כאן אנו מתארים שיטה להערכת ביטוי ריאות miRNAs זה הם חזו להסדיר גנים דלקתיים שימוש בעכברים נחשפים האוזון או סינון אוויר בשלבים שונים של ייחום.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
ריאות microRNA פרופיל לרוחב ייחום בעכברים החשופים אוזון
במאמר זה
סיכום
תקציר
פרופיל MicroRNA (miRNA) הפך לעניין חוקרים עובדים בתחומים שונים מחקר בביולוגיה ורפואה. מחקרים הנוכחי מראים התחלה מבטיחה בעתיד הכרוכים miRNAs באבחון, טיפול של מחלות ריאה. . כאן, אנחנו להגדיר עבור miRNA פרופיל כדי למדוד את השפע היחסי של קבוצת miRNAs חזה להסדיר גנים דלקתיים רקמת הריאה של מודל העכבר דלקת דרכי הנשימה אוזון-induced פרוטוקול. כי הוכח כי במחזור רמות הורמון המין יכול להשפיע ברגולציה של הריאה מולדת חסינות אצל נקבות, מטרת שיטה זו היא לתאר את miRNA דלקתיות של פרופיל פרוטוקול בעכברים נקבה, אם לוקחים בחשבון את ייחום שלב של כל בעל חיים בזמן החשיפה האוזון. אנו הכתובת גם גישות ביואינפורמטיקה ישים miRNA של גילוי ושל יעד שיטות זיהוי באמצעות limma, תוכנה R/Bioconductor, ו אנליזה פונקציונלית תוכנה כדי להבין את ההקשר הביולוגי ואת מסלולים הקשורים ביטוי דיפרנציאלי miRNA.
מבוא
Rna (miRNAs) הם קצרים (19-25 נוקלאוטידים), המתרחשים באופן טבעי, ללא קידוד RNA מולקולות. רצפים של miRNAs הם אבולוציונית והתפאורה על פני מינים, רומז על חשיבות miRNAs בוויסות פונקציות פיזיולוגיים1. יצירת פרופיל ביטוי microRNA הוכח להיות מועיל לזיהוי miRNAs חשובים בוויסות מגוון רחב של תהליכים, כולל את התגובה החיסונית, התמיינות תאים, תהליכים פיתוחיים אפופטוזיס2. לאחרונה, miRNAs זוהו לשימוש שלהם פוטנציאל אבחון המחלה הרפוי. עבור החוקרים ללמוד מנגנונים של הכונה, מדידה miRNA ביטוי יכול להאיר את מערכות ברמת מודלים של תהליכים רגולטוריים, במיוחד כאשר miRNA המידע יאוחד עם פרופיל ה-mRNA, אחרים נתונים הגנום בקנה מידה3....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של פן סטייט.
1. הערכה של השלב ייחום
- כמו שצריך לרסן נקבה העכבר C57BL/6 (בן 8 – 9 שבועות) באמצעות העכבר ביד אחת איפוק בטכניקה המתוארת et al. Machholz10.
- למלא את פיפטה פלסטיק סטרילית עם 10 μL של מים אולטרא טהורים.
- להציג את קצה פיפטה פלסטיק לתוך הנרתיק.
- לשטוף בעדינות את הנוזל 4 – 5 פעמים כדי לאסוף את הדגימה.
- מקם את הסומק הסופי המכיל נוזל הנרתיק על משטח זכוכית.
- לבחון את הסומק הנרתיק מוכתם תחת מיקרוסקופ אור עם יעד 20 x.
הערה: בעלי חיים שאינם מציגים מחזורים סדיר....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
סוגי תאים שונים שנצפתה מריחות משמשים לזיהוי השלב ייחום העכבר (איור 1). אלו מזוהים על ידי תא מורפולוגיה. במהלך proestrus, תאים הם באופן כמעט בלעדי אשכולות של צורת עגול, בנוי היטב nucleated לתאי האפיתל (איור 1 א'). כאשר העכבר נמצא בשלב ייחום, תאים הם cornified לתאי האפיתל הקשקש, נוכח בצפיפות אשכולות (איור 1B). במהלך metestrus, תאי אפיתל cornified ואת אורך חייהם נראים (איור 1C
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פרופיל MicroRNA היא טכניקה יתרון לאבחון המחלה והן מכניסטית מחקר. כתב יד זה, הגדרנו פרוטוקול להעריך את הביטוי של miRNAs זה הם חזו להסדיר גנים דלקתיים בריאות של עכברים הנשי נחשפים האוזון בשלבים שונים ייחום. שיטות לקביעת ייחום, כגון שיטת זיהוי חזותי, כבר מתואר16. עם זאת, אלה מסתמכים על מדידות חד פעמי, ולכן לא אמינים. כדי לזהות במדויק בכל שלבי ייחום הנקבות זה מחזור באופן קבוע, מומלץ השיטה המתוארת כאן. בנוסף, פרוטוקול פשוט זה יכול לשמש גם כדי להעריך באופן עקיף יומי תנודות הורמונליות בעכברים. כדי למנוע .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים כי יש להם אין אינטרסים מתחרים.
