מאמר שיטה

הערכה של הגומלין בין החלבון המשלים C1q וחומצה Hyaluronic בקידום הדבקה תא

DOI:

10.3791/58688

⸱

15 ביוני 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Life Sciences, University of Trieste, 2Institute for Maternal and Child Health, IRCCS (Istituto di Ricovero e Cura a Carattere Scientifico) Burlo Garofolo, 3Department of Medical, Surgical and Health Science, University of Trieste

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המרכיב המשלים C1q היא מולקולה pro-דלקתיות מתבטאת במידה רבה בסביבה מיקרוסביבתית שיכולה לקיים אינטראקציה עם מטריצה החילוץ. כאן, אנו מתארים שיטה כדי לבדוק כיצד C1q הקשורים חומצה יאלורונית השפעות התא הדבקה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זה הוכח יותר ויותר כי מיקרוסביבה הגידול משחק תפקיד פעיל neoplasia צמיחה גרורות. באמצעות מסלולים שונים, תאים סרטניים יכול ביעילות לגייס סטרומה, תאים חיסוניים ואנדותל על ידי הפרשת גורמים מגירוי, נוגדנים ו ציטוקינים. בתורו, תאים אלה יכולים לשנות את מאפייני האיתות של הסביבה מיקרוידי שחרור הצמיחה-קידום אותות, מטבוליטים מטריקס רכיבים מטריצות כדי לקיים התפשטות גבוהה ויכולת גרורתית. בהקשר זה, אנו מזהים את המרכיב המשלים C1q, ביטוי מאוד באופן מקומי על ידי מגוון של גידולים ממאירים אנושיים, על האינטראקציה עם חומצה יאלורונית מטריצה המומנת, משפיע מאוד על ההתנהגות של תאים ראשוניים מבודדים מהגידול האנושי דגימות. כאן, אנו מתארים שיטה כדי לבדוק כיצד C1q כרוך חומצה יאלורונית (HA) משפיע על הדבקה תא הגידול, בבסיס העובדה המאפיינים הביולוגיים של רכיבי מפתח של מטריצה החילוץ (במקרה זה HA) יכול להיות מעוצב על ידי אותות אקטיביים לקראת הגידול תקדמות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרוסביבה הגידול (TME) משפיע על התפתחות הסרטן והתקדמות מאז הוא יכול לספק נישה מתירני עבור הישרדות התא, צמיחה ופלישה. הזיהוי של נגני מפתח חדשים ב-TME עשוי להיות שימושי לגילוי כלים מולקולריים חדשים עבור טיפול היעד. TME כולל רשת מורכבת ודינמית של תאים שאינם ממאירים, כגון תאים אנדותל, פיברותקיעות ותאים של המערכת החיסונית, מוטבע בתוך מטריקס המקיפים (ECM) רכיבים כולל collagens, למינציה, fibronectins, . בסדר. הן הגידול והן תאים שאינם סרטניים לסנתז ולהפריש רכיבי ECM יחד עם ציטוקינים, נוגדנים, גורמי גדילה ושיפוץ מטריצה דלקתיות אנזימים הכולל לשנות את המאפיינים הפיזיים, כימיים, איתות של TME. בין המרכיבים האלה, חומצה יאלורונית (HA) התפתחה להפעיל תפקיד מכריע בביולוגיה הגידול. למרות ההרכב הכימי הפשוט שלה, HA, יחד עם המולקולות שלה הכריכה (היאלודונים), יכול לווסת אנגיוגנזה, תגובתיות המערכת החיסונית ו ECM שיפוץ בגודל וריכוז תלוי באופן1.

מערכת המשלים (C) היא גם חלק של TME המקומי, אשר קיבל לאחרונה את תשומת הלב הגוברת. מערכת C מקיפה סט של חלבונים מסיסים מאוגד קרום מעורב בשורה הראשונה של הגנה מפני תאים לא-עצמאיים, אלמנטים מארחים לא רצויים ופתוגנים. מבחינה פונקציונלית, C מקשרת את הזרועות שני-אפקטור של מערכות מולדת ואדפטיבית כדי לקדם או להרוג את התא הישיר או הרכבה של תגובה דלקתית2. C הפעלה יכול לדכא את צמיחת הגידול, על ידי השמדת תאים סרטניים או עיכוב outgrowth שלהם, אבל זה הפך יותר ויותר ברור כי זה יכול להחזיק הגידול קידום פעילות על ידי קיום דלקת כרונית, קידום הקמתה של מדכאים, הגורם לאנגיוגנזה, והפעלת מסלולים של אותות סרטניים הקשורים לסרטן3. בהקשר זה, C1q, את המולקולה הזיהוי הראשון של המסלול הקלאסי של מערכת C התפתחה להפעיל פונקציות חשובות מיקרוסביבה הגידול באופן עצמאי של הפעלת C4. C1q הוכח להיות מבוטא באופן מקומי על ידי מגוון של גידולים ממאירים האדם, שם הוא יכול לטובת הדבקה תא סרטן, הגירה והתפשטות בנוסף אנגיוגנזה גרורות5. מעניין C1q אינטראקציה עם המרכיבים העיקריים של ECM כגון HA.

