אנו מציגים הגנום הנדסה זרימת עבודה עבור הדור של הדגמים החדשים במבחנה להידבקות ב- HIV-1 זה מסכם את הדברים proviral אינטגרציה באתרים גנומית שנבחרו. פילוח של עיתונאים HIV-derived בהנחייתם של מניפולציה הגנום CRISPR Cas9-בתיווך, הספציפיות-לאתר. פרוטוקולים מפורט דור שיבוט תא בודד, הקרנה של אימות המטרה הנכונה הינם מסופקים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
CRISPR-Cas9 מבוססי הגנום הנדסה ליצירת מודלים Jurkat כתב להידבקות ב- HIV-1 עם אתרים שנבחרו אינטגרציה Proviral
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV) משלב ה-DNA שלו proviral שאינה אקראית לתוך הגנום התא המארח-חוזרים ונשנים אתרים ונקודות גנומית. כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור הדור של הרומן מודלים במבחנה הידבקות ב- HIV עם אתרי אינטגרציה הגנומי שבחרת באמצעות טכנולוגיית ההנדסה הגנום המבוססות על CRISPR-Cas9. בשיטה זו, כתב רצף של הבחירה שניתן לשלב לוקוס גנומית יישוב, שבחרת, המשקף הרלוונטית קלינית שילוב אתרים.
בפרוטוקול, מתוארים העיצוב של הכתב HIV-derived ובחירה של רצף באתר, gRNA היעד. וקטור מיקוד בזרועות הומולוגיה נבנה, transfected לתוך תאי Jurkat T. הרצף כתב לאוכלוסייה אתר גנומית שנבחר על ידי רקומבינציה הומולוגית בהנחייתם של הפסקה כפולה-strand בתיווך Cas9 באתר היעד. תא בודד שיבוטים שנוצר, הוקרן הכוונת האירועים על ידי cytometry זרימה ו- PCR. שיבוטים שנבחרו ואז מורחבות, פילוח נכון מאומתת על ידי ה-PCR, רצף סופג הדרומי. ניתוח אירועים פוטנציאליים את המטרה של הגנום CRISPR Cas9-בתיווך הנדסה.
באמצעות פרוטוקול, מערכות התרבות התא הרומן הזה ניתן להפיק את הידבקות ב- HIV דגם באתרים אינטגרציה הרלוונטית קלינית. למרות הדור של תא בודד שיבוטים ואימות של שילוב רצף כתב הנכונה היא גוזלת זמן, הקווים המשובטים וכתוצאה מכך הם כלים רבי-עוצמה לנתח באופן פונקציונלי אינטגרציה proviral אתר הבחירה.
מבוא
שילוב של proviral ה-DNA הגנום המארח בעת זיהום הוא שלב קריטי במחזור החיים של וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV). בעקבות שילוב, HIV נמשכת על-ידי יצירת השהיה של קבוצות משנה תאי CD4 + T חיים ארוכים כגון זיכרון CD4 + T תאים. HIV שילוב שנראה שאינן אקראיות1,2. מספר נקודות חמות גנומית עם ה-DNA proviral משולב שהדו-שיח זוהתה במספר מחקרים באמצעות הרצף של שילוב אתרים אנשים נגועים בחריפות, באופן כרוני2,3,4 ,5,-6,-7,-
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. אסטרטגיה מכוונת הגנום הנדסה והיעדים עיצוב וקטור (טלוויזיה)
הערה: הצעד הראשון של הגנום הנדסה כרוך בחירה ויצירת הכלים הדרושים עבור CRISPR Cas9-בתיווך מיקוד. מבחר של לוקוס באתר אינטגרציה הגנומי, בחירה של סוג התא הכוונת, ועיצוב כתב HIV-derived לשילוב צריך להקדים שלב זה. פרוטוקול זה מתאר פילוח של הכתב מינימלי HIV-LTR_tdTomato_BGH-הרשות הפלסטינית לתוך תאי היעד Jurkat. תרשים זרימה של זרימת העבודה עבור המבוססות על CRISPR-Cas9 מיקוד, דור, סינון ואימות של קווים המשובטים מתואר באיור1. אסטרטגיית מיקוד שתואר משתמשת את Cas9 הפישחה ינפל תומימת ס (SpCas9) ליצירת מעברי dsDNA ביים gRNA באתר אינטגרציה ש....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
בניסוי זה נציג בחרנו להתמקד עיתונאי HIV-1-derived מינימלי המורכב LTR, tdTomato-קידוד רצף, תיקים עשויים. האות רצף מנחלת שני באינטרון 5 של ג'ין BACH217. לוקוסים עבור המיקוד נבחרו על פי קרבה לאתרי שילוב חוזר ונשנה שפורסמו שנמצאו במחקרים שונים על ראשי T תאים נגועים ב- HIV2,4,5,6, 7,
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
כאן, אנו מתארים את פרוטוקול ליצירת מודלים לכתבת HIV-1-נגזר Jurkat עם האתרים שבחרת שילוב proviral החלת בהנדסת הגנום המבוססות על CRISPR-Cas9.
