הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ייצור של מטריקס הסחוס, נגזר Decellularized פיגומים

10.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/58656

⸱

7 בינואר 2019

 ,  ,  , 
1Department of Orthopedics, University Medical Center Utrecht, The Netherlands, 2Department of Veterinary Medicine, Equine Surgery, University of Utrecht, The Netherlands

במאמר זה

סיכום

פיגומים הסחוס, נגזר decellularized יכול לשמש בדומה לפיגום כדי לתקן סחוס מדריך וכאמצעי לחדש רקמות osteochondral. מאמר זה מתאר את התהליך decellularization בפירוט ומספק הצעות להשתמש פיגומים אלו בהגדרות במבחנה.

תקציר

פגמים Osteochondral חוסר יכולת תיקון מהותי מספיק להתחדש באופן פונקציונלי קול רקמת עצם, סחוס. במידה זו, סחוס המחקר התמקדה הפיתוח של פיגומים משובי. מאמר זה מתאר את ההתפתחות של פיגומים הנגזרים לחלוטין מטריצה חוץ-תאית טבעיים הסחוס, מגיע תורם הרכיבה. יישומים אפשריים של פיגומים כוללים הפקת allografts לתיקון הסחוס, הגשה לפיגום בשביל לרקמות osteochondral הנדסה ואספקת דגמים במבחנה ללמוד היווצרות רקמה. על ידי decellularizing את הרקמה, תאי התורם מוסרות, אך רבים של המקלות ביו טבעי נחשבים יישמרו. היתרון העיקרי של שימוש לפיגום טבעי לעומת לפיגום לאכסון המיוצר הוא כי אין functionalization נוספת של פולימרים נדרשת התחדשות רקמות osteochondral נסיעה. פיגומים מטריקס הסחוס-derived יכול לשמש עבור התחדשות רקמות עצם, סחוס בהגדרות ויוו והן במבחנה.

מבוא

פגמים הסחוס במפרק הברך נגרמת על ידי אירועים טראומטיים עלול לגרום אי נוחות, ומעל הכל יכולה להיות השפעה גדולה על חייהם של צעירים ובעלי האוכלוסייה1,2,3. יתר על כן, נזק לסחוס בגיל צעיר עלול להוביל התחלה מהירה יותר של דלקת מפרקים ניוונית בהמשך החיים4. כיום, הטיפול ההצלה היחיד עבור כללית דלקת מפרקים ניוונית של הברך הוא ניתוח החלפת מפרק. כמו סחוס hypocellular, aneural, רקמות avascular, יכולת ההתחדשות שלה מוגבל חמור. לכן, רפואה רגנרטיבית גישות רבים מחפשים סיוע ולעורר יכולת ההתחדשות של הרקמה הטבעית. למטרה זו, פיגומים שתוכננו ועברו המשמש כנשא או תא- או כחומר אינדוקטיבית, אשר מסית בידול והתחדשות של רקמת תאים מקורית של הגוף5.

פיגומים decellularized נחקרו באופן נרחב בתוך רפואה רגנרטיבית6. זה היה הצלחה מסוימת, לדוגמה, מסייע לרגנרציה של העור7, מבנים בטן8גידים9. היתרון של שימוש פיגומים decellularized הוא המקור הטבעי שלהם והיכולת שלהם לשמור על רמזים ביואקטיביות זה גם מושך וגם לגרום תאית התמיינות לתוך שושלת היוחסין המתאים הנדרש בשביל לרקמות תיקון6,10. יתר על כן, כיוון מטריצה חוץ-תאית (ECM) הוא biomaterial טבעי, decellularization מונע לתגובה החיסונית פוטנציאליות על-ידי הסרת תוכן סלולרי או גנטי, סוגיות הנוגעות הביו ו biodegradability יש להתגבר.

