הקרנת כותנה גנוטיפים לעמידות בפני ההתנגדות של רנפורם

סיכום

כאן, פרוטוקול מוצג עבור הקרנה מהירה הלא הרסנית של גנוטיפים כותנה עבור התנגדות נמטודות. הפרוטוקול כולל בדיקה חזותית את השורשים של שתילי כותנה נגועים nematode כדי לקבוע תגובה זיהום. לירות וגטטיבי מכל צמח מופץ אז לשחזר צמחים לייצור זרעים.

תקציר

מהירה שאינה הרסנית נמטודות (Rotylenchulus reniformis) הפרוטוקול הקרנה נדרשת לפיתוח של כותנה עמידים (Gossypium שעירות) זנים כדי לשפר את ניהול נמטודות. רוב הפרוטוקולים כרוכים מחלץ תוספתן נמטודות או ביצים ממערכת השורש כותנה או אדמה השתילה כדי לקבוע צפיפות האוכלוסייה או שיעור רבייה. גישות אלה בדרך כלל צורכת זמן רב עם מספר קטן של גנוטיפים מוערכים. גישה חלופית מתוארת כאן, שבה מערכת השורש נבדקת ויזואלית עבור זיהום נמטודות. הפרוטוקול כרוך לאחר שתיל כותנה 7 ימים לאחר שתילת עם נמטודות ולקבוע את מספר הנקבות המצורפת למערכת השורש 28 ימים לאחר החיסון. הנתונים מבוטאים כמספר הנקבות לגרם של משקל שורש טרי להסתגל לווריאציה בצמיחת השורש. הפרוטוקול מספק שיטה מצוינת להערכת התנגדות צמח מארח הקשורים ליכולת של נמטודות להקים אתר זיהום; עם זאת, התנגדות המעכבת את הרבייה נמטודות לא מוערך. כמו בפרוטוקולים אחרים ההקרנה, וריאציה היא נצפתה בדרך כלל בזיהום נמטודות בין גנוטיפים בודדים בתוך ובין ניסויים. נתונים מוצגים כדי להמחיש את טווח הווריאציה שנצפתה באמצעות הפרוטוקול. כדי לכוונן את הווריאציה הזאת, גנוטיפים של השליטה נכללים בניסויים. עם זאת, הפרוטוקול מספק שיטה פשוטה ומהירה להערכת התנגדות צמח מארח. הפרוטוקול נעשה שימוש בהצלחה כדי לזהות הצטרפות עמידים מ- G. האוסף של העצים של germפלסטיות ולהעריך אוכלוסיות פנקסי של יותר מ 300 אנשים כדי לקבוע את הגנטיקה של התנגדות. שיטת התפשטות וגטטיבי עבור שחזור צמחים להתרבות ההתנגדות פותחה גם. לאחר הסרת מערכת השורש עבור הערכת נמטודות, וגטטיבי לירות מחדש כדי לאפשר פיתוח של מערכת שורש חדש. יותר מ 95% של נצרי בדרך כלל לפתח מערכת שורש חדשה עם צמחים המגיעים לבגרות.

מבוא

Rotylenchulus רנזה (Linford ו אוליביירה), המכונה גם reniform נמטודות, הוא אחד של מינים נמטודות הגדול פרזיטים נוכח קרקעות של דרום מזרח ארצות הברית^1,2,3. נמטודות הוא מחייב, למחצה, בלתי מוחלט לעין האתר המחייב צמח מארח להשלים את מחזור החיים שלה^2,4. וורמיטופס טרום למבוגרים נקבה לחדור למערכת השורש המארח כדי להקים אתר האכלה באבן המצבות^2,3. החלק האחורי שנשאר מחוץ לשורש המארח יתנפח על ייצור ביצים, ויוצר צורת כליה אופיינית (איור 1). Rotylenchulus reniformis מסוגל להאכיל על מערכת השורש של יותר מ-300 מינים צמח, כולל כותנה⁴. כותנה (Gossypium ) מעובדת באופן נרחב בדרום-מזרח ארצות הברית, אבל היעדר R. הטיפול בזנים עמידים מונע הנהלה של שתיים^,3. אסטרטגיות ניהול כגון טיפול ורוטציה של מינים שאינם מארחים שימשו להפחתת הקרקע R. מדובר בצפיפות אוכלוסין של^5,6, אך הפסדים בעלי תשואה כותנה של זרעים יכולים לנוע בין 1 ל -5%². הסימפטומים של R. reniformis זיהום יכול לכלול המאסטטינג צמח, צמיחה שורש מודחק, ליקויים תזונתיים, הפלה פרי, ו עיכוב בגרות². עם זאת, הסימפטומים לא ניתן לבירור בשל אחידות של הסימפטומים ברחבי השדה; לכן, גישות להערכת R. יש צורך בזיהום reniformis כדי לזהות ולפתח זנים הכותנה עמידים. הערכה של R. reniformis התנגדות כותנה נחשב קשה⁷, כי מערכת השורש נגוע עשוי להיראות נורמלי למרות הצמח עשוי להראות סימפטומים של זיהום⁸.

פרוטוקול סינון נמטודות אפקטיבי נדרש לזיהוי של R. reniformis החסינות עמידים מתוך אוסף כותנה germפלסטיות, ולקביעת הגנטיקה ההתנגדות עבור האביזרים האלה. פרוטוקול כזה יסייע בהעברת גנים ההתנגדות כדי לקשור כותנה. שיטות ביוגרפיות שונות שימשו להערכת R. , הזיהום בכותנה^{8,9,10,11,12,13,14},¹⁵ באופן כללי, נעשה שימוש בשתי גישות עיקריות לזיהוי של R. . בסדר. הגישה הנפוצה ביותר כרוכה בחילוץ ביצים ו/או תוספתן נמטודות מצמחים נגועים או אדמה^{8,11,12,14,15}. המתודולוגיה הכללית עבור גישה זו כוללת נטיעת זרעים עבור גנוטיפים כותנה בודדים בסירים נפרדים, המאפשר לשתילים לפתח במשך 7 עד 14 ימים, התרת שתילים על ידי הוספת תערובת של שלבים תוספתן של R. reniformis על הקרקע, ומאפשר נמטודות להדביק את מערכת השורש עבור 30 עד 60 ימים. הבא, תוספתן נמטודות ו/או ביצים מופקים ממערכת השורש הנגוע של כל צמח או מאדמת השתילה. לאחר מכן נקבע כי מספר הביאודות או הביצים שחולצו ייקבע להעריך את צפיפות האוכלוסייה ואת קצב הרבייה, אשר מושווים לבקרת גנוטיפים כדי לזהות גנוטיפים עמידים.

גישה חלופית, כפי שמתואר כאן, כרוכה בבדיקת מאכל ערכת שורש הכותנה שנדבקה בנמטודות כדי לקבוע את מספר הנמטודות הנקביים הפרזיטיפיים^10,16. בדומה גישות אחרות, גנוטיפים כותנה נטועים סירים נפרדים ומחוסן עם תוספתן נמטודות כ 7 ימים לאחר נטיעת. בתוך 30 ימים לאחר החיסון, המערכת מוסרת מצמחים בודדים והקרקע שטפה מן השורשים. לאחר מכן, נמטודות המצורפת למערכת השורש מוכתם עם מזון אדום צביעה¹⁷, ושורשים הם בדקו מאכל לקבוע את מספר אתרי זיהום עם גנוטיפים עמידים כותנה (מזוהה בהתבסס על מספר נמטודות לגרם של השורש) בהשוואה לפקד רגיש¹⁶. הגישה השנייה הזו יש את היתרון של תפוקה מוגברת על ידי הפחתת מספר הימים הדרושים להערכה והגדלת מספר גנוטיפים בודדים הוערכו בניסוי אחד. הקרנת מתודולוגיות הערכת צפיפות אוכלוסייה או שיעור רבייה הם לעתים קרובות יותר זמן רב יותר מאשר אלה המבוססים על תצפיות חזותיות של סימנים זיהום⁷. עם זאת, מגבלה אחת של גישה זו היא התנגדות צמח מארח המעכבת את רבייה נמטודות כפי שנקבע על ידי ייצור ביצים אינו מוערך¹³.

פרוטוקולי סינון עבור R. reniformis התנגדות לעתים קרובות להרוס את מערכת השורש במהלך ההערכה⁷ וכרוכים לירות וגטטיבי להיות מושלך. כדי להתגבר על מגבלה זו, שיטה של התפשטות וגטטיבי פותחה כדי לאפשר התאוששות של צמחים לייצור זרעים¹⁸. לאחר הסרת מערכת השורש עבור הערכת נמטודות, לירות וגטטיבי נטועים בקרקע השתילה כדי לאפשר את מערכת השורש כדי לצמוח מחדש. שיטה זו כוללת יישומים רחבים עבור רוב R. . בסדר. שיטה פשוטה ומהירה של התפשטות וגטטיבי היא בעלת חשיבות קריטית לרבייה R. reniformis וזנים עמידים כותנה, שם ההתאוששות של צאצאי נדרש כדי לקדם גנוטיפים עמידים לדור הבא.

פרוטוקול מוצג עבור הקרנת בקנה מידה גדול של גנוטיפים כותנה עבור התנגדות נמטודות. המטרה היא לפתח שיטת הקרנה פשוטה ומהירה שאינה הרסנית כדי להעריך אוכלוסיות הרבייה כותנה עבור עמידות נמטודות על מנת לסייע ברבייה של מינים עמידים הכותנה. באמצעות פרוטוקול זה, נתונים מתקבלים בדרך כלל בתוך 35 ימים, עם יותר מ 300 גנוטיפים מוערכים בניסוי יחיד. נתונים מוצגים עבור גנוטיפים עמידים ורגישים כדי להמחיש את הווריאציה בדרך כלל הנצפים באמצעות שיטות אלה.

פרוטוקול

1. שמירה על מקור R. רנפורזה רשת

1. מילוי סירי חימר טרה כקוטה (15 ס"מ בקוטר, 13.5 ס מ בגובה) עם תערובת מפוסטר קיטור של 1-חלק חולית רקבובית ו 2 חלקים חול. הצמח עגבנייה חשופה (Solanum lycopersicon) מגוון בכל סיר ומניחים את הסירים בתוך החממה.
   הערה: סוגים אחרים של צמחים רגישים כגון כותנה ניתן להשתמש במקום עגבניה.
2. איחסן את צמחי העגבניות בעזרת תוספתן נמטודות (ראה שלב 3.3). שמרו על הצמחים בחממה בטמפרטורה של כ -28 ° c.

2. נטיעת גנוטיפים כותנה עבור R. רנפורזה הערכת התנגדות

1. הכינו קרקע על-ידי שילוב של 2 חלקים חול משובח עם 1-חלק חולית רקבובית שנאסף מהשדה.
2. קיטור מפוסטר את תערובת הקרקע כדי להבטיח כי הקרקע היא חופשית של נמטודות ו הקרקע הנישאים פתוגנים צמחים.
3. מוסיפים את תערובת האדמה לסירים מפלסטיק חרוטי (4 ס מ קוטר, 21 ס"מ גובה). לפני מילוי הסירים, מניחים כדור כותנה בתחתית הסיר כדי למנוע אובדן אדמה. ממלאים באופן חלקי את הסירים באדמה כ 2 ס מ מלמעלה.
4. הכינו יתד פלסטיק עבור כל סיר כדי לייעד את גנוטיפ להיות נטוע.
5. זרעי צמחי הכותנה שנבחרו להערכה.
   1. הצמח זרע אחד בכל סיר להערכת אוכלוסיות פנקסי, שבו כל זרע מייצג גנוטיפ ייחודי.
   2. עבור זנים של כותנה או האביזרים germplasm, צמח 2 כדי 3 זרעים בסיר אחד כדי להבטיח נביטה של צמח לפחות אחד עם שתילים אחרים הוסרו מן הסירים לפני נמטודות החיסון.
      הערה: לחילופין, זרעים יכולים להיות מונבטים עבור 24 כדי 72 h לפני שתילת כדי למזער את מספר הסירים עם זרעים לא קיימא.
6. זרעי הצמח של גנוסוגים שנבחרו עמידים ורגישים.
   הערה: גנוטיפים של שליטה משוכפלים 5 כדי 10 פעמים כדי להעריך וריאציות טבעיות הטבועה למתודולוגיה ההקרנה.
7. מילוי סירים עם אדמה נוספת כדי לכסות את הזרע בכל סיר.
8. הניחו את הסירים בחדר הגידול. שמרו על טמפרטורה קבועה של 28 ° c, טמפרטורת אוויר סביבתית, לחדר הגידול. לספק תאורה מלאכותית עם תערובת של פלורסנט מנורות ליבון עם 16 h photoperiod.
9. הניחו את המים בכל סיר, והמים את הסירים פעמיים ביום באמצעות מערכת השקיה אוטומטית. להתאים את מערכת השקיה כדי לספק מים נוספים כמו הצמח גדל.

3. מפעלי כותנה והכנת דגימות שורש

1. תמצית תוספתן reniform נמטודות מתוחזק על צמחי עגבניות רגישים (ראה שלב 1) באמצעות משחררות¹⁹ ו ציפה צנטריפוגליים²⁰ מתודולוגיות יום לפני החיסון. אחסן את הנמטודות המחולצים ב-4 ° c.
   הערה: הוצאת משפך ברמן²¹ היא שיטה חלופית להפקת נמטודות.
2. לקבוע את מספר נמטודות שחולצו על ידי ספירת מספר של נמטודות במדגם 100 μl משנה ולהכין השעיה של 1,000 נמטודות/mL במים ברז עבור החיסונים.
3. לחישוב שתילי כותנה 7 d לאחר שתילת עם ההשעיה נמטודות. ליצור דיכאון קטן באדמה ליד הצמח, ו פיפטה 1 מ ל של הבולם נמטודות של reniform לתוך הדיכאון.
4. הסרת צמחים מסירים 28 d לאחר חיסון להערכת נמטודות.
   הערה: בשלב זה, צמחים הם כ 15 ס"מ גבוה עם 4 עד 6 עלים מורחב לחלוטין.
   1. הסר את רוב העלים מורחבת במלואו מן הצמחים באמצעות מספריים לפני הסרת הצמחים מן הסירים.
   2. כדי להסיר את הצמחים מן הסירים, לסחוט את הסיר ולהחליק את האדמה לתוך היד.
   3. בעדינות להסיר את הקרקע מן השורשים על ידי שורש מערכת השורש במי ברז במיכל 10 L. שטפו בקצרה את מערכת השורש במיכל של מי ברז נקיים.
   4. הסר את מערכת השורש מהמפעל כ 1 ס מ מתחת לקו הקרקע באמצעות מספריים.
5. מניחים את מערכת השורש לתוך פלסטיק 120 mL, לא סטרילי, מכולה דגימה חד פעמית יחד עם יתד פלסטיק מן הסיר המשמש לזיהוי.
   הערה: דגימות מרובות מעובדות לפני שממשיכים לשלב 3.7. המשך לשלב 4 עבור התפשטות וגטטיבי של המפעל לירות.
6. להכין 12.5% (v/v) פתרון של מזון אדום צבע¹⁷ ב ברז מים כדי כתם נמטודות המצורפת למערכת השורש.
7. הוסף כ 30 מ ל של הפתרון האדום מזון צביעה למדגם השורש במיכל הדגימה כדי לכסות לחלוטין את מערכת השורש.
8. מניחים את המיכל דגימה במיקרוגל ומחממים את דגימת השורש עד שהפתרון הכתים מתחיל לרתוח. הסירו את הדגימה מהתנור והניחו למדגם להתקרר בטמפרטורת החדר.
9. Decant מזון אדום הפתרון צביעה ממדגם השורש ולהוסיף כ 100 mL של מי ברז למיכל הדגימה כדי להסיר את הכתם העודף. הניחו את המכסה על המיכל ואחסנו את המדגם במקרר ב-4 ° c. המשך לשלב 5 להערכת זיהום השורש.
   הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן לפני שתמשיך לשלב 5.

4. הפצת וגטטיבי לשחזור צמחים לייצור זרעים

1. מניחים כדור של כותנה בחלק התחתון של סיר פלסטיק חרוט (ראה שלב 2.3) ולמלא באופן חלקי את הסיר עם מדיה השתילה כבול איזוב. אז, המקום לירות וגטטיבי בסיר בחוזקה להוסיף מדיה השתילה כדי למלא את הסיר. מניחים יתד פלסטיק חדש בתווית בכל סיר כדי לייעד את גנוטיפ כותנה.
2. מקום מגש של סירים במיכל פלסטיק (73.6 ס"מ אורך x 45.7 ס"מ רוחב x 15.2 ס"מ גובה) עם מים ולזמן קצר את הצמחים כדי להרטיב את המדיה השתילה. מניחים את הסירים בחדר הגידול עם טמפרטורה קבועה של 28 ° c באמצעות מדחס 16 h photoperiod. הוסיפו מים נוספים למיכל הפלסטיק בהתאם לצורך לשמירה על לחות הקרקע.
3. להשתיל את הצמחים לסירים גדולים יותר לייצור זרעים לאחר כ 30 ד. מילוי חלקי 6 L סיר פלסטיק עם השתילה מדיה (ראה שלב 4.1), להסיר את הצמח מן הסיר הקטן, מקום הצמח לתוך 6 L סיר, ובחוזקה להוסיף מדיה השתילה כדי למלא את הסיר.
4. מניחים את הצמחים בתוך החממה ולהוסיף מים כדי להרטיב את התקשורת השתילה. שמרו על טמפרטורת החממה בטמפרטורה של כ -28 ° צ' (אין צורך בתאורה מלאכותית).
   1. צמחי מים בעבודת יד לפי הצורך בערך 30 ד.
   2. כאשר כ 75% של הצמחים דורשים השקיה יומית, צמחי מים מדי יום באמצעות מערכת השקיה אוטומטית. להתאים את מערכת השקיה אוטומטית למים לעתים קרובות יותר לפי הצורך בצמיחה צמח.
   3. להוסיף כ 10 גרם של דשן איטי שחרור לכל סיר לפני תחילת החניכה פרחוני.
5. הקציר צמחים בבגרות ולעבד את הדגימות כותנה זרע כדי להשיג זרעים להערכה נוספת.
   1. כדי לקצור זרעי כותנה, להסיר את הכותנה מן bolls פתוח על הצמח ביד ולמקם אותו בשקית נייר מתויג. הזרעים מחוברים לסיבי הכותנה שהוסרו בצעדים הבאים.
   2. הסירו סיבי מוך מדגימות הזרע. בעזרת ג'ין מעבדה של 10 מראות
   3. הסירו סיבי פלומה מדגימות הזרעים בעזרת חומצה גופרתית מרוכזת. לנטרל דגימות זרעים ב 15% (v/v) פתרון של נתרן פחמתי, לשטוף את הדגימות עם מי ברז, ולייבש דגימות במייבש האוויר כפויה.
   4. מקם את דגימות הזרעים במעטפות המסומנות בתווית עבור אחסון.

