נייר זה מפרט פרוטוקול להכנת תרבות שיתוף של תאים cryptococcal ו אמבות כי הוא למד באמצעות עדיין, תמונות פלורסנט ברזולוציה גבוהה שידור תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים. מומחש כאן היא הדרך שבה נתונים כמותיים יכולים להשלים מידע איכותי כזה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
שימוש משלים של טכניקות מיקרוסקופיים וקריאה פלואורסצנטית ללמוד קריפטוקוקוס-אמבה אינטראקציות
במאמר זה
סיכום
תקציר
כדי לדמות זיהום קריפטוקוקוס , אמבה, אשר הוא טורף טבעי של תאים cryptococcal בסביבה, יכול לשמש כמודל עבור מקרופאגים. זה אורגניזם טורף, דומה מקרופאגים, מעסיקה phagocyציטוזה כדי להרוג תאים הפנימו. בעזרתו של מיקרוסקופ לייזר ממוקד סריקה, תמונות המתארים רגעים אינטראקטיביים בין תאים cryptococcal ו אמבה נלכדים. הכוח החלטה של מיקרוסקופ אלקטרון גם מסייע לחשוף את הפרטים בדיקת אולטרה מבנית של תאים cryptococcal כאשר לכודים בתוך מזון אמבה ולאחר. מאז phagocyציטוזה הוא תהליך רציף, נתונים כמותיים משולבים אז בניתוח כדי להסביר מה קורה בנקודת הזמן כאשר התמונה נלכדה. כדי להיות ספציפיים, יחידות הזריחה יחסית נקראים על מנת לכמת את היעילות של אמבה הפנמה תאים cryptococcal. למטרה זו, תאים cryptococcal מוכתמים בצבע שהופך אותם זרוח פעם לכודים בתוך הסביבה החומצית של המזון ולבולית. כאשר נעשה שימוש יחד, מידע שנאסף באמצעות טכניקות כאלה יכול לספק מידע קריטי כדי לעזור להסיק מסקנות על ההתנהגות ועל גורלם של תאים כאשר הפנפו על ידי אמבה, ואולי, על ידי תאי phagocytic אחרים.
מבוא
החיידקים התפתחו לאורך זמן כדי לכבוש ולשגשג נישות אקולוגיות שונות כגון הגבולות הפיזיים פתוח של הקרקע והמים, בין היתר1. בגומחות אלה, חיידקים לעתים קרובות לעסוק בתחרות ישירה עבור משאבים מוגבלים; חשוב מכך, עבור חומרים מזינים שהם משתמשים בהם לתמיכה בצמיחה או במרחב שלהם, שהם צריכים להתאים לאוכלוסיה המתרחבת2,3. במקרים מסוימים, כמה אורגניזמים הולואיקון כמו אמבה אולי אפילו קדומים על התאים cryptococcal כדרך לחילוץ חומרים מזינים מתוך ביומסה שלהם4,5. בתורו, זה מאפשר אורגניזמים כאלה להקים שליטה טריטוריאלית באמצעות שליטה על מספר האוכלוסייה של....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הצפנת קריפטוקוקוס וכמה זנים קסטאנימה של הקואקאז נחשבים ברמה אבטחה טיחות 2 (bsl-2) פתוגנים; לכן, החוקרים חייבים לנקוט אמצעי זהירות נאותים כאשר עובדים עם אורגניזמים אלה. לדוגמה, על אנשי המעבדה להיות בעלי הכשרה מסוימת וציוד הגנה אישי (PPE) כגון מעילי מעבדה, כפפות והגנת עיניים. יש להשתמש בקבינט בטיחות ביולוגית (רמה 2) להליכים שעלולים לגרום לזיהום14.
1. טיפוח וסטנדרטיזציה של תאים פטרייתיים (השתנה ממדדו ואח ' 15 )
- החוצה את מבחן הזנים פטרייתי (כלומר, ג. neoformans Uofs Y-1378 ו -c. neoformans lmpe 046) מתרבויות מניות (לא יותר מ 9 חודשים) על שמרים-peptone-....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
חיידקים הם אורגניזמים מיקרוסקופיים שאי אפשר להיתפס עם עין בעירום. עם זאת, ההשפעה שלהם עלולה לגרום למחלות קליניות מובנת, כגון דלקות עור. כאשר לומדים היבטים מסוימים של חיידקים, החל מורפולוגיה שלהם, תוצרי לוואי ואינטראקציות, להיות מסוגל לספק ראיות ציורית ווידאו הוא בעל חשיבות עליונה.
