באמצעות מערכות רובוטיות כדי לעבד ולהטביע דגימות מאתר חוקן עבור ניתוחים היסטולוגית

Summary

היעדר סטנדרטיזציה לעיבוד רקמות מאתר מפחית את האיכות של ניתוח histopathological מאתר לעומת דגימות אנושי. כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לבצע בדיקה histopathological מאתר מודלק, uninflamed הגס רקמות כדי להראות את הכדאיות של מערכות רובוטיות בשימוש שגרתי עבור עיבוד והטבעה דגימות אנושי.

Abstract

ההבנה של מחלות האדם הורחבה במידה רבה בזכות המחקר בבעלי חיים כמודלים. למרות זאת, הערכת histopathological ניסיוניות צריך להיות קפדני ביותר כמו להחיל עבור דגימות אנושי. אכן, הסקת מסקנות אמין ומדויק באופן ביקורתי מושפעת האיכות של רקמות סעיף הכנה. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול לניתוח histopathological של רקמות מאתר המיישמת מספר פעולות אוטומטיות במהלך ההליך, משלב הכנת הראשונית ועד פרפין הדגימות מאתר. ההפחתה של משתני מתודולוגי באמצעות פרוטוקול קפדני סטנדרטיזציה של שגרות אוטומטיות תורמת האמינות הכוללת של מאתר ניתוח פתולוגי. באופן ספציפי, פרוטוקול זה מתאר את הניצול של עיבוד ממוכן, הטמעת מערכות רובוטיות, בשימוש שגרתי עבור עיבוד רקמות ופרפין הטבעה של דגימות אנושי, לעבד מאתר דגימות של דלקת מעיים. . נסיים המהימנות של histopathological בחינת רקמות מאתר זה גדל באופן משמעותי עם הקדמה של טכניקות מתוקננת ואוטומטיים.

Introduction

בעשרות השנים האחרונות, פותחו מספר גרסאות ניסיוניות לנתח את המנגנונים פתוגניים שמוביל מחלות אנושיות^1,2. כדי להעריך את חומרת המחלה, החוקרים חייבים להעריך את ההשפעה של טיפול וללמוד את הווריאציות אדריכלי cytological, היסטולוגית או הסכום של דלקת³. כדי לבצע על אלה גרסאות ניסיוניות, ניתוח histopathological מפורט נדרשים, לעיתים קרובות השוואה בין דגימות מאתר האנושי^4,5.

בנוסף, דגימות האנושית בדרך כלל מעובדים שבוים על ידי מתקני histopathology, מנוסה פתולוגים האנושית דרך סטנדרטית ושיטות histopathological. לעומת זאת, רקמות מאתר בדרך כלל קבוע, מוטבע, נותחו על ידי החוקרים עם ניסיון מוגבל של פרוטוקולים histopathological. האיכות והאמינות של בדיקה histopathological מתחיל עם הכנת קטעי רקמה באיכות גבוהה. מספר גורמים תורמים באופן ביקורתי הגדל או הקטן האיכות של הניתוח הסופי, כולל קיבוע, מאקרוסקופית חלוקתה, עיבוד, שעוות פרפין הטבעה, והטבעה של דגימות^6,7.

כל הקטעים מעורבים מניפולציה של המדגם נחשפים שגיאות, כולל שיבוץ ידני של הדגימות ובמידה פחותה יותר, ידני מיקרוטום חלוקתה, מכתים. כיום, התהליך כולו של רקמות מאתר לקראת הערכה היסטולוגית מסתמך על פרוטוקולים של משתנים מעבדה מעבדה ופרוטוקולים ידנית. מטרת מחקר זה היא ליישם מתוקננת פרוטוקולים אוטומטיים כדי להפחית שגיאות ולשינויים בבדיקה histopathological מאתר.