פיגומים מטריקס הסחוס, נגזר (CDM) הראו chondrogenic נהדר פוטנציאליים ניסויים במבחנה כאשר נזרע עם תאי סטרומה mesenchymal11. בנוסף, פיגומים אלו הראו פוטנציאל טופס רקמת העצם דרך התקשות endochondral על מקומות חוץ רחמי הגדרות ויוו12. כמו CDM פיגומים מדריך היווצרות של שניהם עצם, רקמת סחוס, פיגומים אלו שמשקיעים פוטנציאליות לתיקון פגם osteochondral בנוסף לתקן סחוס.

מאמר זה מתאר פרוטוקול חיבור מקורי יאנג et al. (2010)13 לייצור של פיגומים CDM decellularized של סוסים להחניק את הסחוס. פיגומים אלו הם עשירים ב סוג הקולגן השנייה של תאים, אינם מכילים כל glycosaminoglycans (GAGs) לאחר decellularization. ניסויים במבחנה וגם ויוו על תיקון פגם chondral (osteo) יכול להתבצע באמצעות פיגומים אלו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

עבור פרוטוקול זה, סחוס חנוק הסוסים היה המתקבלים סוסים שמתו מגורמים אחרים מאשר דלקת מפרקים ניוונית. רקמות הושג עם הרשאת הבעלים, בקנה אחד עם תקנות אתיות מוסדיות.

הערה: פרוטוקול זה מתאר את הזיוף של פיגומים מן הסחוס אקווין decellularized, אשר יכול לשמש עבור יישומים כגון חוץ גופית בתוך תרביות רקמה פלטפורמות או ויוו השרשה רפואה רגנרטיבית אסטרטגיות. השלבים טיפול אנזימטי חייב להתבצע לפי הסדר הכרונולוגי המתואר.

1. קצירת סחוס במפרק של התורם המפרקים (Cadaveric)

  1. קדימה של השלב האיסוף, להכין 1 ליטר של הסחוס הכביסה פתרון, המורכב סטרילי באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS), בתוספת 100 U/mL פניצילין, סטרפטומיצין µg/mL 100 ו- 1% (v/v) b. שהוא גוסס
  2. ללבוש כפפות, חלוק מעבדה במהלך כל תהליך האיסוף, מאז התורם יכול לשאת פתוגנים.
  3. השג של המפרק (cadaveric) ללא פגע לבידוד הסחוס.
    הערה: בשלב זה, העור סביב המפרק הוא עדיין שלם. הסחוס חנוק אקווין המתקבל הסוס היה בשימוש פרוטוקול זה, אך אחרים המפרקים ממינים אחרים יכול לשמש גם.
  4. מסירים את העור הנמצא סביב אזור משותף עניין באמצעות אזמל של פינצטה כירורגית. בנוסף, להסיר רקמות שריר ושומן עודף במידת הצורך, מבלי לפגוע המפרק המשמש כבסיס. באופן אופציונלי, העברת הגופה מוכן בטיחות ביולוגית ארון.
  5. לביצוע של arthrotomy, כלומר, הפרדה של המפרק, תחילה להגדיר את המיקום שבו המפרק מבטאת על-ידי ביצוע בטווח תנועות של המפרק.
  6. הסר בזהירות יותר שכבות של שומן, השרירים, הגידים עם האזמל, פינצטה כירורגית כדי לפתוח את אזור משותף.
  7. לעשות חתך כדי להגיע את חלל משותף.
    הערה: חלל משותף מלא בנוזל synovial, אשר ניתן לטפטף מן החלל בעת ביצוע חתך הנכון.
  8. ממשיכים לפתוח את המקום לגמרי על-ידי לחתוך הגידים זה לשמור המשותפת ביחד.
  9. בדוק את הסחוס בגין כל נזק מאקרוסקופית.
    הערה: אם אין הסחוס במפרק מראה מבריק וחלק או אם ניכר שלפוחיות, בתרי, או פגמים קיימים, למחוק את הסחוס.
  10. השתמש באזמל סטרילי כדי להסיר את הסחוס של עצם subchondral. חותכים כל הדרך אל עצם subchondral גם להסיר את אזור עמוק של הסחוס (איור 1). כדי למנוע את הסחוס מתייבשת, באופן קבוע לטפטף הסחוס כביסה פתרון על הסחוס.
    הערה: בשלב זה, לא משנה גודל הפרוסות הסחוס.
  11. לאסוף את הפרוסות הסחוס 50 מ ל צינורות המכיל הסחוס בעבר מוכן לשטוף פתרון (איור 2 א).
  12. לאחר איסוף הסחוס לכל תחומי עניין, הצמד להקפיא את הפרוסות הסחוס בחנקן נוזלי במשך 5 דקות.
  13. להעביר את הפרוסות הסחוס לתוך צינורות 50 מ ל, מיד lyophilize את הפרוסות הסחוס במשך 24 שעות ביממה בהקפאה מייבש. לקבוע מדיניות ההקפאה מייבש mbar כ 0.090 אמנם מעבה הקרח-51 ° C (איור 2B).
  14. לאחסן את הפרוסות הסחוס במקום יבש בטמפרטורת החדר עד להמשך השימוש.
    הערה: עד לנקודה של היווצרות לגרדום, והפתרונות סחוס אין צורך להיות מוכן ומטופל באופן סטרילי.

