כתב יד זה מתאר את הסינתזה של ננו-צינורית פחמן קיר אחד (SWCNT)-מצומדת MALAT1 antisense gapmer דנ א oligonucleotide (SWCNT-נגד-MALAT1), אשר מדגים מסירת SWCNT אמין, חזק טיפולית והשפעת anti-MALAT1 במבחנה, ויוו. שיטות להשתמש של סינתזה, שינוי, ההטיה, הזרקה של SWCNT-נגד-MALAT1 מתוארים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
דיכוי צמיחת תאים מיאלומה In Vivo על ידי ננו-צינורית פחמן קיר אחד (SWCNT)-נמסר MALAT1 Antisense Oligos
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
ננו-צינורית פחמן קיר אחד (SWCNT) הוא סוג חדש של ננו-חלקיק, אשר שימש כדי לספק מספר סוגי סמים לתוך תאים, כגון חלבונים, oligonucleotides, תרופות סינתטיות מולקולה קטנה. SWCNT המימדים הניתנות להתאמה אישית, שטחי אזור גדול, באפשרותך לאגוד בגמישות עם סמים דרך שינויים שונים על פני השטח שלו; לכן, זה מערכת אידיאלי להעברת סמים לתוך התאים. זמן noncoding RNAs (lncRNAs) הם מקבץ של יותר מ 200 noncoding RNA nt, אשר לא יכול להיות מתורגם לחלבון אבל יש תפקיד חשוב בתהליכים ביולוגיים, הקשורים pathophysiological. גרורות-הקשורים ריאות אדנוקרצינומה התעתיק 1 (MALAT1) הוא lncRNA שנשמרת מאוד. הוכח כי רמות MALAT1 גבוהות קשורות על פרוגנוזה גרועה סוגי סרטן שונים, לרבות מיאלומה נפוצה (מ מ). נחשפו MALAT1 מווסת את תיקון ה-DNA ומוות תא מ מ; לפיכך, MALAT1 יכול להיחשב מטרה טיפולית עבור מ מ. עם זאת, oligo antisense מסירת יעיל כדי לעכב/נוקאאוט MALAT1 ויוו היא עדיין בעיה. במחקר זה, לנו לשנות את SWCNT עם פג-2000 ו נזווג oligo anti-MALAT1 אליו לבדוק את המשלוח של מתחם זה במבחנה, תזריק את זה דרך הווריד למודל בעכבר של מ מ המופץ, להתבונן על עיכוב משמעותי של התקדמות מ מ, אשר מציינת SWCNT הזה הוא הסעה משלוח אידיאלי עבור gapmer אנטי-MALAT1 ה-DNA.
מבוא
SWCNT הוא nanomaterial חדשניים שיכולים לספק סוגים שונים של תרופות, כגון חלבונים, מולקולות קטנות, חומצות גרעין, stably וביעילות עם סבילות אידיאלי, רעילות מינימלית חוץ גופית1 וויוו2. SWCNT functionalized יש נהדר מסיסות הביו ומים, יכול לשמש הסעות עבור מולקולות קטנות יותר, והוא מסוגל לשאת להן לחדור את קרום התא3,4,5.
lncRNAs הם מקבץ של RNA (> 200 nt) זה משוקלטים מן הגנום ל mRNA אבל לא ניתן היה לתרגם את החלבונים. הוכחה גוברת הראו כי lncRNAs להשתתף ברגולציה של ביטוי גנים6 , מעורבים הח....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הניסויים המערבות בעלי חיים אושרו מראש על-ידי IACUC מרפאת קליבלנד (אכפת לי חיה המוסדית והוועדה שימוש).
1. סינתזה של Functionalized SWCNTs
- מערבבים 1 מ ג של SWCNTs, 5 מ"ג של DSPE-PEG2000-אמין ו 5 מ ל מים נטולי נוקלאז סטיריליים בקבוקון נצנוץ זכוכית (20 מ ל). לנער את זה טוב כדי להמיס כל ריאגנטים לחלוטין.
- Sonicate את המבחנה ב sonicator אמבט מים ברמת הכוח של 40 W לשעה בטמפרטורת החדר (RT, מינימום 20 x 3, להחליף את המים כל 20 דקות כדי למנוע התחממות יתר). לאחר מכן, centrifuge זה ב x 24,000 g עבור 6-אייץ ' ולאסוף את הפתרון supernatant. ניתן לאחסן פתרון פונקציונלי זה SWCNT ב 4 מעלות צלזיוס למשך חודשיים.