לידע שלנו, נתאר כאן את הפרוטוקולים הראשון בשביל לרקמות אוטומטית לחלוטין עיבוד והטבעה על הערכה היסטולוגית של רקמות מאתר; אלה משמשים באופן שגרתי ביחידות פתולוגיה עבור הבדיקות דגימות תאים של בני. דוגמה מעשית של הכדאיות של השיטה, מודל מאתר של דלקת מעיים נותחה, קרי, המודל קוליטיס כיבית כרונית הנגרמת על ידי הממשל חוזרות ונשנות של לתוספי סודיום סולפט (DSS) מי השתייה^{8 ,9}. ההגדרה ניסיוני מקרוב דומה האדם מעי דלקתיות (מחלת המעי הדלקתי) מחלות¹⁰ מאז שטופלו DSS בעלי חיים מגלים סימנים של דלקת מעיים, למשל, ירידה במשקל, צואה רופף או שלשול ו לקיצור של המעי הגס, כמו גם פיברוזיס ^89,,11. כפי שנצפו בחולים אנושיים מחלת המעי הדלקתי, טיפול DSS יוצר קורס מחלה מורכבת. בהקשר זה, הערכות היסטולוגית משוכלל נדרשים להבין את שינוי מעמיק של הארכיטקטורה רקמות. לכן, היישום של הפרוטוקולים שתואר להגברת איכות הכנה מדגם יועיל חוקרים להסתמך על הפרשנות של היסטולוגית וניתוחים immunohistochemical עבור הגדרות ניסיוני מאתר. מאתר ניסיוניות של מחלות האדם המערבים שינויים של האדריכלות רקמות, הנוכחות של רקמת הסלולר לחדור או דלקת ברקמות שונות ואיברים (המעי, המוח, הכבד, העור) יכול להשתמש איכות מוגברת הכנת הדוגמא לבדיקה histopathological.

Protocol

ההליכים בבעלי חיים אושרו על-ידי משרד הבריאות (אימות 127/15, 27/13) איטלקית ועקבתי אחר ההנחיות טיפול בבעלי חיים במכון האירופי לאונקולוגיה IACUC (טיפול בעלי חיים מוסדיים והוועדה שימוש)

1. קוליטיס כיבית כרונית אינדוקציה על ידי המינהל DSS חוזרות

1. ומין נפרד התאימה עכברים 2 קבוצות (טיפול DSS לעומת שליטה H₂O, לפחות 5 הארנבונים מאותה עכברים לכל קבוצה ניסיונית).
2. לנהל 2.5% DSS (40 kDa) במי השתייה 7 ימים לקבוצה טיפול ומים לקבוצת הבקרה.
   הערה: מודל זה גורם דלקת מעיים כרונית transmural⁹.
3. לאחר 7 ימים, הפסק הטיפול DSS ולתת מים בשתי הקבוצות למשך 14 ימים. חזור על תהליך זה 3 פעמים.
   הערה: ניהול חוזרות של DSS גורם שינויים של רירית המעי הגס מקרוב הדומה מחלת המעי הדלקתי האנושי, קרי, פיברוזיס⁹.
4. להקריב עכברים בהתאם לנוהל הסמיכו את IACUC מוסדיים, קרי, על ידי שאיפת₂ CO.
5. פתח צפק והבטן העכבר עם איזמל.
   הערה: עקרות מומלץ אך לא הנדרשת.
6. להפריד את המעי הגס המעי הדק עם מלקחיים, פינצטה. בלו המעי הגס עם פינצטה וחדים.
   הערה: מדידת אורך המעי הגס (איור 1 א') היא שיטה כדי לקבוע אם קוליטיס בעכברים שטופלו DSS.
7. לשטוף את המעי הגס בצלוחית עם 10 מ"ל של קר 1 x פוספט מאגר תמיסת מלח (PBS) והקש בעדינות כדי להסיר את החומר הצואתי.

2. מאתר רקמות קיבוע

1. לטבול כל הדגימה המעי הגס מאתר ב 10 מ"ל של 10% נייטרלי Buffered פורמלין (NBF) ב RT (טמפרטורת החדר).
   הערה: עקרות מומלץ אך לא הנדרשת.
2. לתקן את הרקמה עבור 18 – 24 h-RT.

3. המעי הגס חלוקתה והכנות רקמות

1. להסיר רקמות קבוע של המכולה NBF עם פינצטה קטנה, לשים אותם בצלחת פטרי. לשים את המעי הגס על צלחת עבודה אופטים עם פינצטה קטנה.
2. חותכים נקודתיים קטעים (0.2 ס"מ ל 0.3 ס מ אורך) עם איזמל סטרילי. אורך קטע זה הוא אופטימלי כדי לא לחרוג העובי בקלטת.
3. להרים קטע המעי הגס אחת עם מלקחיים קטנים (איור 2 א). הוסף מקטע המעי הגס אחד לאחד הפלסטיק קצוות של פרפין orientated הטבעה קלטת עם פינצטה קטנה (איור 2B) בולטות.
4. חזור על פעולת (3.2 – 3.3) מקטעים הגס 3 נוספים לכל קלטת. למנוע החדרת המקטעים לתוך טיפים בולטות סמוכים, כדי למזער חפיפה של רקמות
5. סגור בחוזקה את הקלטת על ידי דחיפת בקפידה ארבעת הקצוות (איור 2C). הימנע לסחוט את הרקמה כדי למנוע נזק לרקמות.
6. הכנס את הרשת לתוך מסגרת תומכת פלסטיק. תווית המסגרת התומכת כדי לזהות את הדגימה. חזור על כל דגימה ביולוגית.

4. ברקמה

1. הפעל את המעבד אוטומטית על-ידי לחיצה על לחצן ההפעלה (איור 3A, 3B).
2. לחמם 1 h כדי להבטיח פרפין שעווה נמסה. המתן עד המכשיר מאשרת שהפרפין הוא נמס לגמרי, על ידי התבוננות הנוכחות של הסמל ייעודי (איור 3C).
3. הכנס כל אוריינטציה קלטת (מכיל דגימות רקמה) ידנית לתוך הסל מתכת שסופקו על-ידי המעבד אוטומטיות (דמות תלת-ממד). במקום הקלטות אנכית על ידי רירית אותם קרוב אחד לשני כדי למטב את תפוסת סל.
4. סגור את סל מתכת (איור 3E).
5. פתח את המכסה של התשובה (איור 3F). התשובה היא המקום שבו הסל מוכנס לתוך המכונה. הכנס את הסל הדיור ייעודי של המעבד (איור 3G). . סגור את המכסה של התשובה (איור 3 H)
6. השתמש במסך המגע במחשב כלי כדי להגדיר פרוטוקול עבודה (איור 3עכשיו). בחר את הרצף של פתרונות, תזמון, טמפרטורה יש ליישם על פי התכנית המפורטת טבלה 1.
7. להקצות פרוטוקול לפי התשובה המכילה הסל על-ידי לחיצה על סמל מחשב ייעודי (איור 3J). התחל את הפרוטוקול על ידי לחיצה על לחצן ' התחל ' (איור 3 L).
8. המתן עד המכשיר מאשרת הסוף לפרוטוקול, על ידי התבוננות הנוכחות של הסמל ייעודי על ידי שמיעת הצליל מעורר מגיע מהמכונה.
9. פתח את המכסה אביק. הסר את הסל המעבד (איור 3 מ').

5. רקמות הטבעה

1. הפעל את embedder אוטומטית על-ידי לחיצה על לחצן ההפעלה (איור 4A).
2. לחמם 1 h כדי להבטיח פרפין שעווה נמסה. המתן עד המכשיר מאשרת שהפרפין הוא נמס לגמרי על ידי התבוננות הטמפרטורה של האמבטיה פרפין שמציין את המדחום הפנימי של המכשיר.
3. העברה ידנית כל הקלטות מעובד מן הסל מעבד אל המדף embedder. כל ארון תקשורת יכול להכיל עד 32 קלטות. (איור 4B, 4 C).
4. פתח את המכסה embedder הראשי (איור 4C, 4 D, 4E).
5. השתמש במסך המגע במחשב כלי כדי לאותת לדרג רובוטית מערכת מתלה זה להיות מוכנס (איור 4F).
6. פתח את המכסה דיור כניסת (איור 4G). הכנס ארון התקשורת הדיור מפרץ צר. כל embedder יכולים להכיל עד 4 ארונות תקשורת בו זמנית (איור 4 H, 4I). . סגור את המכסה דיור כניסת (איור 4J)
7. השתמש במסך המגע במחשב כלי כדי להתחיל את ההליך ההטבעה, לפי טבלה 2 (איור 4 K).
   הערה: כל מדף קלטות 32 לוקח 45 דקות שיהיה מוטבע.
8. המתן עד המכשיר מאשרת את הסוף של הפרוטוקול, על ידי התבוננות הנוכחות של הסמל ייעודי (איור 4 L).
9. הסר את המדף אאוטלט (איור 4 מ'). . סגור את המכסה embedder הראשי
10. הסר את אבני מוטבע (המכיל את רשתות התמצאות) ארון התקשורת. להעביר בלוקים מוטבע בתוך קופסת קרטון אחסון.

6. מיקרומטר חלוקתה

1. להפוך על צלחת קירור האזמל הקטן. הגדר את הטמפרטורה בין -8 ו-10 ° C.
2. הפעל את האמבט במים תרמוסטטי האזמל הקטן, המכיל 2 ל' מים מזוקקים. הגדר את הטמפרטורה של האמבטיה מים בין 42-45 מעלות צלזיוס.
3. המקום הפרפין מוטבע בלוקים על לוח הקירור. המתן לפחות 5 דקות כדי לאפשר את אבני להתקרר.
4. לוקחים גוש בניינים אחד מהצלחת קירור ולמקם אותו לתוך המחזיק בלוק מיקרוטום.
5. הגדר את האזמל הקטן לחתוך עובי 10 מיקרומטר לקצץ גוש על ידי חיתוך זה פי 6-10 מיקרומטר עובי.
6. לשנות את הגדרת עובי האזמל הקטן מ- 10 מיקרומטר לסעיף 3 מיקרומטר. חתך אחד 3 מיקרומטר עבור Hematoxylin ואאוזין (H & E) מכתים.
7. לאסוף את סעיף 3 מיקרומטר עם מברשת קטנה. לשים את המקטע מיקרומטר 3 באמבט מים, הנחת אותה בזהירות על פני המים כדי להפחית קמטים רקמות. לאסוף בסעיף רקמות לאמבט מים מבוקרת thermostatically על משטח זכוכית בודד.
   1. אם יש צורך, לחתוך קטעים נוספים.
8. תווית השקופית זכוכית על-ידי כתיבת זיהוי הדגימה.
9. הכניסו את השקופיות תנור 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לפחות.
10. מכניסים שקופיות זכוכית ארונות תקשורת עבור ניתוח מיידי או בקופסאות אחסון.

7. hematoxylin והוא מכתים אאוזין (H & E)

1. . הפעילי את הוספת גוון לסמלים אוטומטית על-ידי לחיצה על לחצן ההפעלה לאפשר האתחול בזרוע רובוטית, על ידי התבוננות השינוי של הבר העמסה על צג המכשיר.
2. הכנס את השקופיות זכוכית המדף הוספת גוון לסמלים, אנכית הוספת שקופיות עד 30.
3. תווית המדף עם תג פלסטיק זיהוי (RFID) המתאים תדר רדיו. RFID תיוג היא מערכת זיהוי הנוהל מכתימים נטען לתוך המחשב הוספת גוון לסמלים.
4. הכנס המתלה הוספת גוון לסמלים. לאפשר את המחשב כדי לטעון באופן אוטומטי ולהתחיל את פרוטוקול מכתימים לפי ההכרה של תג RFID.
   הערה: הפרוטוקול עבור צביעת המטוקסילין מתואר ב- טבלה 3-

8. נוגדן

1. לבצע immunohistochemical ומלורי trichrome מכתים כפי שתואר לעיל⁷.