תודות
מחקר זה נתמך על ידי מענקים NIH K01HL133520 (PS) ו K12HD055882 (PS). המחברים מודים ד ר ג'ואנה Floros על הסיוע עם האוזון חשיפה ניסויים.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| עכברי C57BL / 6J | מעבדת ג'קסון | 000664 | 8 שבועות |
| UltraPure Water | Thermo Fisher Scientific | 10813012 | |
| פיפטה פלסטיק סטרילית | פישר סיינטיפיק | 13-711-25 | קיבולת: 1.7 מ"ל |
| שקופיות מיקרוסקופ חלבי | תרמו פישר סיינטיפיק | 2951TS | |
| מיקרוסקופ אור | מיקרוסקופ עולם | MW3-H5 | 10x ו-20x אובייקטיבי |
| Ketathesia- הזרקת קטמין HCl USP | הנרי שיין בריאות בעלי חיים | 55853 | 90 מ"ג/ק"ג. סם מבוקר. |
| תמיסה סטרילית קסילזין | מעבדות לויד | 139-236 | 10 מ"ג לק"ג. סם מבוקר. |
| אתנול | פישר סיינטיפיק | BP2818100 | לדלל ל-70% אתנול במים. |
| מחט מד 21 גרם | BD Biosciences | מזרק 305165 | |
| פישר סיינטיפיק | 329654 | 1 מ"ל | |
| מספריים הפעלה | מכשירי דיוק עולמיים | 501221, 504613 | 14 ס"מ, חד / קהה, מעוקל ו 9 ס"מ, ישר, דק קצה חד |
| ערכת פינצטה | דיוק עולמיים | ||
| ספקטרום מרססי רקמות בסמן | פישר סיינטיפיק | 08-418-1 | קיבולת: 10 עד 50 מ"ג |
| צינורות מיקרופוגה ללא RNase | Thermo Fisher Scientific | AM12400 | 1.5 מ"ל |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| Direct-zol RNA MiniPrep Plus | Zymo Research | R2071 | |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | |
| ערכת miScript II RT | Qiagen | 218161 | |
| תגובה דלקתית של עכבר & אוטואימוניות miRNA PCR Array | Qiagen | MIMM-105Z | |
| צינורות PCR דקי דופן, נטולי DNase, ללא RNase | Thermo Fisher Scientific | AM12225 | ל-20 μ L תגובות |
| miRNeasy סרום/פלזמה בקרת ספייק אין | Qiagen | 219610 | |
| Microsoft Excel | Microsoft Corporation | https://office.microsoft.com/excel/ | |
| Ingenuity Pathway Analysis | Qiagen | https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis/ | |
| R Software | The R Foundation | https://www.r-project.org/ | |
| מחזורי תרמי או בלוק קירור/חימום | מעבדה כללית | ||
| ספק מעבדה | כללית ספק | ||
| אמת PCR מחזורי | ספק מעבדה כללית פיפטור | ||
| רב ערוצי | ספק מעבדה כללית מאגר | ||
| כביסה RNA | מחקר Zymo | R1003-3-48 | 48 מאגר |
| עיכול DNA | Zymo Research | E1010-1-4 | 4 מ"ל |
| RNA מאגר טרום שטיפה | Zymo Research | R1020-2-25 | 25 מ"ל |
| מנתח אוזון אולטרה סגול | Teledyne API | דגם T400 | http://www.teledyne-api.com/products/oxygen-compound-instruments/t400 |
| בקרי זרימת מסה | Sierra Instruments Inc | Flobox 951/954 | http://www.sierrainstruments.com/products/954p.html |
מקורות
- Rebane, A., Akdis, C. A. MicroRNAs: Essential players in the regulation of inflammation. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (1), 15-26 (2013).
- Cannell, I. G., Kong, Y. W., Bushell, M. How do microRNAs regulate gene expression? Biochemical....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
