקבוע את המספר של סרטני יש לתקן חיישנים, קצב הלב מוקלטות יישמרו בקובץ תאריך.
  3. הסר את סרטני המים ונגב צדו הגבי השריון עם מגבת נייר. עוטף את chelae ואת הבטן של סרטני מגבת הנייר כדי למנוע נזקים על ידי היד האנושית וכדי למנוע לחץ נוסף על סרטני הנגרמת על ידי ידיים אנושיות חמות.
    הערה: אל תשתמש מצנן הקודם של סרטני על קרח או במקפיא בטקטיקות שלה לפני מניפולציות עם הקובץ המצורף חיישן. ההבדל בטמפרטורות מוביל סרטני הגבי משטח בכי אשר, בתורו, מוביל ההצמדה חיישן לא אמין, ניתוק דבק מהיר של השריון של סרטני.
  4. להכין משטח (קרי, אקח חתיכה קטנה שטוחה מפלסטיק או קורעים נייר-דבק דביק ולתקן אותה לטבלה) ומקל על ערבוב הדבק. לחץ את שתי טיפות קטנות (של קוטר של 0.5 ס מ) של צינורות A ו- B המכיל דבק אפוקסי ומערבבים במהירות אותם.
  5. לצרף השריון הגבי של סרטני את החיישן ולנסות למצוא את המקום שבו משרעת האות הלב יהיה מקסימלי. להחזיק את סרטני החיישן ביד אחת, באמצעות היד השנייה חינם, לשים טיפה של דבק מעורבת בכל ארבעת החוטים עזר ממוקם על החיישן (לתקן אותם בין שלבים 2.1.1 ו 2.1.4.). אל תזיז את חיישן לפחות 5 דקות עד הדבק מתקשה (התקשות דבק תלוי אמביינט טמפרטורה ולחות).
    הערה: כאשר תיקון כדי השריון סרטני החיישן, לבחון אותו לעומק את האזור כולו לב מהצד השריון כדי להגדיר את האזור בעזרת משרעת האות הלב (מקסימלי) הטוב ביותר. זה יעזור את התוכנה כדי לספק יותר מדויק חישובים קצב הלב.
  6. לגעת הדבק באמצעות יד חופשית והניח אם זה לא דביק, את עטיפתו סרטני בעזרת חיישן צמוד (איור 2) לתיבה ללא מים במשך כמה דקות עד הדבק לא יבש לחלוטין.
    הערה: טמפרטורה אופטימלית עבור מניפולציה סרטני ודבק משתנה בין 18 עד 22 מעלות צלזיוס. בטמפרטורות אלה, הדבק מתקשה בתוך 5 עד 7 דקות והוא יבש לחלוטין בתוך 8 עד 10 דקות. בטמפרטורות נמוכות, הלחץ של סרטני פחות בולט; עם זאת, הדבק צריכה עוד זמן כדי להקשיח, בערך 15 ו- 20 דקות תחת 15 ° C ל 10 ° C, בהתאמה. בטמפרטורות גבוהות יותר, במיוחד מעל 25 ° C, הדבק מתקשה תוך 3 דקות, אבל סרטני עובר הרבה יותר לחץ; לכן, נסו לצמצם את חשיפת סרטנאים בתנאים קיצוניים ללא מים.
  7. לפני הזזת את סרטני בחזרה לתוך הטנק, לטבול cephalothorax שלו לתוך המים מספר פעמים עם הפסקות קצרות של מספר שניות על מנת לאפשר הפרשות של האוויר שהצטבר על הגג, ו לעזוב את סרטני במים כ 1 h כדי להסיר את כל הכימיקלים עודף. עם השלמת תהליך זה, לשחרר את סרטני לתוך המים ולאפשר לו להתאקלם במשך 1-2 שבועות בתנאים ניסיוני, בהתאם שנצפה במדדים פיזיולוגיים. החלפת מים אופטימלית במהלך התקופות להתאקלמות היא כל יום אחר.
    הערה: מאפייני סרטני יש שאמבטיה, במצב בריא כוללים בולטת הלב היממה פעילויות גינקולוגיות, צריכת מזון רגיל ואני מבלים את רוב היום במקלט מיוחדים (אם ניתן).

3. מצלמה והתקנת התוכנה

  1. הפעלת התוכנה; מצלמת הוידיאו תתחלף אוטומטית.