Results

ניסיוני קוליטיס כיבית כרונית הנגרמת על ידי הממשל חוזרות ונשנות של DSS במי השתייה הוא מודל מאתר של דלקת מעיים מקרוב הדומה מחלת המעי הדלקתי האנושי^8,9. איור 1 מתאר את השפעת הטיפול DSS, כולל קולון קיצור (איור 1 א'), שימוש נרחב פרמטר ציון הנוכחות של דלקת הנגרמת DSS, וביטוי חוקן של גנים פרו דלקתיים כולל CXCL10 , tnf ו- mcp-1 (איור...

Discussion

אנו מנצלים את השלבים אוטומטיות שונות במהלך ההכנות של רקמות מאתר ניתוח histopathologic. פרוטוקול זה מכוון לספק רמזים טכני כדי להגדיל את הפארמצבטית ותקינה של התהליך כולו, ובכך שיפור האיכות הכוללת של הערכת histopathological הסופי. אנחנו ליישם כלים אוטומטיים ושיטות ההכנה והטבעה של רקמות, בשימוש שגרתי פתולוגיה במתקני הליבה לצורך המחקר דגימות תאים של בני.

כדי להדגים את הישימות פוטנציאלי של שיטה זו, בחרנו כרונית קביעה ניסויית מאתר של דלקת מעיים, הנקרא מודל DSS-induced קוליטיס כיבית כרונית. הגדרה זו ד...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
אתנול נטול מים	מוחלט קרלו ארבה	414605	מגיב
Absolute ETOH	Honeywell	02860-1L
אלומיניום אשלגן גופרתי	SIGMA	A6435	מגיב
אנילין כחול	SIGMA	415049	מגיב
קרבול פוקסין	SIGMA	C4165	מגיב
CD11b (שיבוט M1/70)	TONBO biosciences	35-0112-U100	נוגדן
CD20 IHC (שיבוט SA275A11)	Biolegend	150403	נוגדן
CD3 (17A2)	TONBO biosciences	35-0032-U100	נוגדן
CD4 (GK1.5)	BD Biosciences	552051	נוגדן
CD45.2 (שיבוט 104)	BioLegend	109837	נוגדן
CD8 (53-6.7)	BD Biosciences	553031	נוגדן
ציטראט מאגר pH 6 10x	SIGMA	C9999	מגיב
Dab	Vector Laboratories	SK-4100	מגיב
DPBS 1x	Microgem	L0615-500	מגיב
DSS	TdB ייעוץ	DB001	מגיב
EDTA	SIGMA	E9884	מגיב
EnVision Flex מגיב חסימת פרוקסידאז	DAKO		compreso ב-GV80011-2
EnVision Flex Substrate	DAKO		compreso ב-GV80011-2
EnVision Flex/HRP	DAKO		compreso ב-GV80011-2
EnVision Flex+ Rat Linker	DAKO		compreso ב-GV80011-2
Eosin	VWR	1.09844	Reagent
F4/80 (שיבוט BM8)	נוגדן BioLegend	123108
פורמלין	PanReac	2,529,311,215	מגיב
חומצה אצטית קרחונית	SIGMA	71251	מגיב
עז-אנטי-חולדות-HRP	Agilent DAKO	P0448	נוגדן
המטוקסילין	DIAPATH	C0303	מגיב
LEICA מיקרוטום סיבובי (RM2255)	Leica	RM2255	ציוד
Ly6g (שיבוט 1A8)	BD Biosciences	נוגדן 551459
Mercury II Oxide	SIGMA	203793	מגיב
Omnis Clearify Clearify Clearing Agent	DAKO	CACLEGAL
מגיב Omnis EnVision Flex TRS	DAKO	GV80011-2	מגיב
כתום	G SIGMA	O3756	מגיב
פרפין	סאקורה	7052	מגיב
פלוריס	LEICA		ציוד
Percoll	SIGMA	P4937	מגיב
RPMI 1640 ללא L-גלוטמין	Microgem	L0501-500	מגיב
STS020	ציוד Leica
רקמה-Teck Paraform קלטת ניתנת לחיתוך	SAKURA
Tissue-Tek משקע פרפין אוטומטי	סאקורה
קסילן	J.T.Baker	8080.1000	מגיב