צעד אחר צעד טיהור של מתחמי Macromolecular בעזרת RNA המצורפת ביוטין, מקשר צילום-cleavable

Summary

מתחמי RNA/חלבון מטוהרים באמצעות אסטרטגיה botin-streptavidin הם eluted פתרון תחת תנאים denaturing בטופס אינו מתאים עוד טיהור, אנליזה פונקציונלית. כאן, אנו מתארים שינוי של אסטרטגיה זו אשר מנצל מקשר צילום-cleavable RNA, צעד • UV-תנאי עדין, מניב את מתחמי ה-RNA/חלבון המקורי והמלא.

Abstract

במשך שנים רבות, חזק במיוחד, במהירות בנוי האינטראקציה בין ביוטין streptavidin יש כבר בהצלחה מנוצל לשם טיהור חלקי של מתחמי RNA/חלבון חשוב מבחינה ביולוגית. עם זאת, אסטרטגיה זו סובלת חיסרון מרכזי אחד המגביל את ניצול רחב יותר: האינטראקציה של ביוטין/streptavidin יכול להיות שבור רק תחת תנאים גם לשבש את תקינות מתחמי eluted, ומכאן מסלק denaturing שלהם אנליזה פונקציונלית עוקבות ו/או נוספות טיהור באמצעות שיטות אחרות. בנוסף, הדגימות eluted נגועים תכופות עם החלבונים רקע המשייכים nonspecifically streptavidin חרוזים, שמסבך הניתוח של מתחמי מטוהרת על ידי צביעת כסף ספקטרומטר מסה. כדי להתגבר על מגבלות אלה, פיתחנו משתנה של האסטרטגיה ביוטין/streptavidin בו ביוטין מצורף של המצע RNA באמצעות מקשר צילום-cleavable, מתחמי ותשמרו על חרוזים streptavidin הם eluted באופן סלקטיבי על פתרון טופס מקורי על-ידי גלי ארוך UV, עוזב את החלבונים רקע על החרוזים. סובסטרטים איגוד ה-RNA קצר יותר יכול להיות מסונתז כימית עם ביוטין והמקשר צילום-cleavable covalently מצורף לסוף 5' RNA, ואילו עוד מצעים RNA יכול להתבצע עם שתי הקבוצות באמצעות oligonucleotide משלימים. אלה שתי גרסאות של השיטה • UV-תנאי נבדקו עבור טיהור של מתחמי עיבוד snRNP תלוית U7 זה קליב היסטון pre-mRNAs בקצה 3' והוכיח שניהם להשוות לשני בחיוב בעבר פיתחו שיטות טיהור. הדגימות UV eluted הכיל כמויות לזיהוי בקלות snRNP U7 שהיה ללא מזהמים חלבון גדול ומתאים לניתוח ישיר באמצעות ספקטרומטר מסה מבחני פונקציונלי. השיטה המתוארת ניתן להיות ברצון הותאם עבור טיהור של מתחמי מחייב אחרים RNA, הפועל בשיתוף עם אתרי קישור יחיד, כפול-גדילי DNA לטהר חלבונים ספציפיים הדנ א ואת מתחמי macromolecular.

Introduction

ב פרוקריוטים, מבשרי RNA פולימראז II-שנוצרו mRNA (pre-mRNAs) עוברים מספר אירועים ההבשלה בגרעין לפני שהפך תקינים mRNA תבניות עבור סינתזת החלבון בציטופלסמה. אחד האירועים הללו הוא עיבוד קצה 3'. עבור הרוב המכריע של טרום-mRNAs, עיבוד קצה 3' כרוך המחשוף מצמידים פוליאדנילציה. תגובה דו-שלבית זה מזורז על ידי קומפלקס יחסית שופע בהיקף של יותר מ-15 חלבונים¹. בעלי חיים תלויי-שכפול היסטון pre-mRNAs מעבד בקצה 3' מנגנון שונה שבו הוא שיחק תפקיד מפתח על ידי U7 snRNP, שפע נמוך מורכבים בהיקף של snRNA U7 של נוקלאוטידים ~ 60 וחלבונים מספר^2,3 . U7 snRNA בסיסי זוגות עם רצף מסוים היסטון pre-mRNA, לאחד subunits של snRNP U7 מזרז את התגובה המחשוף, יצירת היסטון בוגרת mRNA ללא poly(A) זנב. 3' עיבוד קצה של היסטון pre-mRNA דורש גם גזע לופ מחייב חלבון (SLBP), אשר נקשר שנשמרת גזע-לולאה ממוקם במעלה הזרם של אתר המחשוף ומגבירה את גיוס snRNP U7 המצע^2,3. מחקרים שמטרתם זיהוי רכיבים בודדים של snRNP U7 היה מאתגר בשל ריכוז נמוך snRNP U7 בתאים בעלי חיים ואת הנטייה של המתחם מביצועם או עוברים proteolysis חלקית במהלך טיהור כתוצאה מהשימוש דטרגנטים קלים-^4,-^5,-⁶, שוטף מלח גבוהה ו/או מספר צעדים כרומטוגרפי^7,8,9.

לאחרונה, כדי לקבוע את ההרכב של מכונות עיבוד U7 תלוית, נדגרה קטע קצר של ביוטין המכילים pre-mRNA היסטון 3' או 5' עם תמצית גרעיני, מתחמי שהורכב נתפסו על מצופים streptavidin agarose חרוזים^5,6,10. בעקבות האינטראקציה בין ביוטין streptavidin חזק במיוחד, חלבונים ותשמרו על חרוזים streptavidin היו eluted תחת denaturing תנאים על ידי הרתחה ב מרחביות, נותחו על ידי צביעת כסף, ספקטרומטר מסה. בעת גישה פשוטה זו זוהו מספר מרכיבי snRNP U7, זה הניב דגימות גסה יחסית, לעיתים קרובות מזוהם עם מספר רב של חלבונים רקע מאוגדים nonspecifically streptavidin חרוזים, שעשוי להיות מיסוך רכיבים מסוימים של את מכונות עיבוד ומניעת אצלם הזיהוי על כסף מוכתם ג'לים^5,6,10. חשוב, גישה זו גם מנעה כל מחקרים תפקודית ועם החומר המבודד שלו טיהור נוספת כדי הומוגניות על ידי שיטות נוספות.

הוצעו מספר שינויים לאורך זמן לפנות את אופי האינטראקציה ביוטין/streptavidin, עם רובם תוכננה גם להחליש את האינטראקציה או לספק זרוע מרווח מבחינה כימית cleavable ב כמעט בלתי הפיך ביוטין המכילות ריאגנטים^11,12. החיסרון של כל השינויים האלה היה כי הם להפחית באופן משמעותי את יעילות השיטה ו/או נדרש לעיתים קרובות תנאים שאינם-פיזיולוגיים במהלך השלב • תנאי, לסכן את תקינות או פעילות של החלבונים מטוהרים.

כאן, אנו מתארים גישה שונה כדי לפתור את הבעיה הטבועה של האסטרטגיה ביוטין/streptavidin באמצעות ה-RNA סובסטרטים שבו ביוטין covalently מחובר 5' סוף דרך 1 צילום-cleavable-(2-nitrophenyl) moiety אתיל זה רגיש זמן לנופף UV^13,14. בדקנו גישה זו לטיהור של מכונות עיבוד U7 תלוית המגביל מ דרוזופילה ותמצית מידע יונקים גרעיני¹⁵. בעקבות של דגירה קצרה של ה-pre-mRNA היסטון ביוטין המכיל את מקשר צילום-cleavable עם תמצית גרעיני, מתחמי עיבוד שהורכב ותשמרו על streptavidin חרוזים, ביסודיות שטופים בעדינות פרסמה פתרון ביליד טופס על-ידי חשיפה לאור nm UV ~ 360. השיטה • UV-תנאי היא מאוד יעילה, מהירה וישירה, מניב כמויות מספיקות של snRNP U7 להמחיש מרכיביו מאת נכספת מכתים מ קטנה כמו 100 µL של תמצית¹⁵. החומר UV-eluted היא חינם של חלבונים רקע מתאים ניתוח ישירה ספקטרומטר מסה, צעדים נוספים טיהור מבחני אנזימטיות. יכול להיות מאומץ באותה השיטה לטיהור של אחרים מתחמי RNA/חלבון שדורשים אתרי קישור RNA קצר יחסית. ביוטין והמקשר צילום-cleavable יכול גם להיות covalently מצורף אל יחיד, כפול-גדילי ה-DNA, פוטנציאל הרחבת בשיטת UV-• תנאי לטיהור של מתחמי DNA/חלבונים שונים.

סינתזה של סובסטרטים RNA המכיל covalently מצורף ביוטין, מקשר צילום-cleavable היא מעשית רק עם הרצפים עולה על ~ 65 נוקלאוטידים, נהיה יקר ולא יעיל עבור רצפי באופן משמעותי יותר. כדי לטפל בבעיה זו, פיתחנו גם גישה חלופית מתאימה יותר מטרות איגוד ה-RNA. בגישה זו, ה-RNA של כל רצף נוקלאוטיד לאורכה שנוצר במבחנה על ידי שעתוק T7 או SP6 ואת annealed כדי oligonucleotide משלימה קצרה שמכיל ביוטין והמקשר צילום-cleavable בקצה 5' (טרנס תצורה). דופלקס תוצאות משתמשים לאחר מכן לטהר את הפרט מחייב חלבונים או קומפלקסים macromolecular על חרוזים streptavidin בעקבות באותו פרוטוקול המתואר לשם סובסטרטים RNA שמכיל ביוטין cleavable-צילום מצורף covalently (חבר העמים תצורה). עם השינוי הזה, ביוטין צילום-cleavable ניתן להשתמש בשילוב עם במבחנה שנוצר תעתיקים המכיל מאות נוקלאוטידים, הרחבת בשיטת UV-• תנאי לטיהור של רחב טווח של RNA/חלבון.

Protocol

1. הכנת הרקע

הערה: מצעים RNA קצרים יותר מאשר נוקלאוטידים ~ 65 יכול להיות מסונתז כימית עם ביוטין (B) והמקשר צילום-cleavable (pc) (המכונה יחד ביוטין צילום-cleavable או pcB) covalently המצורפת לקצה RNA 5' (תצורתציס ). מצעים RNA המכיל אתרי קישור באופן משמעותי יותר צריך להיות שנוצר במבחנה על ידי שעתוק T7 (או SP6), לאחר מכן annealed כדי oligonucleotide מתאם משלימים קצר המכיל pcB moiety בקצה 5' (טרנס תצורת) (איור 1).