  2. בחרו אפשרות של זיהוי תנועה, ביסודיות לזהות אזור של טנק אחד על המסך ויחלו התוכנה מעקב אחר ההתנהגות וקישורו עם ההקלטות פעילות לבבית.
    הערה: מודול זיהוי תנועה סרטני מורכב מצלמת וידאו העוקבת אחר התנהגות סרטני מתחת למיכל, התוכנה המשלב את ההתנהגות עם פעילות לבבית. נתוני המודול משמשים כדי להקל על עיבוד נתונים מדויקת יותר של פעילות לבבית על ידי ביטול תקופות בהן סרטני מדגים פעילות קטר גבוהה. תנועות פתאומיות סרטני (קרי, לתגובה לברוח או האכלה חניכה) יכול לגרום תנודות או קוצים זמן קצר באותות הלב עשוי להפחית את מידת הדיוק של חישובים מרווח הלב.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כתוצאה מכך, אנחנו מתקבל שילוב של סרטני הלב ופעילות התנהגותית, שנרשמו ונשמרו בקובץ בפורמט txt (איור 3). מלבד מספר סרטנים ניסיוני, את התאריך ואת קצב הדגימה, הקובץ מורכבת משלוש עמודות: (1) הזמן מתמיד בתבנית hh:mm:ss; (2 קצב הלב) מחושב באופן אוטומטי במחיר פעימות לדקה; (3) ומכניקה רשומה העדר (0) או נוכחות (1) של כל תנועה. סרטני היה לא פעיל, אפס שובץ התא אחראי על התנועה, כאשר הוא זז, ואז מספר אחד הופיע בתא בהתאמה. בעת הקלטת ברציפות, קובץ הנתונים נוצר באופן אוטומטי ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נרחב הוצע כי מדידת פרמטרים פיזיולוגיים מסוימים (כגון הלב או קצב האוורור או שניהם) היא שיטה אמינה יותר עבור הקלטה סרטני התגובות מאשר ההערכה של תגובות התנהגותיות אינן מתרחשות תמיד מיד11. עם זאת, זה ברור כי הגישה היעילה ביותר להערכת תגובות סרטני אמיתי לשינויים סביבתיים היא השילוב של פעילות לבבית, התנהגות הקלטות מאז זה הופך את זה ניתן לראות את הסיבה (s) עבור פעימות סרטני שינויים, או לא הם מתרחשים בעקבות שינויים כימיים בסביבה אמביינט, או בגלל חניכה ומכניקה. במהלך ניטור איכות המים, זה הכרחי לחסל כל והשפ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על ידי משרד החינוך, נוער וספורט של מס "CENAKVA" צ'כיה-פרויקטים CZ.1.05/2.1.00/01.0024, מס 'CENAKVA השני ' LO1205 תחת הקיימות הלאומית תכנית, על ידי הסוכנות מענק של האוניברסיטה של בוהמיה הדרומית ב České בודיוביצה (012/2016/Z), ועל ידי הסוכנות מענק של צ'כיה (מס. 16-06498S)

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
דיודת IR LEDKINGBRIGHT ELECTRONICKP-3216F3C
פוטוטרנזיסטורEVERLIGHTELPT15-21C
נגדROYAL OHM0805S8J0201T5E
נגדROYAL OHM0805S8F2200T5E
קבלKEMETכבל C0805C334K5RACTU
TECHNOKABELFTP KAT.5E 4X2X0,14C
מחברHARTING21348100380005
מחברHARTING21348000380005
ג'ל דיאלקטריKRAYDENSylgard 535
ממיר אנלוגי לדיגיטליTEDIAUDAQ-1416CA
דבקKUPSITO.SK7338723044
מצלמת וידאו KinectABCSTORE. CZGT3-00002
תוכנת ניתוחאוניברסיטת דרום בוהמיה בצ'סקה בודיוביצה, הפקולטה לדיג והגנת מים, המכון למערכותקישור לתוכנה: www.frov.jcu.cz/crayfishmonitoring
שם משתמש: frov
סיסמה: CF2018
מורכבות

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bownik, A., Sokołowska, N., Ślaska, B. Effects of apomorphine, a dopamine agonist, on Daphnia magna: Imaging of swimming track density as a novel tool in the assessment of swimming activity. Science of the Total Environment. 635, 249-258 (2018).
