Photobleaching מאפשר הדמיה ברזולוציה-העל של הטבעת FtsZ Cyanobacterium Prochlorococcus

Microscopies סופר רזולוציה ניתן לשבור את מגבלת עקיפה של אור, לספק תמונות תוך עקיפה משנה החלטות (< 200 ננומטר). הם היה בשימוש נרחב אורגניזמים רבים ללמוד חלבון לוקליזציה ומבנים subcellular. רס ן סופר-רזולוציה מיקרוסקופיה כוללים תאורה מובנית מיקרוסקופ (SIM), גירוי פליטה דלדול מיקרוסקופ (STED), סופה ו photoactivated לוקליזציה מיקרוסקופ (דקל). מנגנוני והיישומים של אלה רזולוציה סופר מיקרוסקופים כבר בדקתי במקומות אחרים^1,2.

סופה ניתן להשיג רזולוציה גבוהה כמו 10 ננומטר על ידי הפרדה מרחבית^3,4. . סטורם, מולקולה אחת בלבד בתוך אזור מוגבל עקיפה מופעל ("על"), השאר של המולקולות נשמרים מוחלש ("off"). על ידי הצטברות של מתג מהיר- לסירוגין - מולקולות יחיד, תמונת "עקיפה-בלתי מוגבל" יכול להיות שנוצר³. בינתיים, סוגים רבים של צבעי אורגניות וחלבונים פלורסנט ישימות בסערה, המאפשרת שדרוג קל של קרינה פלואורסצנטית רגילה מיקרוסקופ מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה^5,6.

הסערה לא הוחל נרחב תאים פוטוסינתטיים, כגון כחוליות, אצות, ודורש תאי צמחים עם מהכלורופלסט^7,8, אשר בשל העובדה הסערה עוצמת הלייזר גבוהה כדי נסיעה photoswitching. הלייזר בעוצמה גבוהה בעלת מרגש רקע חזק autofluorescence תאים פוטוסינתטיים, מפריע לוקליזציה מולקולה בודדת בתחום ההדמיה סערה. על מנת להשתמש סערה לחקור את המבנים subcellular או אינטראקציות חלבון תאים פוטוסינתטיים, פיתחנו פרוטוקול photobleaching כדי להרוות את אותות autofluorescence רקע⁹. במסגרת הליך שגרתי immunofluorescent מוכתמים, דגימות נחשפים אור לבן בעוצמה גבוהה במהלך השלב חסימה, אשר מוריד את autofluorescence של תאים פוטוסינתטיים כדי לעמוד בדרישות סערה. לפיכך, פרוטוקול זה הופך ריאלי לחקור אורגניזמים פיגמנט עם הסערה.

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול שישמש סערה תמונת הארגון טבעת FtsZ picocyanobacterium חד־תאיות Prochlorococcus. FtsZ הוא מאוד שנשמרת טובולין דמוי cytoskeletal חלבון אשר polymerizes כדי ליצור מבנה הטבעת (הטבעת Z) סביב היקף התא¹⁰ הוא חיוני עבור ה¹¹של חלוקת התא. נשמר Prochlorococcus תאים הן photobleached הראשון כדי להפחית את הרקע autofluorescent ואת immunostained עם נוגדן anti-FtsZ העיקרי, ואז נוגדנים IgG (H + L) משני הארנב אנטי מצומדת עם fluorophore (למשל , אלקסה עבור חיל הים 750). בסופו של דבר, סערה משמשת להתבוננות הארגונים מפורטת של הטבעת FtsZ ב Prochlorococcus בשלבים שונים של מחזור התא.

1. לטעום קיבוע והכנה

1. לחסן 1 מ"ל של axenic MED4 Prochlorococcus 5 מ ל מבוסס על מי ים Pro99 בינוני¹². מגדל Prochlorococcus תרבויות ב 23 ° C תחת האור עוצמה של 35 µmol פוטונים/m²ס כעבור חמישה ימים, לאסוף 1 מ"ל של תרבות לתוך צינור 1.5-mL.
   הערה: חמישה ימים לאחר חיסון Prochlorococcus MED4 יגיע שלב כניסה מאוחרת, עם 10⁸ תאים למ"ל, המתאימה עבור הדמיה סערה.
2. להוסיף 100 µL פורמלין שהוכנו זה עתה 25% paraformaldehyde (PFA) (w/v) ו- 2 µL של 50% גלוטראלדהיד לתוך צינור 1.5-mL כדי לתקן את התרבות. דגירה המדגם בחושך בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות.
   הערה: המדגם הוחזק בחושך קיבעון בגלל גלוטראלדהיד אור רגיש.
3. בדוגמה-13,500 x g עבור 1 דקות; לאחר מכן, להסיר את תגובת שיקוע, resuspend תאי µL 100 Pro99 בינוני¹². לאחסן את הדגימה ב 4 ° C עד immunostaining.