1. אתרי קישור בהיקף של פחות מ 65 ~ נוקלאוטידים, להשתמש יצרן מסחרי (טבלה של חומרים) לסנתז כימית RNA עניין עם מעגלים מודפסים covalently המצורפת לקצה RNA 5' (איור 1A ואיור 2A). מתמוססים במים סטריליים כדי להיכנס לריכוז הרצוי ואחסן aliquots קטן ב- 80 ° c
2. עבור אתרי קישור באופן משמעותי יותר מ ~ 65 נוקלאוטידים, טופס דופלקס חלקית של של במבחנה נוצר RNA של עניין oligonucleotide מתאם משלימים המכיל את moiety pcB בקצה 5' (איור 3 א).
   1. מבצע T7 שעתוק הדנ א של פלסמיד ליניארית או תבנית ה-PCR המתאימה ליצירת RNA עם אתר איגוד עניין המורחבת בקצה 3' על ידי רצף ~ 20-נוקלאוטיד שרירותי.
   2. השתמש יצרן מסחרי (טבלה של חומרים) לסנתז כימית של oligonucleotide מתאם משלים הסיומת 3' ב- RNA שנוצר על-ידי T7 ומכיל pcB בקצה 5' (איור 3 א).
      הערה: שני 18-atom מפרידי ו- 2-3 נוקלאוטידים שאינם משלימים ניתן להציב בקצה 5' של oligonucleotide כדי להפחית מכשלה הסטריים פוטנציאלי בין מתחם מאוגד streptavidin חרוזים. רצוי גם oligonucleotide הוא שונה בצורה אחידה עם 2' O-methyl קבוצה כדי לשפר את הכוח של דופלקס וכדי לספק עמידות נגד nucleases שונים.
   3. Anneal של RNA שנוצר על-ידי T7 כדי oligonucleotide מתאם pcB.
      1. מיקס 20 pmol של RNA ואת pmol 100 של oligonucleotide pcB מתאם (היחס 1:5 טוחנת) ב- mL 1.5 צינור µL 100 המכיל מאגר מחייב עם ההרכב הבא: 75 מ מ אשלגן כלורי, 15 מ מ HEPES pH 7.9, גליצרול 15%, 10 מ מ ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA).
         הערה: חשוב להשתמש כמות מזערית של oligonucleotide מתאם זה מספיק ליצור דופלקס עם סובסטרט pre-mRNA רוב (אם לא כל) המשמשים את התגובה מחזק. זה יכול בנוחות תיקבע על-ידי תיוג RNA המצע בקצה 5' עם ³²P, חישול המצע שכותרתו עם הגדלת כמויות של מתאם oligonucleotide באמצעות שונים מאגר השמירה של תנאים וניטור אות רדיואקטיבי streptavidin חרוזים לאחר מספר שוטף של החרוזים עם המאגר מחייב.
      2. מקם את הצינור במים רותחים במשך 5 דקות.
      3. לאפשר למים להתקרר לטמפרטורת החדר.

2. מתחם הרכבה

1. תוספת 1 מ"ל של תמצית גרעיני העכבר (או תמצית אחרת של הבחירה) עם 80 מ מ EDTA pH 8 כדי ריכוז סופי של 10 מ מ כדי לחסום nucleases תלויי-מטאל לא ספציפית הנוכחים התמצית.
   הערה: זה יגרום התאמת מאגר של התמצית להרכב אותו עד כדי כך במאגר של איגוד (ראה שלב כ- 1.2.3.1). EDTA אינה משפיעה על עיבוד במבחנה של היסטון pre-mRNAs, אך ייתכן מזיקים לטיהור חלבונים או מתחמים חלבון להרכיב באופן תלוי-מגנזיום. במקרים אלה, יש להימנע EDTA.
2. להוסיף 5-10 pmol של המצע RNA עם moiety pcB ב- cis התגית (ראה צעד 1.1) או טרנסג'נדרים (ראה שלב 1.2.3.3) עד 1 מ"ל של התמצית המכיל 10 מ מ EDTA.
   הערה: הכמות של RNA צריך להיות המוגמרת בסדרה של ניסויים למשפט. באמצעות מדי סובסטרט RNA ולטיהור מתחם המגביל אולי לא מועיל, משמעותי בשיפור הרקע של RNA ספציפי מחייב חלבונים מבלי השפיע על היבול של חלבונים ספציפיים.
3. דגירה המצע RNA עם תמצית למשך 5 דקות על קרח, מדי פעם לערבב את הדגימה.
   הערה: הן הזמן ואת הטמפרטורה של הדגירה צריך שתוקם מדעית והם עשויים להשתנות באופן משמעותי, בהתאם לאופי המתחם RNA/חלבון ספציפי.
4. לסובב את התערובת הדגירה ב microcentrifuge טרום מקורר במשך 10 דקות ב 10,000 g x כדי להסיר את כל פוטנציאל פוחת משקעים ולאסוף בזהירות הימנעות supernatant העברת בגדר.

3. בטקטיקות של מתחמי ה-RNA/חלבון על חרוזים Streptavidin.