  2. Jeong, T. Y., Yoon, D., Kim, S., Kim, H. Y., Kim, S. D. Mode of action characterization for adverse effect of propranolol in Daphnia magna. based on behavior and physiology monitoring and metabolite profiling. Environmental Pollution. 233, 99-108 (2018).
  3. do Nascimento, M. T. L., et al. Determination of water quality, toxicity and estrogenic activity in a nearshore marine environment in Rio de Janeiro, Southeastern Brazil. Ecotoxicology and Environmental Safety. 149, 197-202 (2018).
  4. Xiao, G., et al. Water quality monitoring using abnormal tail-beat frequency of crucian carp. Ecotoxicology and Environmental Safety. 111, 185-191 (2015).
  5. Aagaard, A., Andersen, B. B., Depledge, M. H. Simultaneous monitoring of physiological and behavioral activity in marine organisms using non-invasive, computer aided techniques. Marine Ecology Progress Series. 73 (2), 277-282 (1991).
  6. Bloxham, M. J., Worsfold, P. J., Depledge, M. H. Integrated biological and chemical monitoring: in situ. physiological responses of freshwater crayfish to fluctuations in environmental ammonia concentrations. Ecotoxicology. 8 (3), 225-237 (1999).
  7. Depledge, M. H., Andersen, B. B. A computer-aided physiological monitoring system for continuous, long-term recording of cardiac activity in selected invertebrates. Comparative Biochemistry and Physiology. A, Comparative Physiology. 96 (4), 473-477 (1990).
  8. Depledge, M. H., Galloway, T. S. Healthy animals, healthy ecosystems. Frontiers in Ecology and the Environment. 3 (5), 251-258 (2005).
  9. Holdich, D. M., Reynolds, J. D., Souty-Grosset, C., Sibley, P. J. A review of the ever increasing threat to European crayfish from non-indigenous crayfish species. Knowledge and Management of Aquatic Ecosystems. 11, 394-395 (2009).
  10. Vogt, G. Functional anatomy. Biology of freshwater crayfish. Holdich, D. M. , Blackwell Science. Oxford, UK. 53-151 (2002).
  11. Bierbower, S. M., Cooper, R. L. Measures of heart and ventilatory rates in freely moving crayfish. Journal of Visualized Experiments. (32), e1594(2009).
  12. Li, H., Listerman, L. R., Doshi, D., Cooper, R. L. Heart rate in blind cave crayfish during environmental disturbances and social interactions. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 127 (1), 55-70 (2000).
  13. Listerman, L. R., Deskins, J., Bradacs, H., Cooper, R. L. Heart rate within male crayfish: social interactions and effects of 5-HT. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 125 (2), 251-263 (2000).
  14. Burnett, N. P., et al. An improved noninvasive method for measuring heartbeat of intertidal animals. Limnology and Oceanography: Methods. 11 (2), 91-100 (2013).
  15. Fedotov, V. P., Kholodkevich, S. V., Strochilo, A. G. Study of contractile activity of the crayfish heart with the aid of a new non-invasive technique. Journal of Evolutionary Biochemistry and Physiology. 36 (3), 288-293 (2000).
  16. Kholodkevich, S. V., Ivanov, A. V., Kurakin, A. S., Kornienko, E. L., Fedotov, V. P. Real time biomonitoring of surface water toxicity level at water supply stations. Environmental Bioindicators. 3 (1), 23-34 (2008).
  17. Kuznetsova, T. V., Sladkova, S. V., Kholodkevich, S. V. Evaluation of functional state of crayfish Pontastacus leptodactylus in normal and toxic environment by characteristics of their cardiac activity and hemolymph biochemical parameters. Journal of Evolutionary Biochemistry and Physiology. 46 (3), 241-250 (2010).
  18. Sladkova, S. V., Kholodkevich, S. V. Total protein in hemolymph of crawfish Pontastacus leptodactylus as a parameter of the functional state of animals and a biomarker of quality of habitat. Journal of Evolutionary Biochemistry and Physiology. 47 (2), 160-167 (2011).
  19. Pautsina, A., Kuklina, I., Štys, D., Císař, P., Kozák, P. Noninvasive crayfish cardiac activity monitoring system. Limnology and Oceanography: Methods. 12 (10), 670-679 (2014).
  20. Císař, P., Saberioon, M., Kozák, P., Pautsina, A. Fully contactless system for crayfish heartbeat monitoring: Undisturbed crayfish as bio-indicator. Sensors and Actuators B: Chemical. 255, 29-34 (2018).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים