Method Article

שימוש משלים של טכניקות מיקרוסקופיים וקריאה פלואורסצנטית ללמוד קריפטוקוקוס-אמבה אינטראקציות

DOI:

10.3791/58698

⸱

June 22nd, 2019

 , 
1Department of Microbial, Biochemical and Food Biotechnology, University of the Free State

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נייר זה מפרט פרוטוקול להכנת תרבות שיתוף של תאים cryptococcal ו אמבות כי הוא למד באמצעות עדיין, תמונות פלורסנט ברזולוציה גבוהה שידור תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים. מומחש כאן היא הדרך שבה נתונים כמותיים יכולים להשלים מידע איכותי כזה.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי לדמות זיהום קריפטוקוקוס , אמבה, אשר הוא טורף טבעי של תאים cryptococcal בסביבה, יכול לשמש כמודל עבור מקרופאגים. זה אורגניזם טורף, דומה מקרופאגים, מעסיקה phagocyציטוזה כדי להרוג תאים הפנימו. בעזרתו של מיקרוסקופ לייזר ממוקד סריקה, תמונות המתארים רגעים אינטראקטיביים בין תאים cryptococcal ו אמבה נלכדים. הכוח החלטה של מיקרוסקופ אלקטרון גם מסייע לחשוף את הפרטים בדיקת אולטרה מבנית של תאים cryptococcal כאשר לכודים בתוך מזון אמבה ולאחר. מאז phagocyציטוזה הוא תהליך רציף, נתונים כמותיים משולבים אז בניתוח כדי להסביר מה קורה בנקודת הזמן כאשר התמונה נלכדה. כדי להיות ספציפיים, יחידות הזריחה יחסית נקראים על מנת לכמת את היעילות של אמבה הפנמה תאים cryptococcal. למטרה זו, תאים cryptococcal מוכתמים בצבע שהופך אותם זרוח פעם לכודים בתוך הסביבה החומצית של המזון ולבולית. כאשר נעשה שימוש יחד, מידע שנאסף באמצעות טכניקות כאלה יכול לספק מידע קריטי כדי לעזור להסיק מסקנות על ההתנהגות ועל גורלם של תאים כאשר הפנפו על ידי אמבה, ואולי, על ידי תאי phagocytic אחרים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

החיידקים התפתחו לאורך זמן כדי לכבוש ולשגשג נישות אקולוגיות שונות כגון הגבולות הפיזיים פתוח של הקרקע והמים, בין היתר1. בגומחות אלה, חיידקים לעתים קרובות לעסוק בתחרות ישירה עבור משאבים מוגבלים; חשוב מכך, עבור חומרים מזינים שהם משתמשים בהם לתמיכה בצמיחה או במרחב שלהם, שהם צריכים להתאים לאוכלוסיה המתרחבת2,3. במקרים מסוימים, כמה אורגניזמים הולואיקון כמו אמבה אולי אפילו קדומים על התאים cryptococcal כדרך לחילוץ חומרים מזינים מתוך ביומסה שלהם4,5. בתורו, זה מאפשר אורגניזמים כאלה להקים שליטה טריטוריאלית באמצעות שליטה על מספר האוכלוסייה של....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הצפנת קריפטוקוקוס וכמה זנים קסטאנימה של הקואקאז נחשבים ברמה אבטחה טיחות 2 (bsl-2) פתוגנים; לכן, החוקרים חייבים לנקוט אמצעי זהירות נאותים כאשר עובדים עם אורגניזמים אלה. לדוגמה, על אנשי המעבדה להיות בעלי הכשרה מסוימת וציוד הגנה אישי (PPE) כגון מעילי מעבדה, כפפות והגנת עיניים. יש להשתמש בקבינט בטיחות ביולוגית (רמה 2) להליכים שעלולים לגרום לזיהום14.

1. טיפוח וסטנדרטיזציה של תאים פטרייתיים (השתנה ממדדו ואח ' 15 )

  1. החוצה את מבחן הזנים פטרייתי (כלומר, ג. neoformans Uofs Y-1378 ו -c. neoformans lmpe 046) מתרבויות מניות (לא יותר מ 9 חודשים) על שמרים-peptone-....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חיידקים הם אורגניזמים מיקרוסקופיים שאי אפשר להיתפס עם עין בעירום. עם זאת, ההשפעה שלהם עלולה לגרום למחלות קליניות מובנת, כגון דלקות עור. כאשר לומדים היבטים מסוימים של חיידקים, החל מורפולוגיה שלהם, תוצרי לוואי ואינטראקציות, להיות מסוגל לספק ראיות ציורית ווידאו הוא בעל חשיבות עליונה.

אנחנו הראשונים שחיפשנו לדמיין את האינטראקציה בין תאים cryptococcal ו אמבה. למטרה זו, תמונות בשדה בהיר שהראה 2 שיתוף התאים שכונתיות נחקרו הראשון. תמונה.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעיתון, טכניקות שונות המועסקים בהצלחה כדי לחשוף את התוצאה האפשרית שעלולים להתעורר כאשר אמבה אינטראקציה עם תאים cryptococcal. כמו כן, היינו מעוניינים להראות את ההשפעות של חומצות שומן 3-הידרורוקסי על התוצאה של אינטראקציות של הקריפטוקוקוס-אמבה.

הטכניקה הראשונה שהייתה בשימוש היתה מיקרוסקופית מוקד, אשר הייתה עדיין בתמונות. החיסרון העיקרי של טכניקה זו היה כי זה נתן לנו רק מידע כי הוא מוגבל לנקודת זמן מסוימת. כל מסקנה שיכולה להיות מצוירת על בסיס התוצאות משאיל את עצמה לחשיבה אינדוקטיבית, שבה .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

העבודה נתמכת על ידי מענק מקרן המחקר הלאומי של דרום אפריקה (מספר המענק: UID 87903) והאוניברסיטה של המדינה החופשית. אנו גם אסירי תודה לשירותים ולסיוע המוצעים על ידי פיטר ואן ווינק והנלי גרובלר במהלך לימודי המיקרוסקופיה שלנו.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,4-Diazabicyclo-[2.2.2]-אוקטןSigma-AldrichD27802-1.5-mL
צינור פלסטיק תרמו פישר סיינטיפיק69715-15-מ
"ל צינור צנטריפוגה תרמו פישר סיינטיפיק7252018-50
מ"ל צינור צנטריפוגה Thermo Fisher Scientific
1132017-8-Well מגלשת תאThermo Fisher Scientific1109650-Acetone
Merck
SAAR1022040LC-Amoeba זןATCCÒ 30234TM-
ATCC בינוני 712ATCCÒ 712TMאמבה בינונית
שחורה 96 בארות צלחת מיקרוטיטרתרמו פישר סיינטיפיק
152089-צנטריפוגההרמל--
כלורופורםסיגמא-אולדריץ'C2432-מיקרוסקופ
קונפוקליניקון ניקון TE 2000-שרף
אפוקסי:
[1] NSA[1], ALS[1], R1054-
[2], DER 736[2], ALS[2], R1073-
[3], שרף ERL Y221[3], ALS[3], R1047R-
[4], S1 (2-דימתיל-אמינו-אתנול)[4] ALS [4] R1067-פלואורסצאין
איזותיוציאנטסיגמא-אולדריץ'F4274-חומצה
פורמיתסיגמא-אולדריץ'
489441-פלואורוסקן אסנס FLתרמו פישר מדעי374-91038Cקורא מיקרופלייט
גלוקוזסיגמא-אולדריץ'G8270-גלוטראלדהיד
ALSR1009-
המוציטומטרBoeco-
ציטראט עופרתALSR1209-כרומטוגרפיה
נוזלית ספקטרומטר מסהתרמו פישרמדעי-מתנול
סיגמא-אולדריץ'R 34,860-שייקר
אורביטליLasec --
אוסמיום טטרוקסידALSR1015-pHrodo
Green Zymosan A BioParticlesLife TechnologiesP35365זהו הצבע הרגיש ל-pH
תמיסת חיץ פיזיולוגיתSigma-AldrichP4417-50TAB-שייקר
סיבוביLabcon--
מאגר נתרן פוספט:
[1] די-נתרן מימן אורתופוספט דיהידרט [1] Merck[1] 106580-
[2] נתרן די-מימן אורתופוספט דיהידרט[2] Merck [2] 106345
מיקרוסקופ אלקטרונים שידורפיליפספיליפס EM 100 -
טריפן כחול Sigma-AldrichT8154-Ultramicrotome
LeicaEM UC7-אורניל
אצטטALSR1260A-מייבש
ואקום Lasec --
VialSigma-Aldrich29651-U-YNB
Lasec 239210-YPD
אגרסיגמא-אולדריץ'Y-1500-

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Barton, L. L., Northup, D. E. Microbial Ecology. , Wiley-Blackwell. New Jersey. (2011).
  2. Hunter, P. Entente cordiale: multiple symbiosis illustrates the intricate interconnectivity of nature. EMBO Reports. 7, 861-864 (2006).
  3. Comolli, L. R.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cryptococcus Amoeba InteractionsConfocal MicroscopyTransmission Electron MicroscopyPhagocytosis AssayFluorescence ReadingpHrodo StainingFungal Cell CultureAmoeba ViabilityCo culture PreparationUltrastructural Analysis

Related Articles