- להוסיף ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כדי להדגים את השפעת עיכוב anti-MALAT1 gapmer-DNA מ מ, אנו הפיל את הביטוי של MALAT1, השתמש בה תאים H929 ו- MM.1S. ארבעים ושמונה שעות לאחר מכן, התאים שנאספו לניתוח של יעילות דפיקה למטה, מצב אפופטוזיס בתאים transfected עם אנטי-MALAT1 gapmer או פקד ה-DNA. לרביעיית-PCR התוצאות הראו כי ה-DNA gapmer אנטי-MALAT1 הפיל את הביטוי MALAT1 בתאים H929 ו- MM.1S ביעילות (איור 2א). המצב של אפופטוזיס נקבע על ידי cytometry זרימה, אשר חשף MALAT1 ולמטה מוסדר המושר.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הראיות הוכיחו כי lncRNAs לקחת חלק מרכזי בויסות פיזיולוגיים רבים ושגרות pathophysiological ב סרטן, כולל7,מ מ8,9; יש להם פוטנציאל להיות ממוקד לטיפול בסרטן, אשר יכול להתממש מאת antisense oligonucleotides20,21,22. המזון והתרופות האמריקני (FDA) אישר מספר תרופות antisense oligonucleotide, כולל fomivirsen עבור רטיניטיס cytomegalovirus
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
המחברים תודה את המכון לחקר לרנר פרוטיאומיה מבנית, גנומית, ואת ההדמיה ליבות לסיוע שלהם ותמיכה. מימון: עבודה זו נתמכה כלכלית על ידי NIH/NCI מענק R00 CA172292 (J.J.Z.) ואת ראשונית (ל J.J.Z.) ואת קלינית Translational המדע שיתופית (CTSC) של התיק Western Reserve אוניברסיטת הליבה ניצול טייס גרנט (ל J.J.Z.). עבודה זו מנוצל מיקרוסקופ קונפוקלי SP8 לייקה אשר נרכש עם מימון מוסדות לאומיים של בריאות סיג גרנט 1S10OD019972-01.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| SWCNTs | Millipore-Sigma | 704113 | |
| DSPE-PEG2000-Amine | Avanti Polar Lipids | 880128 | |
| סוניקטור אמבטיה | VWR | 97043-992 | |
| 4 מ"ל מסנן צנטריפוגלי | Millipore-Sigma | Z740208-8EA | |
| UV/VIS ספקטרומטר | תרמו פישר מדעי | accuSkan GO UV/Vis ספקטרופוטומטר | מיקרופלייטמקדם הכחדה של 0.0465 ליטר/מ"ג/ס"מ ב-808 ננומטר |
| Sulfo-LC-SPDP | ProteoChem | c1118 | |
| תמיסת DTT | Millipore-Sigma | 43815 | |
| NAP-5 עמודה | GE Healthcare | 17-0853-01 | |
| in vivo מערכת הדמיה | PerkinElmer | ||
| NOD. CB17-Prkdcscid / J עכברים | מעבדת צ'ארלס ריבר | 250 | |
| ציטומטר זרימה | Becton Dickinso | ||
| Lipofectamine | Invitrogen | 11668019 | Lipofectamine2000 |
| סרום בקר עוברי (FBS) | Invitrogen | 10437-028 | |
| RMPI-1640 בינוני | Invitrogen | 11875-093 | |
| MALAT1-QF: | מסונתז על ידי IDT פלוגה | 5'- GTTCTGATCCCGCTGCTATT - 3' | |
| MALAT1-QR: | מסונתז על ידי חברת | 5'- TCCTCAACACTCAGCCTTTATC - 3' | |
| GAPDH-QF: | מסונתז על ידי IDT Company | 5'- CAAGAGCAAGAGGAGAGAGAGAG - 3' | |
| GAPDH-QR: | מסונתז על ידי חברת | 5'- CTACATGGCAACTGTGAGGAG - 3' | |
| PCR כמותי באמצעות SYBR Green PCR master mix | Thermo Fisher Scientific | A25780 | |
| RevertAid ערכת סינתזת cDNA מעמד ראשון | Thermo Fisher Scientific | K1621 | |
| anti-MALAT1 | מסונתז על ידי IDT Company | 5'-mC*mG*mA*mA*mA*mA*C*A*T*T* *G*G*C*A*C*A*mC*mA*mG*mC*mA-3' | |
| ערכת בדיקת כדאיות תא | Promega Corporation | G7570 | CellTiter-GloLuminescent ערכת בדיקת כדאיות תאים |
| accuSkan GO UV/Vis ספקטרופוטומטר מיקרופלייט | תרמו פישר | ||
| Millipore-Sigma | UFC910008 | ||
| תוכנת SPSS | IBM | גרסה 24.0 | |
| D-Luciferin | Millipore-Sigma | L9504 |
מקורות
- Jiang, X., et al. RNase non-sensitive and endocytosis independent siRNA delivery system: delivery of siRNA into tumor cells and high efficiency induction of apoptosis. Nanoscale. 5 (16), 7256-7264 (2013).
- Murakami, T., et al.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
