Method Article

זיהוי של קידוד ללא קידוד RNA מחלקות לידי ביטוי החזירים דם מלא

DOI:

10.3791/58689

⸱

November 28th, 2018

 ,  , 
1Virus and Prion Research Unit, National Animal Disease Center, USDA, Agricultural Research Service, 2ORAU/ORISE

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים פרוטוקול אופטימיזציה עבור העיבוד של קידוד (mRNA) האופטימיזציות גלובין (ncRNA) ללא קידוד RNA-seq ספריות של דגימת דם כל יחיד.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כניסתו של יותר ויותר חזקים וחדשניים הבא הדור רצף טכניקות פתחה דרכים חדשות היכולת לבחון בביטוי הגן הבסיסי הקשור תהליכים ביולוגיים של עניין. חידושים אלה מאפשרים לא רק חוקרים לבחון ביטוי מ רצפי mRNA זה הקוד של הגנים את תפקוד התאים השפעה, אך גם מולקולות RNA (ncRNA) ללא קידוד שנותרו לא מתורגם, אבל עדיין יש פונקציות רגולטוריות. למרות חוקרים יש את היכולת להתבונן ביטוי mRNA והן ncRNA, זה כבר מקובל מחקר להתמקד אחת או אחרת. עם זאת, כאשר מחקרים מעוניינים בביטוי mRNA והן ncRNA, פעמים רבות הם משתמשים דגימות נפרד לבחון קידוד או ללא קידוד RNAs לאור ההבדל בהכנות ספריה. זה יכול להוביל הצורך לקבלת דוגמאות נוספות, אשר יכול להגביר הזמן, מתכלים, והלחץ בעלי חיים. בנוסף, הוא עלול לגרום חוקרים להחליט להכין דגימות לבדיקה אחת בלבד, בדרך כלל mRNA, הגבלת מספר שאלות ביולוגי יכול ייחקרו. עם זאת, ncRNAs להקיף כמה מחלקות רגולטוריות תפקידים עם הביטוי הזה mRNA אפקט. כי ncRNA חשובים היסוד תהליכים ביולוגיים, הפרעה של תהליכים אלה ב במהלך זיהום, הם עשויים, לכן, לבצע יעדים אטרקטיביים עבור הרפוי. כתב יד זה מדגים פרוטוקול ששונה לדור ה-mRNA, ללא קידוד RNA ביטוי ספריות, כולל RNA נגיפי, מתוך מדגם יחיד של דם מלא. אופטימיזציה של פרוטוקול זה, שיפור טוהר RNA, גדל מצדו להתאוששות של RNAs מפוגל, הושמט גודל הבחירה, כדי לאפשר לכידה של RNA יותר מינים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רצף הדור הבא (הגדרות) התפתחה כלי רב עוצמה עבור החקירה של השינויים המתרחשים ברמת גנומית של אורגניזם ביולוגי. הכנת הדוגמא לשיטות המיתרים יכולים להיות מגוונים בהתאם האורגניזם, סוג הרקמה, והם וחשוב השאלות החוקרים להוטים כתובת. מחקרים רבים פנו המיתרים כאמצעי של הלומדים את ההבדלים בביטוי הגנים בין מדינות כגון אנשים בריאים וחולים1,2,3,4. קח רצף במקום על בסיס כל הגנום ומאפשר חוקר ללכוד את רוב, אם לא כל, של המידע גנומית סמן גנטי מסוים בכל פעם הצבע.

הסימנים הנפוצים ביותר הביטוי נצפו הן RNAs שליח (mRNAs). ההליכים הנפוצה ביות....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקולים בעלי חיים אושרו על ידי המרכז הלאומי חיה המחלה (USDA-ARS-NADC) חיה אכפת ועל שימוש הוועדה.

1. דם חזיר חנקן נוזלי

  1. לאסוף דגימות דם לתוך צינורות RNA. איסוף ~2.5 mL ומעלה אם צינורות אוסף גדול יותר זמינים.

2. עיבוד של דם חזיר דגימות

  1. Centrifuge צינורות הדם ב x 5,020 g 10 דקות בטמפרטורת החדר (15-25 ° C). אם עיבוד קפוא דגימות דגירה צינור בטמפרטורת החדר במשך מינימום של 2 h לפני צנטריפוגה.
  2. להסיר את תגובת שיקוע ולהוסיף 8 מ ל מים נטולי RNase בגדר. סגור, מערבולת בגדר עד זה בעליל היא התפרקה. צנטריפוגה צינורות מדגם ב x 5,020 g 10 דקות בטמפרטורת החדר....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדגימות נציג במחקר שלנו הם גלובין דגימות דם כל מדולדל ribo. התוצאה נציג של הפרוטוקול מורכב מדגם ספריית מדולדל גלובין עם מספר שלמות RNA (RIN) מעל 7 (איור 1) ו- 260/280 nm ריכוז יחסי או מעל 2 (איור 1ב' וג' 1). אימות של התוצאה מדגם בוצעה באמצעות ספקטרופוטומטרים כדי לתת את הריכוז הסופי של כל ספריה, מבוססי שבב אלקטרופורזה לתת מספר רין יחד עם תרשים של פסגות להראות אילו מולקולות (mRNA או ncRNA) נלכדו המ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השלב הקריטי הראשון בפרוטוקול כי עשה את זה אופטימיזציה כלל הצעדים דלדול נוסף גלובין, שהפכו אותו ניתן לקבל איכות קריאות מדגימות דם מלא. אחת המגבלות הגדולות על השימוש דם במחקרים רצף המספרים גבוהה הקריאות במדגם זה יהיה למפות גלובין מולקולות להפחית את הקורא את יכולת למפות את מולקולות אחרות הריבית18. לכן, תוך אופטימיזציה של הפרוטוקול עבור סוג המדגם שלנו, היינו צריכים לשלב צעד דלדול גלובין כדי להבטיח ש-mrna אפשרי הגבוהה ביותר, ללא קידוד RNA ללכוד דרך רצף. כל הדגימות היו גלובין דלה לחשבון עבור רמות גבוהות.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

איזכור שמות מסחריים או מוצרים מסחריים במאמר זה היא אך ורק לצורך אספקת מידע ספציפי, לא משתמע המלצה או אישור על ידי מחלקת החקלאות של ארצות הברית. משרד החקלאות הוא הזדמנות שווה ספק המעסיק.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו בעיקר נתמך על ידי על ידי משרד החקלאות NIFA אפריק 2013-67015-21236, וכן על ידי משרד החקלאות NIFA אפריק 2015-67015-23216. מחקר זה נתמך בחלקה על ידי פעילות חקלאית מחקר שירות מחקר השתתפות בתוכנית מנוהל על ידי המכון אוק רידג על מדע, חינוך (ORISE) דרך הסוכנויות הסכם בין (משרד האנרגיה של ארה DOE), מחלקת החקלאות של ארצות הברית. ORISE מנוהלת על ידי אלון רכס Associated אוניברסיטאות תחת חוזה דו. לא. דה-AC05-06OR2310.

ברצוננו להודות ד ר קיי Faaberg HP-PRRSV זיהומיות שיבוטים, ד ר סוזן Brockmeier עזרה עם חיות מעורב בניסוי, סו Ohlendorf עבור שירותי מזכירות בהכנה של כתב היד.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
צינורות PAXgenePreAnalytix762165
ביולוגיה מולקולרית כיתהמים ThermoFisher10977-015
mirVana miRNA בידוד ערכתThermoFisherAM1560
Rneasy MinElute ניקוי ערכת QIAGEN74204
100% אתנולDecon Labs, Inc.2716
0.2 מ"ל צינורות דקים דופןThermoFisher98010540
1.5 מ"ל RNase / DNase - צינורות חינםכל ספק
Veriti 96 באר ThermocyclerThermoFisher4375786R
אוליגו הפחתת גלובין (&אלפא; 1)כל ספקרצף GAT CTC CGA GGC TCC TCC AGC TTA ACG GT
הפחתת גלובין אוליגו (&אלפא; 2)כל ספקרצף TCA ACG ATC AGG AGG TCA GGG TGC
AA הפחתת גלובין אוליגו (&בטא; 1)כל ספקרצף AGG GGA ACT TAG TGG TAC TTG TGG GT
הפחתת גלובין אוליגו (&בטא; 2)כל ספקרצף GGT TCA GAG GAA AAA GGG CTC CTC CTC CT
10X Oligo Hybridization
, pH 7.6פישר סיינטיפיקBP1757-100-KCl
Millipore Sigma60142-100ML-F
10X RNase H Buffer
 -Tris-HCl, pH 7.6Fisher ScientificBP1757-100
 -DTTThermoFisherY00147
 -MgCl2PromegaA351B
 -ביולוגיה מולקולרית דרגה מיםThermoFisher10977-015
RNase HThermoFisherAM2292
SUPERase-INThermoFisherAM2694מעכב Rnase
EDTAMillipore SigmaE7889
מיקרוצנטריפוגהכל ספק
  2100 מכשיר אלקטרופורזה ביו-אנלייזרAgilent TechnologiesG2938C
Agilent RNA 6000 Nano KitAgilentTechnologies 5067-1511
Agilent רגישות גבוהה DNA  ערכתAgilent Technologies5067-4626
ערכת הכנה לספריית RNA כוללת של TruSeq עם Ribo-Zero mRNA של IlluminaRS-122-2201; סט אדם/עכבר/חולדה A  (48 דגימות, 12 אינדקסים)
TruSeq תקוע כולל RNA מדריך הכנת מדגםIlluminaזמין באינטרנט
RNAClean XP חרוזיםBeckmanCoulterA63987
AMPure XP חרוזיםBeckmanCoulterA63880
MicroAmp אופטי 8 צינורות רצועתThermoFisherN80105800.2 מ"ל צינורות דקים דופן
MicroAmp אופטי 8 צינורות רצועתThermoFisherN801-0535
RNase/DNase - מאגרי ריאגנטים בחינםכל ספק
SuperScript II Reverse TranscriptaseThermoFisher18064-014
MicroAmp Optical 96 לוחות בארThermoFisherN8010560אלה שימשו במקום צלחות .3 מ"ל לפי הצורך
סרט דבק אופטי MicroAmpThermoFisher4311971
NEBNext Multiplex סט הכנה לספריית RNA קטנה עבור Illumina® (סט 1) ניו אינגלנד BiolabsE73005ערכת RNA קטנה
NEBNext Multiplex סט הכנה לספריית RNA קטנה עבור Illumina® (סט 2) ניו אינגלנד BiolabsE75805ערכת RNA קטנה
QIAQuick PCR ערכת טיהורQIAGEN28104
96S צלחת מגנט סופרALPAQUAA001322
Buffer-Tris-HClערכת

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Finotello, F., Di Camillo, B. Measuring differential gene expression with RNA-seq: challenges and strategies for data analysis. Briefings in Functional Genomics. 14 (2), 130-142 (2015).
  2. Coble, D. J., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Whole Blood RNAmRNA SequencingNon coding RNARNA IsolationGlobin ReductionLibrary PreparationNext Generation SequencingPhenol ChloroformRNase H DigestionFilter Cartridge

Related Articles