פיתחנו טכניקה כדי לבודד את תאי הסרטן העיקריים ממסת הגידול. יתר על כן, יצרנו את המטריצה, אשר יכול לעורר מיקרוסביבה הגידול, במיוחד את האינטראקציה בין C1q ומשקל מולקולרי גבוה חומצה יאלורונית. C1q מאוגד HA היה מסוגל לגרום הדבקה של תאים סרטניים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דגימות רקמות מחולים נאספו לאחר הסכמה מושכלת בעקבות אישור השיקולים האתיים על ידי הוועד המוסדי של בית החולים האוניברסיטאי של טריאסטה, איטליה.

1. בידוד תא גידול ותרבות (יום 1)

  1. בודד תאים מזותליומה האנושית מ MPM דגימות מוצקות. דק את הרקמה עם חותך להשיג שברים של כ 2-3 מ"מ2 בגודל ו-דגירה של 5 מ ל פתרון העיכול מורכב הנקס ' מאוזנת תמיסת מלח (HBSS) שיושלם עם 0.5 mm Ca2 +/Mg2 +, 0.5% טריפסין ו50 μg/mL DNase I, לילה ב -4 ° c.
  2. בידוד תא גידול ותרבות (יום 2)
    1. לאחר הדגירה של הלילה, מניחים את הרקמה המתעכלת במשך 30 דקות בחממה 37 ° c עם טלטול עדין.
    2. החלף את פתרון העיכול על צנטריפוגה (250 x g) עם 3 מ"ג/mL קולגן סוג 1 מומס 5 מ ל של בינונית 199 עם HBSS ו מודטה נוספת עבור 30 דקות ב 37 ° צ' עם רעד עדין.
    3. לחסום את התגובה אנזימטית על ידי הוספת 10% חום העובר מופעל סרום פרה (FBS). השהה מחדש את התאים בזהירות עם 5 מ ל pipet כדי להבטיח כי רוב התאים שוחררו מן הרקמה. אז, לסנן את ההשעיה התא באמצעות מסנן נקבובית 100 יקרומטר.
    4. זרע את התאים בבקבוקון 12.5 ס"מ2 בקבוקון ותרבות אותם ב 37 ° צ' עם התאים האנושיים סרום-בינונית חינם (hesf), עם 10% fbs ו שיושלם עם egf (10 Ng/ml), fbs בסיסי (20 Ng/ml), ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין.
      הערה: החלף במדיום טרי כל 2-3 ימים.

2. כיסוי HA (יום 1)

  1. השהה מחדש משקל מולקולרי גבוה HA (1.5 kDa) במים מזוקקים כפולים בריכוז של 1 מ"ג/mL6.
  2. דלל פתרון מניות HA כדי 50 μg/mL ב קרבונט/ביקרבונט מאגר (0.1 M, pH 9.6) עם pipetting עדין.
  3. מעיל 96-ובכן צלחת עם 100 μL של לדלל פתרון מניות HA ללילה ב 4 ° c.
    הערה: חומצה Hyaluronic היתה מתנה מהסוג של פרופ ' איוואן דונטי, המחלקה למדעי החיים, אוניברסיטת טריאסטה7.

3. C1q (יום 2)

  1. לאחר הדגירה לילה, ואקום משאוב את הבארות התייחסו ולשטוף את 96-הצלחת לוחית עם 100 μL של ה-PBS של בדולקו (dPBS) לכל טוב.
  2. אפשר C1q (25 μg/mL או ריכוזים שונים עבור ניסויים התגובה מינון) או BSA (כפקד שלילי) כדי לאגד את הפלסטיק מאוגד-HA על-ידי דגירה חלבונים אלה בריכוז של 25 μg/mL ב 100 μL של dPBS + 0.5% BSA ו 0.7 mM Ca2 +/Mg2 + . לאחר מכן הדגירה הלילה ב 4 ° c.
  3. ואקום לשאוב את הבארות ולשטוף את הצלחת 96-טוב עם 100 μL/טוב של dPBS.