2. precoating של Coverslip עם חרוזי פוליסטירן

הערה: חרוזי פוליסטירן נחשבים סמן fiducial לתיקון סחיפה.

1. מערבולת המקורי בקבוקון של חרוזי פוליסטירן והכן לדילול 1:20,000 עם 50% אתנול כמו slurry עבודה.
2. להדליק את הכיריים, לקבוע את הטמפרטורה עד 120 ° C, ולמקם על coverslips על צלחת חמה.
3. לטעון µL 100 של slurry לעבוד על כל coverslip. דגירה את coverslip בצלחת חמים 10 דקות ולהעביר, אז בקפידה על coverslips פטרי עבור אחסון בטמפרטורת החדר.
   הערה: הצד עם החרוזים המחוברים זה צריך להתמודד, התאים אמור להיות מחובר באותו הצד. החרוזים ותשמרו על coverslips ומשמש שתיקנת את הדגימה-נסחפת בזמן אמת במהלך סערה הדמיה. לאחר שיתק את החרוזים, coverslips לא יכול להיות האדימו.

3. ציפוי של פולי-L-ליזין על גבי Coverslip מצופים חרוז

הערה: זה נעשה לאימוביליזציה של תאים cyanobacterial.

1. להוסיף 100 µL של פולי-L-ליזין (1 מ"ג/מ"ל) מרכז coverslip עם הצד מצופים חרוז פונה כלפי מעלה. . תן לזה לנוח למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
2. השתמש פיפטה בזהירות מתאווים כעיגולים בצבע פולי-L-ליזין ולהעביר אותו ל צינור 1.5-mL. שמור את פולי-L-ליזין ב 4 ° C לשימוש חוזר.
3. שוטפים את coverslip עם 10 מ"ל מים אולטרה-מסוננים בצלוחית 60 מ מ ומייבשים אז בקצרה את coverslip על מגבת נייר.
4. אחסן את coverslip בצלחת פטרי (100 מ מ) לשימוש מאוחר יותר. כדי למנוע את הקובץ המצורף של coverslip המנה, קו על צלחת פטרי עם שכבה של מצלמות-מיקרוסקופים.
   הערה: coverslip, precoated עם חרוזים, פולי-L-ליזין, ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר במשך לפחות חצי שנה. לכן, הכנת אוסף של coverslips מראש מומלץ מאוד.

4. בטקטיקות של תאים ב- Coverslip

1. העברה של coverslip precoated צלחת פטרי חדש עם מצלמות-מיקרוסקופים בתחתית, אשר יכונו כמו המנה מכתימים מעתה ואילך. לטעון µL 100 המדגם קבוע על coverslip ולתת לו לשבת במשך 30 דקות לאפשר התא מצורף.
2. להעביר את coverslip טוב של צלחת 12-ובכן, אשר יכונו כמו המנה כביסה מעתה ואילך. להוסיף 1 מ"ל של תמיסת מלח באגירה פוספט (PBS) (10 מ מ נה₂HPO₄, מ מ 1.8 ח'₂PO₄, מ מ 137 NaCl, ו 2.7 מ"מ אשלגן כלורי, pH 7.4) לבאר, כדי לשטוף את coverslip. להסיר את המאגר PBS ולהוסיף מאגר PBS חדש לשטוף את coverslip שוב.

5. permeabilization של תאים Cyanobacterial

1. הסר את המאגר הציבורי באמצעות פיפטה. להוסיף 1 מ"ל של מאגר permeabilization הטרי הטוב של המנה כביסה, המכילה 0.05% ללא יונית דטרגנט-100 (v/v), 10 מ מ EDTA, 10 מ מ טריס (pH 8.0), ו ליזוזים 0.2 מ"ג/מ"ל.
2. דגירה המנה כביסה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. לאחר מכן, להסיר את מאגר permeabilization.
3. להוסיף 1 מ"ל PBS מאגר ומניחים את צלחת כביסה על מטרף אשר מנענע בעדינות המנה כביסה עבור 5 דק. להסיר את המאגר PBS. חזור על שלב 3 x לשטוף את coverslip.