2. יצירת Decellularized הסחוס חלקיקים

  1. Submerse את פרוסות סחוס lyophilized חנקן נוזלי.
  2. לטחון את הדגימות ישירות באופן ידני או על ידי מכונת הטחינה. כאשר שחיקה את הפרוסות הסחוס בעבודת יד, השתמש ומכתש, לטחון את הפרוסות במשך כ 45 דקות עד שהם השמיד (איור 2C ו- 2D). כאשר שחיקה אוטומטי, להשתמש מכונת הטחינה במהירות שלו מוגדר מראש לכמה שניות עד דקה, עד הפרוסות מוקפאים snap הסחוס הם לא....
    הערה: מראש מגניב המליטה או תא שחיקה של מכונת הטחינה בהוספת חנקן נוזלי. בעת שימוש מכונת הטחינה, ודא כי כל החלקיקים הם הקרקע, כי אין חלקיקי להישאר בחלק התחתון של תא שחיקה.
  3. ניפוי החלקיקים סחוס כדי להיפטר חלקים גדולים יותר באמצעות מסננת עם גודל רשת מ מ 0.71.
  4. אחסן את החלקיקים במקום יבש בטמפרטורת החדר.

3. אנזימטי Decellularization עם טריפסין 0.25%-EDTA

  1. להכין את הפתרון עיכול, המורכב של 0.25% טריפסין עם EDTA בתוספת 100 U/mL פניצילין, סטרפטומיצין μg/mL 100 ו- 1% (v/v) שהוא גוסס ב' חנות הפתרון ב 4 º C.
    הערה: Trypin הוא פרוטאז זה מבזה חלבונים המתגוררים רקמת סחוס. שלב אנזימטי זה יפתח את מבנה הסחוס צפופה.
  2. למלא את צינורות 50 מ עם החלקיקים הסחוס השמיד עד נפח של-7.5 mL למחזור.
  3. דגירה החלקיקים סחוס עם הפתרון עיכול מוכן ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות בסך הכל, מרעננים את הפתרון העיכול כל 4 שעות.
    1. ראשית, להוסיף 30 מ של הפתרון העיכול כל שפופרת 50 מ ל המכיל חלקיקים הסחוס.
    2. לאחר מכן, resuspend את החלקיקים באמצעות למערבולת או pipet כך כל החלקיקים נחשפים הפתרון אנזימטיות.
    3. דגירה בדגימות במשך 4 שעות ב 37 מעלות צלזיוס על גלגלת.
    4. כדי לרענן את הפתרון עיכול, centrifuge הצינורות כעשרים דקות ב g x 3113 לגרום שיקוע של החלקיקים הסחוס. למחוק את תגובת שיקוע.
      הערה: תגובת שיקוע יהפוך ברורים עם כל תקופת דגירה של טריפסין.
    5. חזור על שלב 3.3.1–3.3.4 עד החלקיקים מודגרות עם הפתרון לעיכול עבור 6 מחזורים של 4 שעות.
  4. לאחר המחזור האחרון, להסיר את תגובת שיקוע לאחר צריך שתוציאו ולשטוף את החלקיקים ב 30 מ של הסחוס שטיפה פתרון פעמיים. Centrifuge למשך 20 דקות ב g x 3113 בין כל שוטף החלקיקים.

4. אנזימטי Decellularization בטיפול נוקלאז

  1. הכינו 10 מ מ טריס-HCl פתרון ב- pH 7.5 במים יונים.
  2. להוסיף מאגר טריס-HCl, כדי לקבל את הפתרון נוקלאז deoxyribonuclease U/mL 50 ו- U/mL 1 ribonuclease A.
    הערה: שלב זה מבוצע כדי לבזות במיוחד deoxyribonucleases ו- ribonucleases.
  3. כדי להסיר את הסחוס שטיפה פתרון של החלקיקים סחוס (שלב 3.4), צנטריפוגה כעשרים דקות ב 3,113 x g, ולהסיר את תגובת שיקוע.
  4. להוסיף 30 מ של הפתרון נוקלאז החלקיקים הסחוס ומערבבים את החלקיקים דרך הפתרון, לוודא כי כל החלקיקים נחשפים הפתרון נוקלאז.
  5. דגירה בדגימות על גלגלת במשך 4 שעות ב- 37 מעלות צלזיוס.
  6. להסיר את הפתרון נוקלאז על ידי צריך שתוציאו את החלקיקים הסחוס כעשרים דקות ב 3,113 x g וזורקים את תגובת שיקוע.
  7. לשטוף את הדוגמאות על-ידי הוספת 30 מ ל 10 מ מ טריס-HCl פתרון ללא deoxyribonuclease ואת ribonuclease A החלקיקים הסחוס. Resuspend החלקיקים ולהשאיר את הדגימות רולר עבור 20 h בטמפרטורת החדר.

5. Decellularization דטרגנט

  1. להפוך את הפתרון דטרגנט על ידי המסת 1% (v/v) octoxynol-1 ב- PBS.
  2. הסר את הפתרון טריס-HCl החלקיקים סחוס מאת צריך שתוציאו בשביל 20 דקות ב 3,113 x g ומחיקת את תגובת שיקוע.
  3. להוסיף 30 מ של הפתרון דטרגנט מוכן 1% החלקיקים הסחוס. Resuspend החלקיקים הסחוס בעדינות כדי להימנע קצף של הפתרון.
    הערה: שלב זה נשברת ממברנות הסלולר.
  4. דגירה בדגימות על גלגלת עבור 24 שעות בטמפרטורת החדר על גלגלת.
  5. להסיר את הפתרון דטרגנט על ידי צנטריפוגה כעשרים דקות ב 3,113 x g וזורקים את תגובת שיקוע.
  6. כדי להסיר את כל השאריות של הפתרונות decellularization, לשטוף את החלקיקים הסחוס ב- 6 מחזורים של 8 h ב- 30 מ של הסחוס שטיפה פתרון. לבצע כביסה על גלגלת בטמפרטורת החדר.
    1. כדי לשנות בכביסה הבאה, centrifuge המתלה למשך 20 דקות ב 3,113 x g, למחוק את תגובת שיקוע והוסף הסחוס טרי שטיפת פתרון.
  7. להשאיר כביסה האחרון את החצוצרות שלה ולאחסן את חלקיקי סחוס decellularized ב-80 מעלות צלזיוס.

6. יצירת פיגומים החלקיקים Decellularized

  1. אם החלקיקים אוחסנו ב-80 מעלות צלזיוס, להפשיר הצינורות סגורות המכילות את הסחוס החלקיקים במים חמים לפני יצירת פיגומים.
  2. להעביר את החלקיקים סחוס עם מצקת קטנה תבנית גלילי, לדוגמה, בקבוקון פלסטיק בקוטר של 8 מ מ, בגובה של 2 ס מ.
  3. בשעת מיקום החלקיקים הסחוס לתוך כייר פלסטיק, הקש על כל-מבועות האויר החוצה כדי למנוע עששת ב לגרדום, למלא את התבנית עד הקצה.
    הערה: זה יהיה יותר קשה לקחת פיגומים מתוך תבנית מתכת לאחר היווצרות לגרדום, אשר יכול להוביל סדקים לגרדום.
  4. להקפיא את התבניות עם סחוס חלקיקים 10 דקות ב-20 ° C.
  5. Lyophilize פיגומים הסחוס בתוך שלהם ליציקות 24 שעות בהקפאה מייבש.
  6. לאחר lyophilization, השתמש בפיגומים העובש (איור 3), קשר צולב אותם עם אולטרה סגול (UV) אור-30 ס"מ והמרחק 365 nm בין לילה.
  7. על מנת להשתמש פיגומים תרבית תאים במבחנה או השרשה ויוו, לעקר פיגומים בגז, לדוגמה, אתילן אוקסיד (EtO).
    הערה: עיקור EtO מתבצע על ידי חיצוני.

7. אפיון של פיגומים Decellularized עם Stainings היסטולוגית

הערה: כדי להבטיח decellularization מלאה וכדי להמחיש את האופי הטבעי הנותרים של הסחוס, לבצע מספר stainings היסטולוגית לפני השימוש פיגומים בניסוי כלשהו, לרבות hematoxylin אאוזין (H & E) צביעת כדי להבטיח decellularization, Safranin-O צביעת להמחיש נוכחות איסור פרסום שיורית, קולגן מסוג I אימונוהיסטוכימיה להבחין בין תוכן קולגן, קולגן מסוג II אימונוהיסטוכימיה להבחין בין תוכן קולגן.

  1. חותכים פיגומים פרוסות דקות של 3 מ מ עם אזמל.
    הערה: אם פיגומים נחתכים בגדלים גדולים יותר או קטנים יותר, משך הזמן של המחזורים התייבשות צורך להתאים.
  2. להטביע פיגומים ירידה של 4% (w/v) alginate, לגרום cross-linking על-ידי הוספת נפח דומה של 3.7% שאינם באגירה פורמלין המכיל 20 מ מ CaCl2.
    הערה: קילוף פלסטיצידיות הטבעה הופכת את הפרוסות לגרדום נוקשה יותר לעומת השלבים כביסה לפני פרפין הטבעה. התיק שפיגומים יש כבר תא מתחילה או ויוו מושתל, alginate הטבעת היא לא הכרחי, כמו ההרכב של פיגומים יהיה עמיד מספיק עקב התאגדות ECM על ידי התאים.
  3. מייבשים את הדוגמאות על ידי הצבתם סדרה מדורגת אתנול, החל שעה מחזורים של 70%, 96%, 96%, 100% ו 100% אתנול, ואחריו שני מחזורים 1 h של קסילן, ומסתיימת שני מחזורים 1 h של פרפין ב 60 מעלות צלזיוס.
  4. לאחר התייבשות, פרפין-להטביע את הדגימות תבנית, לקרר את הדגימות.
  5. חותכים את הדגימות עם מיקרוטום בפרוסות בעובי 5 μm.
  6. לפני צביעת, נתרענן הדגימות על-ידי הצבתם בסדרה המוחזרת אתנול מדורגת. להתחיל עם שני שוטף של קסילן במשך 5 דקות, ואחריו שוטף 2 של אתנול 100%-95%, 70% למשך 3 דקות לכל לשטוף. לבסוף, יש לשטוף את הדגימות 3 פעמים במים למשך 2 דקות.
    הערה: במקרה של שימוש alginate לעבד דגימות של פרפין הטבעה, הקפידו לשטוף את alginate בחומצה ציטרית 10 מ מ, טרם התייבשות של הסעיפים פרפין.
  7. כתם הדגימות ועם hematoxylin אאוזין, Safranin-O, קולגן, קולגן II כפי שמתואר הקודם11.

8. אפיון של פיגומים Decellularized עם כמותני

  1. להשיג פפאין מעכל של פיגומים כפי שתואר לעיל11.
  2. ביצוע וזמינותו עם מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית DNA כימות ערכת כדי למדוד את תכולת ה-DNA כפול-strand פיגומים כדי להבטיח decellularization מלאה. לפי התקנון המסופקים על ידי היצרן. לבטא את כמות ה-DNA לפי משקל יבש של לגרדום.
  3. ביצוע וזמינותו של dimethylmethylene כחול כדי לכמת את שארית GAGs בתוך לגרדום, כפי שתואר לעיל11. מבטאים את הכמות באיסור פרסום לכל ה-DNA.

9. זריעה של פיגומים Decellularized

  1. חותכים פיגומים סטיריליים מהשלב 6.7 לתוך 3 מ מ פרוסות עבות.
  2. העברת פיגומים בבארות נפרדים של צלחת 6-. טוב.
  3. נתרענן פיגומים בינונית התרבות התא על ידי pipetting 1 מ"ל של מדיום על הגרדום. ולהניח לזה משרים למשך 30 דקות להשתמש chondrocyte או תאי גזע mesenchymal (MSC) הרחבה בינונית.
    הערה: השתמש המדיום אותו על התייבשות לגרדום באשר תרבית תאים התאים להיות נזרע. Chondrocyte הרחבה בינונית מורכב מדיה שונה של Dulbecco (DMEM) עם 10% לא פעיל חום העובר שור סרום (FBS), פניצילין U/mL 100, סטרפטומיצין μg/mL 100 ננוגרם למ"ל 10 פיברובלסט גורם גדילה-2 (FGF-2). MSC הרחבה בינונית מורכב מינימום אלפא בינוני חיוניים (-מ) עם 10% חום-לא פעיל FBS, 0.2 מ מ 2 חומצה אסקורבית L-פוספט, פניצילין U/mL 100, סטרפטומיצין μg/mL 100 ו- 10 ננוגרם למ"ל FGF-2.
  4. להכין 3 x 106 תאים 100 μL בינוני, המהווה אמצעי האחסון הנדרש עבור כל לגרדום בקוטר של 8 מ מ, בגובה של 3 מ מ.
    הערה: סוגי תאים מרובים של מינים שונים יכול לשמש זריעה. בעת שימוש chondrocytes או mesenchymal תאי סטרומה, לבודד את התאים כפי שתואר לעיל11. בעת שימוש chondrocytes, ודא כי הם לא שהורחבו אחרי המעבר P1 על מנת לצמצם את מספר dedifferentiated chondrocytes. בעת שימוש בתאי סטרומה mesenchymal, הם חייבים להיבדק על פי יכולתם של בידול השושלת מרובה, כפי שתואר לעיל14.
  5. Pipet 50 μL של מוכן תא התלוי מעל לגרדום טרום רטוב, דגירה לגרדום עבור h 1-37 מעלות צלזיוס.
  6. להפוך לגרדום הפוך למטה, μL pipet ה-50 הנותרים של השעיה התא בצד הזה של לגרדום ובזהירות תקופת דגירה של h 1-37 מעלות צלזיוס.
  7. לאחר דגירה, להוסיף 3 מ"ל של מדיום הבארות, וכן תרבות פיגומים נזרע תא ב 37 º C. להתמודד עם לוח תרבות בעדינות כדי למנוע ניתוק של התאים.
  8. תרבות פיגומים עבור תקופת הזמן הדרוש לניסוי ולשנות את המדיום 2-3 פעמים בשבוע. Pipet לאט, הרחק הרחק מן לגרדום ככל האפשר.
  9. לאחר culturing של לגרדום נזרע תא, לחתוך פיגומים במחצית ולעבד אותם עבור היסטולוגיה וניתוחים הביוכימי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

תמיד וחייבות להיות מאושרות decellularization של CDM פיגומים באמצעות stainings היסטולוגית, כמו גם באמצעות כימות דנ א כדי למדוד את כמות ה-DNA שרידים. Decellularization לא מספיק עלול להוביל רצויה תגובות חיסוניות להשפיע על תוצאות הגדרות ויוו15,16,17. עבור שיטה זו decellularization מסוים, די אן איי היה מתחת לטווח הזיהוי, שהחלה ב ± 2.3 13.6 ng/mg משקל DNA/יבש (n = 3). Decellularization מלאה באמצעות פרו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