4. תא תיוג עם מהירות DiI

  1. השהה מחדש 1 x 105 תאים סרטניים ב 500 Μl של dpbs המכיל 10 μg/mL של צבע פלורסנט מהיר dii. מודטה עבור 15 דקות ב 37 ° c ב 5% v/v CO2 חממה עבור התוויות, ערבוב באופן ידני לאחר 5 דקות במרווחי זמן.
    1. כדי להסיר עודף מהיר DiI, להוסיף 10 מ ל של dPBS, פיפטה בעדינות למעלה ולמטה, צנטריפוגה ב 250 x g עבור 7 דקות. השהה את הגלולה בתא 1 מ ל של סרום האנדותל אנושי בינונית ללא תשלום המכיל 0.1% bsa (hesf + 0.1% bsa).

5. תא הדבקה על מטריצות HA/C1q (יום 1)

  1. ואקום לשאוב את הבארות מצופה מטריצות שונות (בארות היו מצופות בשלב 3.2).
  2. הפץ 100 μL של השעיית התא המסומנת לבארות מצופה, מודקת את הצלחת עבור 35 דקות ב 37 ° צ' ב 5% v/v שיתוף חממה2 .
  3. הסר את התאים הלא מחסיד על-ידי הסרת supernatant. לשטוף פעם אחת עם dPBS המכיל 0.5% BSA, 0.7 mM Ca2 + ו 0.7 mM Mg2 +.
  4. Lyse תאים חסיד על-ידי הוספת 200 μL/טוב של 10 מ"מ טריס-HCl, pH 7.4 + 0.1% v/v SDS ולקרוא מיד את הצלחת 96-באר עם קורא הזריחה (544 nm, פליטה 590 nm) באמצעות עקומת כיול שנוצר באמצעות העלאת מספר גדל והולך של מתויג תאים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HA שלילית גבוה-מולקולרית משקל רב-שלילי, אשר מורכב של חוזר (β, 1-4)-D-חומצה גלוקורונית-(β, 1-3)-N-מרחריל-D-גלוקוסמיטין יחידות דיאכראמיד (איור 1B)7. המופע של הכריכה של HA על הצלחת 96-באר, כמו גם את היעילות של השתק שלה נבדקו לנצל את היתרונות של biotinylated HA (ביו-HA). ריכוזים שונים של ביו-HA, החל 10 μg/mL ל 1 מ"ג/mL, היו מחדש מושעה 100 mM קרבונט/ביקרבונט-מאגר pH 9.6 ו מודבטים לילה ב 4 ° c.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים שיטה קלה לחקור כיצד המשלים רכיב C1q, אינטראקציה עם חומצה יאלורונית, הוא מסוגל לווסת את ההתנהגות של תאים ראשוניים מבודדים מרקמות הגידול האנושי. שניהם HA ו C1q נמצאים בשפע בסביבה מיקרוברקמות הן בתנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים, המשתתפים בתהליכים ביולוגיים מספר תאים. למשל, C1q הוכח להיות נוכח המיקרו הסביבה של השליה שבו הוא מעדיף הפלישה trophoillהפיצוץ של הדציבלים האימהי במהלך placentation8. C1q מופקד גם בעור הפצע-ריפוי שבו הוא מטפח את התהליך אנגיוגנטי הנדרש התחדשות רקמות ותיקון