מספר נקודות של הפרוטוקול דורשים תשומת לב רבה במהלך שלב התכנון. ראשית, מיקומה כדי להיות ממוקד יש לבחור בקפידה, כמו לוקוסים מסוימים ייתכן שיהיה קל יותר למטרה יותר מאחרים (למשל, בהתאם למצב כרומטין האזור לבין המטרה רצף עצמה). רצפים חוזרים הם הקשה. לשבט לתוך הווקטור מיקוד, והם לעתים קרובות לא ייחודי בתוך הגנום. מחוזות כרומטין דכאניים שקשה היעד עם
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
אנו מודים ברטה Weseloh והבל בטינה לקבלת סיוע טכני. אנו מודים גם ארן Düsedau ו- Hennesen יאנה (לזרום cytometry בפלטפורמת הטכנולוגיה, היינריך Pette אינסטיטוט) לקבלת תמיכה טכנית.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9 | Addgene | 42230 | וקטור לביטוי של SpCas9 ו-gRNA |
| pMK | וקטור ביטוי יונקים GeneArt | ||
| cDNA3.1 | Invitrogen | V79020 | וקטור ביטוי יונקים לשיבוט |
| BbsI | New England Biolabs | R0539S | אנזים הגבלה |
| NEBuilder Hifi DNA ערכת שיבוט הרכבה | New England Biolabs | E5520S | ערכת שיבוט הרכבה המשמשת ליצירת וקטור יעד |
| TaqPlus Precision PCR System | Agilent Technologies | 600210 | DNA פולימראז עם פעילות הגהה המשמשת להגברה של זרועות הומולוגיה (שלב 1.2.2.2), אימות אתר האינטגרציה ורצף המדווח (שלב 3.3.3 ו-3.3.5), יצירת בדיקה גנומית לכתם דרומי (שלב 3.4.1.5) וניתוח אירועים מחוץ למטרה (שלב 3.5.4) |
| צלחת תרבית רקמות 96 בארות (תחתית עגולה) | TPP | 92097 | לוחות תרבית רקמות לציפוי דילול |
| פולימראז DNA בנאמנות גבוהה ניו | אינגלנד Biolabs | M0530 L | DNA פולימראז המשמש לזיהוי אירועי מיקוד (שלב 2.4.2) ויצירת בדיקה ספציפית למדווח עבור כתם דרומי (שלב 3.4.1.4) |
| דימתיל סולפוקסיד (DMSO) | סיגמא-אולדריץ' | D9170 | דימתיל סולפוקסיד כ-PCR תוסף |
| מגנזיום כלוריד (MgCl2) תמיסת | New England Biolabs | B9021S | MgCl2 כתוסף PCR |
| Deoxynucleotide (dNTP) תערובת תמיסות | England Biolabs | N0447S | dNTP עם 10 מ"מ מכל nt לתגובות PCR |
| 5PRIME HotMasterMix | 5PRIME | 2200400 | תערובת PCR מוכנה לשימוש המשמשת לבדיקת PCR (שלב 3.2.11) |
| ערכת מיני דם QIAamp DNA | Qiagen | 51106 | ערכת בידוד וטיהור DNA |
| ערכת טיהור PCR QIAquick | Qiagen | 28106 | ערכת טיהור PCR |
| RPMI 1640 ללא גלוטמין | Lonza | BE12-167F | מדיום תרבית תאים |
| סרום בקר עוברי דרום אפריקה Charge | PAN Biotech | P123002 | תוסף |
| תרבית תאים בינוניL-גלוטמין | Biochrom | K 0282 | תוסף תרבית תאים בינוני |
| פניצילין/סטרפטומיצין 10.000 U/mL/ 10.000 ומיקרו; גרם/מ"ל | Biochrom | A 2212 | תוסף מדיום תרבית תאים |
| Gibco Opti-MEM מדיית סרום מופחתת | Thermo Fisher Scientific | 31985062 מדיום תרבית תאים עם ריכוז סרום מופחת המותאם לטרנספקציה | |
| TransIT-Jurkat | Mirus Bio | MIR2125 | מגיב טרנספקציה |
| פורבול 12-מיריסטאט 13-אצטט | סיגמא-אולדריץ' | P8139-1MG | תרבית תאים מגיב |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I0634-1MG | מגיב תרבית תאים |
| יחידת סינון מונעת מזרק, קרום PES, 0,22 ומיקרו; m | Millex | SLGP033RB | יחידת סינון לסינון סטרילי |
| חממת Heracell 150i | Thermo Fisher Scientific | 51026280 | חממת תרביות רקמות |
| Amershan Hybond-N + | GE Healthcare | RPN1520B קרום ניילון טעון חיובית לכתמי DNA ו-RNA | |
| Stratalinker 1800 | Stratagene | 400072 | UV crosslinker |
| High Prime | Roche 11585592001 | לתיוג DNA עם dCTP רדיואקטיבי באמצעות אוליגונוקלאוטידים אקראיים כפריימרים | |
| אילוסטרה ProbeQuant G-50 Micro Columns | GE Healthcare | 28-9034-08 | עמודות ספין כרומטוגרפיה לטיהור DNA מסומן |
מקורות
- Hughes, S. H., Coffin, J. M. What Integration Sites Tell Us about HIV Persistence. Cell Host and Microbe. 19 (5), 588-598 (2016).
- Marini, B., Kertesz-Farkas, A., et al. Nuclear architecture dictates HIV-1 integration site selection. Nature. 521 (7551), 227-231 ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