ה-ECM של הסחוס במפרק הוא מאוד צפוף, די גמיש לטיפולים אנזימטיות שונות. פרוטוקול צעד מרובת decellularization המתואר במאמר זה מטפל בכזאת התנגדות ומייצר בהצלחה מטריצות decellularized. כדי להשיג את זה, התהליך משתרע על פני מספר ימים. תהליכים decellularization רבים הוצעו עבור סוגים שונים של רקמות18, מאמר זה מתאר פרוטוקול מתאים decellularization של הסחוס. פרוטוקול זה, זה, עם זאת, הצורך לעקוב אחר הטיפול אנזימטי עם השלבים דטרגנט כדי להסיר את כל התאים. כמות ה-DNA פוחתת במידה ניכרת על הצעדים הראשונים המערבים ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

תודות

המחברים רוצה להכיר וו האתחול לקבלת סיוע בתחום הייצור של סיכוי. K.E.M. Benders נתמך על ידי אלכסנדר Suerman Stipendium מן המרכז הרפואי האוניברסיטאי. Levato ר ג'יי Malda נתמכים על ידי קרן דלקת מפרקים הולנדי (מעניקים הסכמים CO-14-1-001 ו- LLP-12, בהתאמה).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מפרקניתן להשיג זאת כחומר מנוחה מהקצב המקומי או מהמרכז הווטרינרי.
תמיסת מלח סטרילית עם חוצץ פוספט (PBS)
פניצילין-סטרפטומיציןGibco15140
אמפוטריצין Bתרמו פישר 15290026
חנקן
טריפסין-EDTA (0.25%), פנול אדוםתרמו פישר Scientific25200072
Tris-HCl pH 7.5
דאוקסיריבונוקלאז I מלבלב בקרסיגמא-אולדריץ'DN25
ריבונוקלאז A מלבלב בקרסיגמא-אולדריץ'R6513
טריטון X-100 (אוקטוקסינול-1)סיגמא-אולדריץ'X100
פפאיןסיגמא-אולדריץ'P3125
טריסודיום ציטראט דיהידראטסיגמא-אולדריץ'S4641
אלגינטסיגמא-אולדריץ'180947
פורמלין
CaCl<תת>2
אתנול
קסילן
פרפין
אתילן אוקסיד עיקורSynergy Health, ונלו, הולנד
תאי סטרומה / כונדרוציטים מתורמיMSCs וכונדרוציטים מתורמים ממפרקי תורמים שהם חומר מנוחה, המגיעים מהקצב המקומי או מהמרכז הווטרינרי.
MEM alphaThermo Fischer Scientific22561
חומצה L-אסקורבית 2-פוספטSigma-AldrichA8960
DMEMThermo Fischer Scientific41965
אלבומין סרום בקר מומת בחוםSigma-Aldrich10735086001
גורם גדילה פיברובלסטים-2 (FGF-2)R & D Systems233-FB
ערכת כימות DNA (Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent)תרמו פישר סיינטיפיקP7581
1,9-דימתיל-מתילן כחול אבץ כלוריד מלח כפולסיגמא-אולדריץ'341088
מייבש הקפאהSALMENKIPPALPHA 1-2 LD פלוס
טחנה אנליטיתIKAA 11 מרגמה
Haldenwanger 55/0A
צלחת רולרCATRM5
צנטריפוגה (לצינורות 50 מ"ל)Eppendorf5810R
קפסולה (תבנית גלילית)TAAB8 מ"מ שטוח
Superlite S UVLumatec2001AV
אינקובטור מיקרוטום
מסננת (גודל רשת 0.71 מ"מ)VWR34111229
אזמל
מחזיק
מצקת
גופות נוזליניתן לבודד סוסים /עלי בסיסי אזמל קטנה