5. הערכת R. רנפורזה דלקת בשורש

1. הסר את דגימת השורש ממיכל הדגימה וספור את מספר הנמטודות הנקביים המצורפים למערכת השורש באמצעות הגדלה stereomicroscope (20X).
   הערה: רק נמטודות הנשי מסוגלים להדביק שורש הצמח.
2. מניחים את מערכת השורש על מגבות נייר כ 10 דקות כדי להסיר לחות עודפת. שוקלים את מערכת השורש כדי לקבוע את משקל השורש הצח.
3. הזן את ספירת נמטודות ונתונים משקל טרי שורש לתוך תוכנית גיליון אלקטרוני מחשב ולחשב את מספר הנקבות לכל גרם של השורש.

תוצאות

Rotylenchulus reniformis זיהום של מערכת השורש עבור שני זנים מוצג באיור 1. באופן יחסי פחות נשי reniform מסוגלים להקים אתר האכלה של גנוטיפ כותנה עמידים לעומת גנוטיפ רגישים. הגיוון בצמיחת השורש נפוץ בין היתר, כפי שמודגם באיור 2. וריאציה זו כפי שנמדד על ידי משקל שורש טרי יכול להיות גם נצפתה בין הצמחים של אותו גנוטיפ (שולחן 1). Gossypium העצים מראים לעתים קרובות שיעורי צמיחה נמוכה יותר השורש מאשר של ...

דיון

פרוטוקול סינון אפקטיבי נדרש עבור 1) זיהוי של R. reniformis כותנה עמידים הכותנה כדי להעריך את הגנטיקה של התנגדות 2) הרבייה של זנים עמידים. רוב הפרוטוקולים להעריך R. reniformis צפיפות אוכלוסין או שיעורי רבייה על ידי חילוץ תוספתן נמטודות או ביצים מן המערכת שורש כותנה או אדמת השתילה^{8,11,12,14,15} . גישות אלה לעתים קרובות יותר גוז...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ריי ליץ', קונוס סטיו	ובניו, בע"מ.	מגש חרוט SC10U
	Stuewe and Sons Inc.	RL98
כדורי כותנה
פילון 4 אינץ '(4 באורך x 5/8 במערב)	Pylon Platics	L-4-W	כל מותג או ספק מקובל.
4 אונקיות מיכלי דגימה	פישר סיינטיפיק	16-320-731	כל מותג או ספק מקובל.
צבע מאכל אדום	מקורמיק ושות', בע"מ
טיפים של 1 מ"ל Pipet	10
			דליים זולים שונים עובדים היטב.
6 סירים L	Nursery Supplies Inc.	פולי-טיינר-פחית No2A	כל מותג או ספק מקובל. ניתן להשתמש בעציצים בגדלים שונים
לעציצים	Sun Gro Horticulture	Metro-Mix 360	כל מותג או ספק מקובל.
דשן	Everris NA Inc.	אוסמוקוט פלוס	כל מותג או ספק מקובל.
מיכל פלסטיק (אורך 73.6 ס"מ × רוחב 45.7 ס"מ × עומק 15.2 ס"מ)	Rubbermaid	3O29	כל מותג או ספק מקובל.

חול שונים תוויות צמחים שונות של מיכל ליטר שונים מדיה