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי המחקר נערך בהעדר קשרים מסחריים או פיננסיים שיכולים להתפרש כניגוד אינטרסים פוטנציאלי.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים איוון Donati על מתן HA, לאונרדו Amadio, גבריאלה Zito (המחלקה של גינקולוגיה של IRCCS "Burlo Garofolo", טריאסטה, איטליה) ו אנדריאה רומנו (יחידת המחקר הקליני של האנטומיה והיסטולוגיה הפתולוגיים, קאטניארה בית החולים, טריאסטה, איטליה ) עבור אוסף דגימת הרקמה. אנו מודים גם ניקולא מורוזיני לעזרה בהכנת וידאו ואלכס קופולה, הקול. עבודה זו היתה נתמכת על ידי מענקים מהמכון לבריאות הילד, IRCCS "Burlo Garofolo", טריאסטה, איטליה (RC20/16) ו Fondazione Cassa די ריספרמיו טריאסטה ל ר. בולה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
100&דק; ומיקרו; m מסנן נקבוביותBD Falcon352360
תמיסת אמפוטריצין B (אזור פטריות)סיגמא-אולדריץ' 1397-89-3
מדעים אימונולוגייםבסיסיים של FGFGRF-15595
סידן כלורידסיגמא-אולדריץ' C-4901
קולגנאז סוג IWorthington Biochemical Corporation, DBAMX1D12644
D-GlucoseSigma-Aldrich 50-99-7
DNase I רוש10 104 159 001
EDTAסיגמא-אולדריץ' 60-00-4
EGFמדעים אימונולוגייםGRF-10544
FAST DiIבדיקות מולקולריות, Invitrogen, Thermo Fisher ScientificD7756
סרום בקר עובריGibco,  Thermo Fisher Scientific10270-106
פיברונקטיןRoche11051407001
בקבוק לתרבית תאיםCorning430639סטרילית ומאווררת
Sigma-Aldrich G1397-10ML
האנק' s תמיסת מלח מאוזנת (HBBS) סיגמא-אולדריץ' H6648בתוספת EDTA, גלוקוז, פניצילין-סטרפטמיצין, גנטמיצין ואזור פטריות
חומצה היאלורונית במשקל מולקולרי גבוהמתנה אדיבה מאת פרופ' איוון דונאטי
מדיום ללא סרום אנדותל אנושי גיבקו,  תרמו פישר סיינטיפיק11111-044בתוספת EGF (5  ng/mL), FGF בסיסי (10  ng/mL), ו-  1% פניצילין– סטרפטומיצין (סיגמא-אולדריץ')
מגנזיום כלורידקרלו ארבה13446-18-9
בינוני 199 עם האנק' מלחסיגמא-אולדריץ' M7653
פניצילין-סטרפטומיציןסיגמא-אולדריץ' P0781
מיקרוסקופיה דולג זמן ניקון מערכת הדמיה: BioStation, IM-Q
Titertek, Multiskan, ELISA ReaderFlow Labs,
TrypsinSigma-Aldrich T4674
תמיסת Gentamicin ,

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zamboni, F., Vieira, S., Reis, R. L., Oliveira, J. M., Collins, M. N. The potential of hyaluronic acid in immunoprotection and immunomodulation: Chemistry, processing and function. Progress in Materials Science. 97, 97-122 (2018).
  2. Lorusso, G., Ruegg, C. The tumor microenvironment and its contribution to tumor evolution toward metastasis. Histochemistry and Cell Biology. 130 (6), 1091-1103 (2008).
  3. Ricklin, D., Hajishengallis, G., Yang, K., Lambris, J. D. Complement: a key system for immune surveillance and homeostasis. Nature Immunology. 11 (9), 785-797 (2010).
  4. Bulla, R., et al. C1q acts in the tumour microenvironment as a cancer-promoting factor independently of complement activation. Nature Communications. 7, 10346(2016).
  5. Winslow, S., Leandersson, K., Edsjo, A., Larsson, C. Prognostic stromal gene signatures in breast cancer. Breast Cancer Research. 17, 23(2015).
  6. Collins, M. N., Birkinshaw, C. Hyaluronic acid solutions: A processing method for efficient chemical modification. Journal of Applied Polymer Science. 130 (1), 145-152 (2013).
  7. Itano, N. Simple primary structure, complex turnover regulation and multiple roles of hyaluronan. Journal of Biochemistry. 144 (2), 131-137 (2008).
  8. Agostinis, C., et al. An alternative role of C1q in cell migration and tissue remodeling: contribution to trophoblast invasion and placental development. Journal of Immunology. 185 (7), 4420-4429 (2010).
  9. Agostinis, C., et al. Complement Protein C1q Binds to Hyaluronic Acid in the Malignant Pleural Mesothelioma Microenvironment and Promotes Tumor Growth. Frontiers in Immunology. 8, 1559(2017).
  10. Bossi, F., et al. C1q as a unique player in angiogenesis with therapeutic implication in wound healing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (11), 4209-4214 (2014).
  11. Hosszu, K. K., et al. Cell surface expression and function of the macromolecular c1 complex on the surface of human monocytes. Frontiers in Immunology. 3, 38(2012).
  12. Laurent, T. C., Fraser, J. R. Hyaluronan. Journal of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 6 (7), 2397-2404 (1992).
  13. Gaboriaud, C., et al. The crystal structure of the globular head of complement protein C1q provides a basis for its versatile recognition properties. Journal of Biological Chemistry. 278 (47), 46974-46982 (2003).
  14. Lam, J., Truong, N. F., Segura, T. Design of cell-matrix interactions in hyaluronic acid hydrogel scaffolds. Acta Biomaterialia. 10 (4), 1571-1580 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Extracellular MatrixTumor MicroenvironmentEnzyme Linked Immunosorbent AssayFluorescent Cell LabelingStandard Curve GenerationCoating ProcedureCell Adhesion Assay

מאמרים קשורים