מקורות

  1. Dunlop, D. D., et al. Risk factors for functional decline in older adults with arthritis. Arthritis and rheumatism. 52 (4), 1274-1282 (2005).
  2. Fitzpatrick, K., Tokish, J. M. A military perspective to articular cartilage defects. The journal of knee surgery. 24 (3), 159-166 (2011).
  3. Flanigan, D. C., Harris, J. D., Trinh, T. Q., Siston, R. A., Brophy, R. H. Prevalence of chondral defects in athletes' knees: a systematic review. Medicine and science in sports and exercise. 42 (10), 1795-1801 (2010).
  4. Martel-Pelletier, J., Boileau, C., Pelletier, J. P., Roughley, P. J. Cartilage in normal and osteoarthritis conditions. Best practice & research. Clinical rheumatology. 22 (2), 351-384 (2008).
  5. Vinatier, C., et al. Cartilage tissue engineering: towards a biomaterial-assisted mesenchymal stem cell therapy. Current stem cell research & therapy. 4 (4), 318-329 (2009).
  6. Taylor, D. A., Sampaio, L. C., Ferdous, Z., Gobin, A. S., Taite, L. J. Decellularized matrices in regenerative medicine. Acta biomaterialia. 74, 74-89 (2018).
  7. Vashi, C. Clinical Outcomes for Breast Cancer Patients Undergoing Mastectomy and Reconstruction with Use of DermACELL, a Sterile, Room Temperature Acellular Dermal Matrix. Plastic Surgery International. 2014 (704323), 1-7 (2014).
  8. Satterwhite, T. S., et al. Abdominal wall reconstruction with dual layer cross-linked porcine dermal xenograft: the "Pork Sandwich" herniorraphy. Journal of plastic, reconstructive & aesthetic surgery : JPRAS. 65 (3), 333-341 (2012).
  9. Martinello, T., et al. Successful recellularization of human tendon scaffolds using adipose-derived mesenchymal stem cells and collagen gel. Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 8 (8), 612-619 (2014).
  10. Benders, K. E., et al. Extracellular matrix scaffolds for cartilage and bone regeneration. Trends in biotechnology. 31 (3), 169-176 (2013).
  11. Benders, K. E., et al. Multipotent Stromal Cells Outperform Chondrocytes on Cartilage-Derived Matrix Scaffolds. Cartilage. 5 (4), 221-230 (2014).
  12. Gawlitta, D., et al. Decellularized cartilage-derived matrix as substrate for endochondral bone regeneration. Tissue engineering. Part A. 21 (3-4), 694-703 (2015).
  13. Yang, Z., et al. Fabrication and repair of cartilage defects with a novel acellular cartilage matrix scaffold. Tissue engineering. Part C, Methods. 16 (5), 865-876 (2010).
  14. Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
  15. Meyer, S. R., et al. Decellularization reduces the immune response to aortic valve allografts in the rat. The Journal of thoracic and cardiovascular surgery. 130 (2), 469-476 (2005).
  16. Brown, B. N., Valentin, J. E., Stewart-Akers, A. M., McCabe, G. P., Badylak, S. F. Macrophage phenotype and remodeling outcomes in response to biologic scaffolds with and without a cellular component. Biomaterials. 30 (8), 1482-1491 (2009).
  17. Keane, T. J., Londono, R., Turner, N. J., Badylak, S. F. Consequences of ineffective decellularization of biologic scaffolds on the host response. Biomaterials. 33 (6), 1771-1781 (2012).
  18. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
  19. Malda, J., et al. Of mice, men and elephants: the relation between articular cartilage thickness and body mass. PloS One. 8 (2), e57683(2013).
  20. Malda, J., et al. Comparative study of depth-dependent characteristics of equine and human osteochondral tissue from the medial and lateral femoral condyles. Osteoarthritis and Cartilage. 20 (10), 1147-1151 (2012).
  21. Londono, R., Badylak, S. F. Biologic scaffolds for regenerative medicine: mechanisms of in vivo remodeling. Annals of biomedical engineering. 43 (3), 577-592 (2015).
  22. Gilbert, T. W. Strategies for tissue and organ decellularization. Journal of cellular biochemistry. 113 (7), 2217-2222 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

ייצור של מטריקס הסחוס, נגזר Decellularized פיגומים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.