1. להעביר ~ 100 µL streptavidin agarose חרוז השעיה מן הספק מסחרי (טבלה של חומרים) צינור 1.5 mL, להגדיל את נפח עם המאגר מחייב (75 מ"מ אשלגן כלורי, 15 מ מ HEPES pH 7.9, גליצרול 15%, 10 מ מ EDTA).
   הערה: מאגר זה צריך להיות ההרכב אותו עד כדי כך את התערובת מחזק, תמצית המשמש להרכבה מורכבים (שלב 2.1).
2. לאסוף את החרוזים בחלק התחתון של הצינור על ידי ספינינג למשך 2-3 דקות ב 25 x g, וארוקן את תגובת שיקוע.
3. חזור על הפעולות כביסה/ספינינג אותו 2 - 3 פעמים כדי equilibrate את החרוזים עם המאגר מחייב.
   הערה: בסוף שלב זה, בגדר של החרוזים צריך נפח של ~ 30 µL.
4. לטעון את תגובת שיקוע המכיל המתחם שהורכב (שלב 2.4) מעל החרוזים agarose equilibrated streptavidin.
5. סובב h 1 ב 4 ° C כדי לשתק RNA ו את מתחמי המאוגד על החרוזים.
6. לאסוף את החרוזים בחלק התחתון של הצינור על ידי ספינינג למשך 2-3 דקות ב 25 x g.
   הערה: השתמש חבטה החוצה הרוטור כדי למנוע אובדן משמעותי של החרוזים אם הם נוטים לדבוק הצד של הצינור בהרוטורים זוויתי.
7. וארוקן את תגובת שיקוע ולשטוף את החרוזים פעמיים עם 1 מ"ל מאגר מחייב, באמצעות צנטריפוגה באותם התנאים.
8. להוסיף 1 מ"ל של המאגר איגוד ולסובב את הדגימה h 1-4 מעלות צלזיוס.
   הערה: שלב זה יכול להתקצר אם המתחם הקימו על המצע נוטה מביצועם.
9. ספין למטה החרוזים למשך 2-3 דקות ב 25 x g, להוסיף 1 מ"ל של המאגר, להעביר את המתלים צינור חדש.
10. סובב עבור h 1 נוספים או קצר יותר, אם המתחם אינה יציבה, ספין למטה למשך 2-3 דקות ב g 25 x, להעביר את החרוזים צינור 500 µL µL 200 איגוד המאגר.

4. UV-• תנאי.

1. הפעל בעוצמה גבוהה מנורת UV פולטות אור UV nm 365 למשך 5-10 דקות לפני שהגיע מלא זוהר.
   הערה: זה חיוני כדי להשיג אנרגיה מקסימלית של פליטת UV בתחילתו של הקרנה.
2. למלא את תחתית צלחת פטרי (100 מ"מ x 15 מ"מ) עם קרח אציקלוביר, לערום אותו מעל המכסה של המנה.
3. בקצרה מערבולת הצינור המכיל המתחם קיבוע, במקום זה בצורה אופקית על קרח ולכסות עם המנורה מראש ומחוממת, המבטיח כי המדגם ממוקם במרחק של 2-3 ס מ של פני השטח של הנורה.
   הערה: אם המרחק הוא גדול מדי, להשתמש פטרי נוספים או אובייקטים אחרים מתאימים להביא את הדגימה קרוב יותר אל הנורה.
4. להאיר עבור סכום כולל של 30 דקות, לעתים קרובות היפוך, vortexing את הצינור כדי להבטיח חשיפה אחידה של ההשעיה UV וכדי למנוע התחממות יתר.
   הערה: כדי לספק קירור נוספים, הצעד • UV-תנאי יכול להתבצע בחדר קר. לעבור צלחת פטרי עם קרח טרי במקרה של יתר הקרח נמס.
5. ספין למטה החרוזים למשך 2-3 דקות ב 25 x g ולאסוף את תגובת שיקוע.
6. ספין מחדש את תגובת שיקוע משתמש באותם התנאים ולאסוף את תגובת שיקוע.
   הערה: השאר כמות קטנה של תגובת שיקוע בתחתית כדי למנוע העברה של חרוזים שיורית.

5. דגימת על ידי צביעת כסף ואחריו ספקטרומטר מסה.

1. שימוש מרחביות/לזיהוי ג'ל אלקטרופורזה להפרדת שבריר של תגובת שיקוע UV-eluted לבין השבר באותו חומר הותיר את החרוזים הבאים • תנאי UV.
   הערה: הניתוח עשוי לכלול גם את aliquot של חרוזים מופנמים מדגם לפני • UV-תנאי.
2. מכתים את ג'ל המכיל חלבונים מופרדים באמצעות כסף זמין מסחרית מכתים קיט.
3. להעריך את היעילות של UV-• תנאי על-ידי השוואת עוצמות של חלבונים נוכח תגובת שיקוע של UV-eluted, אלו שנשארו מאחור החרוזים בעקבות הקרנת UV.
4. בלו הלהקות חלבון עניין, לקבוע את זהותם באמצעות ספקטרומטר מסה באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים^10,15.

6. ניתוח הכללית של UV-eluted מדגם ידי ספקטרומטר מסה.

1. ישירות לנתח שבריר תגובת שיקוע UV eluted באמצעות ספקטרומטר מסה כדי לקבוע את פרוטאום כולו של החומר מטוהרים בצורה בלתי לא משוחדת.
   הערה: ניתן לבצע זאת על ידי טיפול בבית-פתרון של הדגימות מטוהרים עם טריפסין ואחריו פרוטוקולים סטנדרטיים ספקטרומטר מסה כדי לקבוע את זהותו של צור פפטידים^10,15.

Results

השיטה • UV-תנאי נבדקה יחד עם שני מצעים RNA מסונתז כימית covalently מצורף בקצה 5' pcB moiety (תצורתציס ): pcB-SL (איור 1) ו- pcB-dH3/5 מ' RNAs (איור 2). 31-נוקלאוטיד pcB-SL RNA מכיל מבנה גזע לופ ואחריו זנב תקועים 5-נוקלאוטיד יחיד והוא רצף שלו זהה 3' סוף היסטון בוגרת mRNA (כלומר., לאחר המחשוף של היסטון pre-mRNA מאת U7 snRNP). רצף ייחודי זה הוא אתר איגוד ידוע עבור שני חלבונים נוכח השבר cytoplasmic יונקים: SLBP ו- 3...

Discussion

השיטה המתוארת כאן היא פשוטה וחוץ שילוב מקשר צילום-cleavable, השלב • UV-תנאי אינו נבדל מן השיטות הנפוצות לנצל מאוד חזקה האינטראקציה בין ביוטין streptavidin. הצעד • UV-תנאי יעילה מאוד, בדרך כלל שחרור יותר מ-75 אחוזים הרנ א קיבוע ומקושרת מהחלבונים streptavidin חרוזים, כשמאחוריו רקע גבוה של חלבונים הלא ספציפית לאגד החרוזים. על ידי ביטול על רקע זה, הצעד • UV-תנאי התשואות מתאימים לניתוח ישיר להפליא טהור דוגמאות על ידי צביעת כסף, ספקטרומטר מסה מבחני פונקציונלי.

כתוצאה המערבים של שלבים מעטים ופשוטים י...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Streptavidin-Agarose	Sigma	S1638-5ML
מנורת UV בעוצמה גבוהה גל ארוך	Cole-Parmer	UX-97600-00
נורה חלופית	Cole-Parmer	UX-97600-19	100 וואט כספית H44GS-100M נורת הפולטת 366 ננומטר אור UV (סילבניה)
RNA ואוליגונוקלאוטידים המכילים ביוטין ומקשר הניתן לצילום ב-cis	Dharmacon (Lafayette, CO) או Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA)		Requst a quote in Dharmacon
Beckman GH 3.8 רוטור דלי נדנדה	Beckman
RiboMAX מערכות ייצור RNA בקנה מידה גדול (פולימראז T7)	Promega	P1300
RiboMAX מערכות ייצור RNA בקנה מידה גדול (פולימראז SP6)	ערכת	P1280
Pierce	תרמו-פישר סיינטיפיק	24612