אנחנו הראשונים שחיפשנו לדמיין את האינטראקציה בין תאים cryptococcal ו אמבה. למטרה זו, תמונות בשדה בהיר שהראה 2 שיתוף התאים שכונתיות נחקרו הראשון. תמונה.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
בעיתון, טכניקות שונות המועסקים בהצלחה כדי לחשוף את התוצאה האפשרית שעלולים להתעורר כאשר אמבה אינטראקציה עם תאים cryptococcal. כמו כן, היינו מעוניינים להראות את ההשפעות של חומצות שומן 3-הידרורוקסי על התוצאה של אינטראקציות של הקריפטוקוקוס-אמבה.
הטכניקה הראשונה שהייתה בשימוש היתה מיקרוסקופית מוקד, אשר הייתה עדיין בתמונות. החיסרון העיקרי של טכניקה זו היה כי זה נתן לנו רק מידע כי הוא מוגבל לנקודת זמן מסוימת. כל מסקנה שיכולה להיות מצוירת על בסיס התוצאות משאיל את עצמה לחשיבה אינדוקטיבית, שבה .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.
תודות
העבודה נתמכת על ידי מענק מקרן המחקר הלאומי של דרום אפריקה (מספר המענק: UID 87903) והאוניברסיטה של המדינה החופשית. אנו גם אסירי תודה לשירותים ולסיוע המוצעים על ידי פיטר ואן ווינק והנלי גרובלר במהלך לימודי המיקרוסקופיה שלנו.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 1,4-Diazabicyclo-[2.2.2]-אוקטן | Sigma-Aldrich | D27802-1.5-mL | |
| צינור פלסטיק | תרמו פישר סיינטיפיק | 69715-15-מ | |
| "ל צינור צנטריפוגה | תרמו פישר סיינטיפיק | 7252018-50 | |
| מ"ל צינור צנטריפוגה | Thermo Fisher Scientific | ||
| 1132017-8-Well מגלשת תא | Thermo Fisher Scientific | 1109650-Acetone | |
| Merck | |||
| SAAR1022040LC-Amoeba זן | ATCCÒ | 30234TM | - |
| ATCC בינוני 712 | ATCCÒ | 712TM | אמבה בינונית |
| שחורה 96 בארות צלחת מיקרוטיטר | תרמו פישר סיינטיפיק | ||
| 152089-צנטריפוגה | הרמל | - | - |
| כלורופורם | סיגמא-אולדריץ' | C2432-מיקרוסקופ | |
| קונפוקלי | ניקון ניקון TE 2000-שרף | ||
| אפוקסי: | |||
| [1] NSA | [1], ALS | [1], R1054 | - |
| [2], DER 736 | [2], ALS | [2], R1073 | - |
| [3], שרף ERL Y221 | [3], ALS | [3], R1047R | - |
| [4], S1 (2-דימתיל-אמינו-אתנול) | [4] ALS | [4] R1067-פלואורסצאין | |
| איזותיוציאנט | סיגמא-אולדריץ' | F4274-חומצה | |
| פורמית | סיגמא-אולדריץ' | ||
| 489441-פלואורוסקן אסנס FL | תרמו פישר מדעי | 374-91038C | קורא מיקרופלייט |
| גלוקוז | סיגמא-אולדריץ' | G8270-גלוטראלדהיד | |
| ALS | R1009 | - | |
| המוציטומטר | Boeco | - | |
| ציטראט עופרת | ALS | R1209-כרומטוגרפיה | |
| נוזלית ספקטרומטר מסה | תרמו פישר | מדעי-מתנול | |
| סיגמא-אולדריץ' | R 34,860-שייקר | ||
| אורביטלי | Lasec | - | - |
| אוסמיום טטרוקסיד | ALS | R1015-pHrodo | |
| Green Zymosan A BioParticles | Life Technologies | P35365 | זהו הצבע הרגיש ל-pH |
| תמיסת חיץ פיזיולוגית | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB-שייקר | |
| סיבובי | Labcon | - | - |
| מאגר נתרן פוספט: | |||
| [1] די-נתרן מימן אורתופוספט דיהידרט | [1] Merck | [1] 106580 | - |
| [2] נתרן די-מימן אורתופוספט דיהידרט | [2] Merck | [2] 106345 | |
| מיקרוסקופ אלקטרונים שידור | פיליפס | פיליפס EM 100 | - |
| טריפן כחול | Sigma-Aldrich | T8154-Ultramicrotome | |
| Leica | EM UC7-אורניל | ||
| אצטט | ALS | R1260A-מייבש | |
| ואקום Lasec | - | - | |
| Vial | Sigma-Aldrich | 29651-U-YNB | |
| Lasec | 239210-YPD | ||
| אגר | סיגמא-אולדריץ' | Y-1500 | - |
מקורות
- Barton, L. L., Northup, D. E. Microbial Ecology. , Wiley-Blackwell. New Jersey. (2011).
- Hunter, P. Entente cordiale: multiple symbiosis illustrates the intricate interconnectivity of nature. EMBO Reports. 7, 861-864 (2006).
- Comolli, L. R.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