6. Photobleaching של כלורופיל פיגמנטים של שלב חוסם

1. להעביר coverslip את המנה מוכתמים. הוסף µL 50 מאגר חסימה, אשר מכיל 0.2% (v/v) ללא יונית דטרגנט-100 ו- 3% (v/v) עז סרום, בחלק העליון coverslip.
2. למקם את כל מכתימה את הצלחת על הקרח ולהעביר אותה תחת מקור האור קסנון עבור photobleaching לפחות 60 דקות, עם עוצמת האור-1,800 µmol פוטונים/m²·s.
3. לאחר photobleaching, חסימת, הסר בזהירות את המאגר חסימה על ידי adsorbing אותו עם הקצה של מגבת נייר.
   הערה: עוצמת האור קסנון הוא כל כך גבוה כי זוג משקפי שמש תקין נדרשת עבור הגנה העין. בינתיים, לעטוף את מקור האור, את הצלחת בעזרת רדיד אלומיניום כדי למנוע את הדליפה של אור, אשר עלול לגרום נזק לעין. בדוק את coverslip כל 15 דקות כדי לוודא כי coverslip נשאר לח. אם coverslip הוא יבש, להוסיף 50 µL מאגר חסימה.

7. הנוגדן מחייב

1. להמיס אנטי -Anabaena FtsZ נוגדנים ב 200 µL מים לפי הוראות היצרן.
2. למהול 1 µL של נוגדן anti-FtsZ לתוך µL 99 מאגר חסימה. תוסיפי coverslip 50 µL של נוגדן ראשוני מדולל, דגירה זה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
3. להעביר coverslip את המנה כביסה. להוסיף 1 מ"ל PBS מאגר ומניחים את צלחת כביסה על שייק. בעדינות לנער המנה כביסה עבור 5 דק. חזור על שלב 3 x לשטוף את coverslip.
4. להעביר coverslip את המנה מוכתמים. למהול 1 µL של נוגדנים משניים לתוך µL 500 מאגר חסימה. הוסף µL 50 של נוגדנים משניים מדולל על גבי coverslip, דגירה זה במשך 30 דקות בחושך בטמפרטורת החדר.
5. להעביר coverslip את המנה כביסה. לשטוף את זה עם 1 מ"ל PBS מאגר על מטרף. בעדינות לנער צלחת כביסה עבור 5 דק גלישת המנה כביסה בנייר אלומיניום כדי שיהיה אור-הוכחה. חזור על שלב זה, 3 x.
6. להוסיף 500 µL פורמלין שהוכנו זה עתה 4% paraformaldehyde (PFA) (w/v) הבאר. דגירה את coverslip למשך 15 דקות בחושך בטמפרטורת החדר.
7. הסר את הפורמלדהיד, חזור על השלב כביסה 3 x.
8. לאחסן את coverslip במאגר PBS ב 4 ° C בחושך עד הדמיה.

8. הכנת הסערה הדמיה מאגר

1. להכין 1 מ"ל של הדמיה מאגר לפי טבלה 1, מיד לפני הסערה ההדמיה.
   הערה: כמו חיי המדף של המאגר הדמיה הוא בערך 2 h, להכינו טרי, לפני השימוש. להימנע vortexing לאחר התוספת של גלוקוז אוקסידאז, קטלאז.
   התראה: מתיל viologen הוא חומר רעיל. אנא טפל בו מסוים. Cyclooctatetraene מסווג כ קרצינוגן החתול. 1 כימי. בבקשה להימנע משאיפת ואת העור קשר ולעשות את הפתרון מניות cyclooctatetraene ואת מאגר הדמיה בשכונה כימי.

9. תמונות רכישת נתונים סערה

1. טען את coverslip בבית הבליעה טעינה (איור 1). לטעון למאגר הדמיה הטרי בעדינות לתוך החדר כדי להימנע לשטוף את התאים cyanobacterial. המקום coverslip מלבנית על המאגר הדמיה כדי למנוע שלה תגובה עם חמצן באוויר. למנוע השמנה בועות אוויר מתחת coverslip.
2. הפעל את המצלמה, נורית ה-LED ו הלייזר. תוכנת סופה פתוח עבור ייבוא תמונות, קביעת מיקום centroid מדגם נסחף תיקון¹³.
3. להוסיף חצי טיפה של שמן טבילה על גבי העדשה. לטעון התא ולוודא את העדשה של המטרה יוצר קשר עם coverslip.
4. לבחון את האות עם לייזר-750 ננומטר.
   הערה: תמיד כוללים השני נוגדן-מינוס-צביעת שלילי פקד כדי להבטיח autofluorescence פוחתת.
5. זיהוי אזור הדגימה המכילה תאים סמנים fiducial. הפעל את התוכנה עבור מדגם נסחף תיקון.
   הערה: באופן כללי, אזור הדגימה אידיאלי מכיל תאים 10-30. בינתיים, התאים להפרידם גם כדי למנוע כל בתאים החופפים.
6. רוכשים תמונה אחת שדה רחב כהפניה, עם מצלמה אלקטרון הכפלה (EM) לזכות ב 300 וזמן חשיפה של 30 ms (איור 2 א).
7. להגביר את עוצמת הלייזר-750 ננומטר עירור לכוח עליון, כ 4.5 קילוואט/ס מ². ברגע fluorophores יש מעבר מיגדרי לתוך תבנית מהבהב דליל, רוכשים תמונה ברזולוציה סופר אחד על ידי איסוף מסגרות 10,000 ב- 33 הרץ (איור 2B).
   הערה: אם fluorophores אינן מבודדות, המתן מספר דקות עד fluorophores יותר מוחלפות המדינה כהה מולקולות יחידה מבודדת להבהב ברצף. מספר המסגרות המתוארים כאן מתאים הדגימה וצריך להיות אופטימיזציה עבור מבנים יישוב אחרים.

10. שחזור של תמונות סופר-ברזולוציה מן הנתונים הגולמיים

1. להשתמש תוסף בשם QuickPALM (טבלה של חומרים)¹⁴ ImageJ לבנייה מחדש של תמונה ברזולוציה סופר צבע תלת-ממדי.
   הערה: ראשוני כרומטית תמונה (איור 2C) יחד עם בר סולם מקודדות לפי צבעים (איור 2C) יופיעו. הצבע מייצג את העומק על ציר z.
2. כדי להדגים תלת-ממד מבנה בתוך מבנה וידאו, ערימה של הסופר-רזולוציה תמונות עם ציר z למחלקה כל 10 ננומטר באמצעות QuickPALM¹⁴. כוונן את הבהירות של המחסן ולשכפל את ערימת תא מטרה אחת. להשתמש תוסף הנקרא תלת-ממד ' מציג ' (טבלה של חומרים)¹⁵ ImageJ להפיק תמונה תלת-ממדית של התא. להקליט את הסיבוב של מבנה תלת-ממדי למטרות הדגמה.

הסערה משיגה הדמיה ברזולוציה סופר על ידי הפעלת photoswitchable בודדים fluorophores stochastically. המיקום של כל fluorophore נרשם, תמונה סופר-ברזולוציה ואז נבנה בהתבסס על מיקומים אלה4. לכן, מידת הדיוק של המיקום fluorophore חשוב עבור שחזור התמונה ברזולוציה-העל. ספקטרום הבליעה של Prochlorococcus לשיא 447 nm ו 680 nm,ו Prochlorococcus יש קליטה המינימלי באורכי גל מעל 700 nm16. עם זאת, תאים Prochlorococcus MED4 עדיין הנפלטים autofluorescence גבוהה כאשר הם נחשפים עוצמה גבוהה מאוד של הלייזר-750 ננומטר (איור 3 א), אשר נדרש עבור הדמיה סערה. לפיכך, רקע autofluorescence גבוהה של תאים Prochlorococcus בכבדות מפריע הדמיה ברזולוציה-העל.

על מנת לנצל את סטורם לחקור ארגונים חלבון Prochlorococcus, פיתחנו שיטה photobleaching. לאחר חשיפה אור לבן בעוצמה גבוהה למשך 30 דקות, autofluorescence של תאים MED4 Prochlorococcus ירד (איור 3B), למרות מספר תאים עם autofluorescence עדיין זוהו. אנחנו עוד יותר מאורך הזמן photobleaching 60 דקות ומצא כי הרוב המכריע של התאים איבד שלהם autofluorescence (איור 3C). תוצאות אלו מצביעות על שיטת photobleaching שפיתחנו כאן יכול להקטין באופן משמעותי את autofluorescence אורגניזמים פוטוסינתטיים.

לאחר photobleaching, הצלחנו להשתמש סופה כדי להמחיש את חלוקת התא חלבון FtsZ ב Prochlorococcus MED4 תאים. Cyanobacterium Prochlorococcus הוא הקטן ביותר של האורגניזם פוטוסינתטיים הנפוץ ביותר על פני כדור הארץ17. הקוטר של תא Prochlorococcus הוא רק 500-700 nm18. עם כזה בגודל תאים קטנים, זה בלתי אפשרי לדמיין הארגון טבעת FtsZ בתאים Prochlorococcus באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות רחב-שדות קונבנציונלי (איור 2 א). עם זאת, סופה יש רזולוציה מרחבית של 9.6 nm, מישור xy, 41.6 nm, ציר z. באמצעות סערה, הצלחנו לחשוף תאור מפורט של הטבעת FtsZ Prochlorococcus (דמויות 2B ו- 4). על ידי סיבוב תלת-ממדי הסופה תמונות, זיהינו ארבעה סוגים של FtsZ הטבעת מורפולוגיות: אשכולות (איור 4A, הסרט S1), טבעת לא שלם (איור 4B, הסרט S2), טבעת מלאה (איור 4 C, הסרט S3), כפול טבעות (איור 4 D, S4 הסרט). פערים היו הנהוגות הטבעות FtsZ מלאה של Prochlorococcus (איור 4C, הסרט S3), הדומה לזה שנמצא Caulobacter cresentus19. אלה ארבעה סוגים של FtsZ הטבעת מורפולוגיות הראה את תהליך ההרכבה של הטבעת FtsZ במהלך מחזור התא של Prochlorococcus, מחקר זה עזר לנו להבין את התפקיד של הטבעת FtsZ במהלך חלוקת התא Prochlorococcus 9.

איור 1: מרכיבי תא טעינה ו תא התאספו עם המאגר coverslips והדמיה לדימות סערה. Coverslip עם הדגימה הונח על החריץ של החלק התחתון קודם. החלק העליון ואז שנדפקתי בקפידה על החלק התחתון. המאגר הדמיה הוסיף בבית הבליעה הטעינה, ואז בזהירות מכוסה coverslip מרובע. יש להימנע בועות כדי למזער את כל תנועה עשוי להשפיע על הדיוק של המדידה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2: שדה רחב נציג דו-ממדיים סערה תלת-ממד צבעים, תמונות סופה של FtsZ ב Prochlorococcus MED4. התמונות נלקחו מאותו שדה הראייה באמצעות מיקרוסקופיית שדה רחב (A) רגילים, סופה 2-D (B) (C) צבע תלת-ממדי הסופה. הצבעים בחלונית C מציינים את עומק אותות פלואורסצנט על ציר z. המספרים בלוח C מציינים את התאים של עניין. פסי בקנה מידה = 1 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3: Photobleaching של Prochlorococcus MED4. קבוע Prochlorococcus MED4 (א) לא photobleached היו תאים, או שהם היו photobleached עבור (B) 30 min ו- (ג) 60 דקות. האור קסנון XD-300 שימש בעוצמה של 1,800 µmol/m2·s. התאים היו נרגשים על ידי לייזר-750 ננומטר מעוצמת אותה כפי נעשה שימוש עבור הדמיה סערה. Autofluorescences היו עם תמונה עם המסננים באותו המשמשים בסערה כדי לוודא הנוכחות של autofluorescence מינימלית כדי להשפיע על סופה. פסי בקנה מידה = 2 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 4: סערה נציג תמונות של ארבעה מורפולוגיות טבעת FtsZ. ארבעה שונים FtsZ הטבעת מורפולוגיות נצפתה Prochlorococcus: אשכולות (א), (B) שלם טבעת, טבעת (C) מלאה, טבעות כפול (D). באותו התא, הוצגו תמונות של קרינה פלואורסצנטית (i) רחב-שדה מיקרוסקופ, (ii) על המטוס xy, ולהתגבר (iii) סערה לאחר הסיבוב. בסרטים תלת-ממדיים המתאים לתאים פאנלים א', B, Cו- D מוצגים סרטים S1, S2, S3 ו- S4, בהתאמה. פסי בקנה מידה = 500 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

טבלה 1: מתכון עבור מאגר הדמיה.

S1 הסרט: אשכולות של חלבונים FtsZ הנהוגות Prochlorococcus תאי MED4. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)

סרט S2: טבעת לא שלם של חלבונים FtsZ הנהוגות Prochlorococcus תאי MED4. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)

S3 הסרט: טבעת מלאה של חלבונים FtsZ הנהוגות Prochlorococcus תאי MED4. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)

S4 הסרט: טבעת כפולה של חלבונים FtsZ הנהוגות Prochlorococcus תאי MED4. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)

המחברים אין לחשוף.