צעד אחר צעד טיהור של מתחמי Macromolecular בעזרת RNA המצורפת ביוטין, מקשר צילום-cleavable

Aleksandra Skrajna; Xiao-Cui Yang; Zbigniew Dominski

doi:10.3791/58697

Method Article

צעד אחר צעד טיהור של מתחמי Macromolecular בעזרת RNA המצורפת ביוטין, מקשר צילום-cleavable

DOI:

10.3791/58697

⸱

January 3rd, 2019

Aleksandra Skrajna¹ , Xiao-Cui Yang¹ , Zbigniew Dominski¹^,²

¹Integrative Program for Biological and Genome Sciences, University of North Carolina at Chapel Hill, ²Department of Biochemistry and Biophysics, University of North Carolina at Chapel Hill

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מתחמי RNA/חלבון מטוהרים באמצעות אסטרטגיה botin-streptavidin הם eluted פתרון תחת תנאים denaturing בטופס אינו מתאים עוד טיהור, אנליזה פונקציונלית. כאן, אנו מתארים שינוי של אסטרטגיה זו אשר מנצל מקשר צילום-cleavable RNA, צעד • UV-תנאי עדין, מניב את מתחמי ה-RNA/חלבון המקורי והמלא.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במשך שנים רבות, חזק במיוחד, במהירות בנוי האינטראקציה בין ביוטין streptavidin יש כבר בהצלחה מנוצל לשם טיהור חלקי של מתחמי RNA/חלבון חשוב מבחינה ביולוגית. עם זאת, אסטרטגיה זו סובלת חיסרון מרכזי אחד המגביל את ניצול רחב יותר: האינטראקציה של ביוטין/streptavidin יכול להיות שבור רק תחת תנאים גם לשבש את תקינות מתחמי eluted, ומכאן מסלק denaturing שלהם אנליזה פונקציונלית עוקבות ו/או נוספות טיהור באמצעות שיטות אחרות. בנוסף, הדגימות eluted נגועים תכופות עם החלבונים רקע המשייכים nonspecifically streptavidin חרוזים, שמסבך הניתוח של מתחמי מטוהרת על ידי צביעת כסף ספקטרומטר מסה. כדי להתגבר על מגבלות אלה, פיתחנו משתנה של האסטרטגיה ביוטין/streptavidin בו ביוטין מצורף של המצע RNA באמצעות מקשר צילום-cleavable, מתחמי ותשמרו על חרוזים streptavidin הם eluted באופן סלקטיבי על פתרון טופס מקורי על-ידי גלי ארוך UV, עוזב את החלבונים רקע על החרוזים. סובסטרטים איגוד ה-RNA קצר יותר יכול להיות מסונתז כימית עם ביוטין והמקשר צילום-cleavable covalently מצורף לסוף 5' RNA, ואילו עוד מצעים RNA יכול להתבצע עם שתי הקבוצות באמצעות oligonucleotide משלימים. אלה שתי גרסאות של השיטה • UV-תנאי נבדקו עבור טיהור של מתחמי עיבוד snRNP תלוית U7 זה קליב היסטון pre-mRNAs בקצה 3' והוכיח שניהם להשוות לשני בחיוב בעבר פיתחו שיטות טיהור. הדגימות UV eluted הכיל כמויות לזיהוי בקלות snRNP U7 שהיה ללא מזהמים חלבון גדול ומתאים לניתוח ישיר באמצעות ספקטרומטר מסה מבחני פונקציונלי. השיטה המתוארת ניתן להיות ברצון הותאם עבור טיהור של מתחמי מחייב אחרים RNA, הפועל בשיתוף עם אתרי קישור יחיד, כפול-גדילי DNA לטהר חלבונים ספציפיים הדנ א ואת מתחמי macromolecular.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ב פרוקריוטים, מבשרי RNA פולימראז II-שנוצרו mRNA (pre-mRNAs) עוברים מספר אירועים ההבשלה בגרעין לפני שהפך תקינים mRNA תבניות עבור סינתזת החלבון בציטופלסמה. אחד האירועים הללו הוא עיבוד קצה 3'. עבור הרוב המכריע של טרום-mRNAs, עיבוד קצה 3' כרוך המחשוף מצמידים פוליאדנילציה. תגובה דו-שלבית זה מזורז על ידי קומפלקס יחסית שופע בהיקף של יותר מ-15 חלבונים¹. בעלי חיים תלויי-שכפול היסטון pre-mRNAs מעבד בקצה 3' מנגנון שונה שבו הוא שיחק תפקיד מפתח על ידי U7 snRNP, שפע נמוך מורכבים בהיקף של snRNA U7 של נוקלאוטידים ~ 60 וחלבונים מספר²^,³ . U7 snRNA בסיסי זוגות עם רצף מסוים היסטון pre-mRNA, לאחד subunits ש....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת הרקע

הערה: מצעים RNA קצרים יותר מאשר נוקלאוטידים ~ 65 יכול להיות מסונתז כימית עם ביוטין (B) והמקשר צילום-cleavable (pc) (המכונה יחד ביוטין צילום-cleavable או pcB) covalently המצורפת לקצה RNA 5' (תצורתציס ). מצעים RNA המכיל אתרי קישור באופן משמעותי יותר צריך להיות שנוצר במבחנה על ידי שעתוק T7 (או SP6), לאחר מכן annealed כדי oligonucleotide מתאם משלימים קצר המכיל pcB moiety בקצה 5' (טרנס תצורת) (איור 1).

אתרי קישור בהיקף של פחות מ 65 ~ נוקלאוטידים, להשתמש יצרן מסחרי (טבלה של חומרים) לסנתז כימית RNA עניין עם מעגלים מודפסים covalently המצורפת לקצה RNA 5'....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השיטה • UV-תנאי נבדקה יחד עם שני מצעים RNA מסונתז כימית covalently מצורף בקצה 5' pcB moiety (תצורתציס ): pcB-SL (איור 1) ו- pcB-dH3/5 מ' RNAs (איור 2). 31-נוקלאוטיד pcB-SL RNA מכיל מבנה גזע לופ ואחריו זנב תקועים 5-נוקלאוטיד יחיד והוא רצף שלו זהה 3' סוף היסטון בוגרת mRNA (כלומר., לאחר המחשוף של היסטון pre-mRNA מאת U7 snRNP). רצף ייחודי זה הוא אתר איגוד ידוע עבור שני חלבונים נוכח השבר cytoplasmic יונקים: SLBP ו- 3.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השיטה המתוארת כאן היא פשוטה וחוץ שילוב מקשר צילום-cleavable, השלב • UV-תנאי אינו נבדל מן השיטות הנפוצות לנצל מאוד חזקה האינטראקציה בין ביוטין streptavidin. הצעד • UV-תנאי יעילה מאוד, בדרך כלל שחרור יותר מ-75 אחוזים הרנ א קיבוע ומקושרת מהחלבונים streptavidin חרוזים, כשמאחוריו רקע גבוה של חלבונים הלא ספציפית לאגד החרוזים. על ידי ביטול על רקע זה, הצעד • UV-תנאי התשואות מתאימים לניתוח ישיר להפליא טהור דוגמאות על ידי צביעת כסף, ספקטרומטר מסה מבחני פונקציונלי.

כתוצאה המערבים של שלבים מעטים ופשוטים י.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים העמיתים שלנו, משתפי פעולה על תרומתם לעבודה שלנו. מחקר זה נתמך על ידי NIH להעניק GM 29832.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
Streptavidin-Agarose	Sigma	S1638-5ML
מנורת UV בעוצמה גבוהה גל ארוך	Cole-Parmer	UX-97600-00
נורה חלופית	Cole-Parmer	UX-97600-19	100 וואט כספית H44GS-100M נורת הפולטת 366 ננומטר אור UV (סילבניה)
RNA ואוליגונוקלאוטידים המכילים ביוטין ומקשר הניתן לצילום ב-cis	Dharmacon (Lafayette, CO) או Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA)		Requst a quote in Dharmacon
Beckman GH 3.8 רוטור דלי נדנדה	Beckman
RiboMAX מערכות ייצור RNA בקנה מידה גדול (פולימראז T7)	Promega	P1300
RiboMAX מערכות ייצור RNA בקנה מידה גדול (פולימראז SP6)	ערכת	P1280
Pierce	תרמו-פישר סיינטיפיק	24612

כתמי כסף Promega

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mandel, C. R., Bai, Y., Tong, L. Protein factors in pre-mRNA 3'-end processing. Cellular and Molecular Life Sciences. 65 (7-8), 1099-1122 (2008).
Dominski, Z., Carpousis, A. J., Clouet-d'Orval, B.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

צעד אחר צעד טיהור של מתחמי Macromolecular בעזרת RNA המצורפת ביוטין, מקשר צילום-cleavable

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles