הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

וזמינותו תחבורה אופסין # רודופסין על ידי ניתוח גבוהה-תוכן הדמיה

5.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/58703

⸱

16 בינואר 2019

 ,  , 
1Department of Ophthalmology, University of Pittsburgh, 2McGowan Institute for Regenerative Medicine, University of Pittsburgh

במאמר זה

סיכום

כאן, אנחנו תיאר שיטה הדמיה גבוהה-תוכן לכמת התעבורה של מוטציות אופסין # רודופסין הקשורים עם רטיניטיס פיגמנטוזה. ניתוח התוצאות מרובות באורך הגל שימש לכמת אופסין # רודופסין החלבון על פני התא או את כל התא.

תקציר

אופסין # רודופסין מוטציות misfolding להוביל למוות קולט אור רוד, הבא לידי ביטוי כמו אוטוזומלית דומיננטית רטיניטיס פיגמנטוזה (RP), מתקדמים מסנוור מחלות חסר טיפול יעיל. אנו משערים כי ניתן להקל את cytotoxicity של המוטציה misfolded אופסין # רודופסין על-ידי פרמקולוגית ייצוב החלבון המוטנטי אופסין # רודופסין המוטציה P23H, בין שאר Class II אופסין # רודופסין מוטציות, מקודד חלבון מוטנט יציב מבחינה מבנית אופסין # רודופסין המצטבר בתוך-פלזמית (ER), ואילו אופסין # רודופסין פראי סוג מועבר קרום פלזמה ב מידע יונקים תאים. אנו בעבר ביצע מסך תפוקה גבוהה המבוססת על הפריה חוץ גופית (HTS), זיהה קבוצת מלווים תרופתי הציל הובלת P23H אופסין # רודופסין מ אר אל קרום פלזמה. כאן, אנחנו באמצעות שיטת immunostaining ואחריו ניתוח ההדמיה גבוהה-תוכן, לכמת את כמות חלבון מוטציה אופסין # רודופסין את כל התא ועל קרום פלזמה. בשיטה זו הוא אינפורמטיבי ויעיל לזהות פגיעות נכון מכל תוצאות חיוביות שגויות בעקבות HTS. בנוסף, הניתוח גבוהה-תוכן התמונה אפשרה לנו לכמת פרמטרים מרובים מניסוי יחיד כדי להעריך את תכונות פרמקולוגיות של כל המתחם. שימוש assay הזה, ניתחנו את ההשפעה של תרכובות שונות 11 לכיוון שש המוטציות אופסין # רודופסין RP הקשורים, קבלת פרופיל תרופתי דו-ממדי עבור הבנה כמותיים ואיכותיים ביציבות הקונסטרוקטיבית של המוטנטים האלה אופסין # רודופסין והיעילות של תרכובות שונות כלפי המוטנטים האלה.

מבוא

חלבון misfolding מעורב ב ניוון שרירים, degenerations עצבית, כמו גם מחלות מסנוור, כולל רטיניטיס פיגמנטוזה (RP)1. RP היא תורשתית ומתקדמת ניוון הרשתית המשויך מוטציות בגנים מעל 60 המשפיעים על תפקוד על הומאוסטזיס של רוד photoreceptors או2,epitheliums פיגמנט הרשתית (RPEs)3. אין טיפול יעיל זמין כעת עבור RP. אופסין # רודופסין מוטציות בחשבון כ 25-30% אוטוזומלית דומיננטית (ad) מקרים RP. בין יותר מ-150 אופסין # רודופסין מוטציות4 (האדם גנים מוטציה מסד נתונים, http:/ www.hgmd.cf.ac.uk/), מוטציות Class II לגרום לחוסר יציבות מבנית את החלבון אופסין # רודופסין תורם למוות קולט אור רוד, חזון הפסד5,6,7,8. P23H הוא המוטציה אופסין # רודופסין בתדירות הגבוהה ביותר בצפון אמריקה, שהוא גם דוגמה טיפוסית של9,10מוטציות אופסין # רודופסין Class II. עקב יציבות מבנית, הטבועה שלה אופסין # רודופסין misfolded שנצבר ב רשתית תוך-פלזמית (ER) בתאי יונקים, ואילו אופסין # רודופסין פראי סוג ממוקם על קרום פלזמה5. אופסין # רודופסין P23H המוצגים מוטציה דומיננטית שלילי cytotoxicity ואינו haploinsufficiency, אך קשורה את ההפעלה של ER misfolded קשורה חלבון השפלה מסלול וארגון החיצוני קטע קטע מוט. כדי להקל על מוט מתח התא קולט אור, אסטרטגיה אחת היא לייצב קיפול מקורית של מוטציה אופסין # רודופסין באמצעות מלווה תרופתי.

כדי להשיג מטרה זו, ביצענו עם מסך מבוססי תאים תפוקה גבוהה (HTSs)11,12,13 שימוש assay קומפלמנטציה פרגמנט β-galactosidase לכמת אופסין # רודופסין P23H המוטציה מועבר על מסך הפלזמה ממברנה. פרוטוקול פשוט ועמיד assay HTS זו אפשרה לנו לבחון את הפעילות של מולקולות קטנות בערך 79,000 על כל מסך. עם זאת, מכיוון assay HTS הזה קורא אותות הפריה חוץ גופית, תוצאות חיוביות שגויות, כולל את מעכבי β-גל, תרכובות בצבע או ציטוטוקסיות כלולים ברשימת החיסול מחכה להיות מזוהה על ידי assay המשני.

Immunostaining המסורתי של שיטות הדמיה פלורסצנטיות שימשו במשך שנים ללמוד התעבורה אופסין # רודופסין תאים בתרבית של5,14,15,16. עם זאת, השיטות המקובלת לא ניתן להשתמש כדי לכמת תרופתי אפקטים של יותר מ- 10 תרכובות לכיוון אופסין # רודופסין התחבורה כי ניתוח ההדמיה אמין דורש מספר רב של תמונות לפי תנאי מאוד עקבית, אשר לא amendable על ידי שיטות הדמיה קונבנציונלי. . הנה, פיתחנו פרוטוקול הדמיה של high-תוכן immunostaining מבוסס כמו assay המשני לכמת התעבורה פני שטח התא של אופסין # רודופסין misfolded מוטציות11,13,17. להוספת תווית אופסין # רודופסין על קרום פלזמה, דילגנו השלב של קרום התא permeabilization ו- immunostained המוטנטים אופסין # רודופסין מאת monoclonal (B6-30) נגד אופסין # רודופסין לזהות את epitope N-מסוף של אופסין # רודופסין לצד חוץ-תאי של התא 18. כדי להמחיש את המוטציות אופסין # רודופסין התא כולו, אנחנו התמזגו אופסין # רודופסין עם החלבון זריחה נוגה. מאת כימות של עוצמות קרינה פלואורסצנטית בערוצים שונים פלורסצנטיות, אנו מסוגלים לקבל פרמטרים מרובים מהניסוי בודד אחד, כולל עוצמת אופסין # רודופסין הכולל כל התא, על פני השטח של התא, ואת היחס של אופסין # רודופסין זריחה על פני התא לזה התא כולו. יישום שיטה זו יציב התאים לבטא סכום כולל של 6 misfolded אופסין # רודופסין מוטציות, אנחנו ניתן להפיק פרופיל תרופתי של משגיחים מרובים מולקולה קטנה לכיוון המוטנטים האלה. ב פרוטוקול זה, כל התאים immunostained בצלחת 384-. ובכן, עם תמונה באמצעות מערכת הדמיה אוטומטית בתנאי הדמיה מאוד עקבי. ניתוח התמונה מתבצע כדי כל טוב, המכיל תמונות של יותר מ-600 תאים כדי להפחית וריאציה בשל הטרוגניות התאים עם משתנה צורת התא ורמת ביטוי חלבון. זרימת העבודה של פרוטוקול זה מסוכם באיור1. היתרון של שיטה זו הוא כי אנו משיגים תמונות ברזולוציה גבוהה, כמו גם פרמטר מרובה quantifications מניתוח המבוססת על תמונה. באופן כללי, פרוטוקול זה יכול להיות שונה ומוחלים לכמת את התעבורה של כל חלבון ממברנלי misfolded של עניין.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: אופסין # רודופסין תחבורה וזמינותו.

1. הכנה של התרבות תאים

  1. להחיות את השמורה הקפאה U2OS יציב תאים המבטאים את סוג בר (WT) או בעכבר מוטנט אופסין # רודופסין-ונוס פיוז'ן חלבונים. להפשיר את התאים ב 37 ° C עד רק גבישי קרח קטנים הם עזבו בבקבוקון.
    הערה: התאים U2OS נמצאים בשימוש פרוטוקול זה כי שם אין תור תא קולט אור זמין עבור מחקרים במבחנה , ביוסינטזה ciliary מראש של אופסין # רודופסין מוסדר על ידי המנגנונים המולקולריים דומה בתאי יונקים. בנוסף, התאים U2OS לצרף בחוזקה בתחתית הלוח, ויש גופים תא גדול, אז הם אידיאליים עבור וזמינותו תחבורה אופסין # רודופסין. שבע U2OS יציב תאים המבטאים את WT, T4R, P23H, P53R, C110Y, D190N ו- P267L מוטציות אופסין # רודופסין משמשים כאן כדוגמה להראות את האיכות והאמינות של וזמינותו. תאים יציב מוטאנטים אחרים אופסין # רודופסין או חלבונים אחרים קרום יכול לשמש, בהתאם למטרה של וזמינותו. יציב התאים לבטא אופסין # רודופסין האנושי יכול לשמש assay הזה אם הוא זמין. אופסין # רודופסין העכבר שימש כאן כי העכבר וחלבונים אופסין # רודופסין האנושי לחלוק הומולוגיה 95%, וכן תרכובות המזוהה על-ידי assay הזה יהיה שנבדקו אין ויוו באמצעות מודל adRP של העכבר נושא את המוטציה P23H8אופסין # רודופסין. התאים יציבה נוצרו כפי שתואר לעיל19. WT של מוטציה אופסין # רודופסין התמלילים היו לכמת על ידי q-PCR, השיבוטים של תאים יציב לבטא רמות דומות של WT וגיליון הציונים מוטציה אופסין # רודופסין נבחרו עבור זה וזמינותו. הביטוי של חלבונים אופסין # רודופסין אושר ע י immunoblot ו- immunostaining. המעבר של תאים המשמשים assay הזה צריך להיות נמוך מ- 20.
  2. העברת כל שורה של תאים לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של מדיום הגידול (של גלוקוז גבוהות Dulbecco שונה של הנשר בינוני (DMEM) עם 10% סרום שור עוברית (FBS) ו 5 µg/mL Plasmocin).
  3. Centrifuge הצינור ב 200 x גרם במשך 5 דק. להשליך את תגובת שיקוע, resuspend בגדר תא עם 5 מ של התא מדיום הגידול עבור כל קו תא. העברת כל שורה של השעיה תא לתוך תבשיל תרביות רקמה 60 מ מ, דגירה ב 37 ° C עם 5% CO2.
  4. תת-תרבות התאים כאשר המנה תרביות רקמה מגיע למפגש 90% כפי שמתואר הפניה12.

2. זריעת תאים-תאים 5,000 לכל טוב

הערה: בצע את ההליכים הבאים בשכונה תרביות רקמה.

  1. פנקו את הצלחת עם פולי-ליזין.
    1. יום אחד לפני זריעת תאי, מתייחסים שחור-קיר ונקה את הצלחת התחתונה 384-טוב עם µL 20/טוב של פולי-ליזין פתרון במשך 30 דקות.
    2. וארוקן את הנוזל, לאפשר כל בארות להתייבש במשך ה 1 להחזיר את המכסה צלחת ולאחסן את הצלחת ב 4 ° C בלילה עבור תא זריעה.
  2. להכין את התליה תא.
    1. תרבות כל שורה תא במדיום הגידול בצלחת תרביות רקמה 100 מ מ עד 90% הנהרות.
    2. לשטוף כל מנה עם פוספט buffered תמיסת מלח (PBS) ולנתק את התאים עם 1 מ"ל של 0.05% טריפסין ב 37 º C.
    3. Resuspend כל שורה של תאים ב- 10 מ"ל assay בינוני (DMEM high-גלוקוז 10% FBS, 100 יחידות/mL פניצילין, סטרפטומיצין μg/מ ל).
    4. לספור את התאים, לדלל כל שורת התאים עד 1.25 x 105 תאים למ"ל עם המדיום וזמינותו.
  3. הזרע התאים.
    1. להשתמש על פיפטה רב-ערוצי אלקטרונית או מתקן מגיב אוטומטית כדי לוותר על µL 40/טוב של התליה תא כדי שלוש עמודות לכל תא קו ומילוי עמודות 1-21 של צלחת 384-טוב (איור 2).
    2. להוסיף µL 40/טוב של U2OS (P23H-אופסין # רודופסין-ונוס) עמודים 22-23, µL 40/טוב של U2OS (אופסין # רודופסין-ונוס) לעמודה 24, כפי שולטת.
    3. Centrifuge את הצלחת ב x 300 גרם ל 30 s כדי להפיל את כל התאים לחלק התחתון של הלוח 384-. טוב.
      הערה: למנוע זעזועים פיזיים לצלחת לאחר תא זריעה. אחרת, התאים תימחץ בפינה אחת של כל טוב, הצלחת לא יהיה מתאים עבור הדמיה גבוהה-תוכן.
    4. דגירה לצלחת 384-ובכן ב 37 ° C עם 5% CO2 עבור h 3 עבור התאים לצרף תחתית הצלחת.

3. טיפול תאי עם תרכובות

  1. צור מפת צלחת עם תנאי הטיפול כפי שמוצג באיור2.
  2. להכין µL 300 של 5 x פתרונות עבודה של עד 15 תרכובות בצלחת 96-ובכן.
    1. לדלל cps 1 עד 15 עם המדיום assay כדי חמש פעמים של ריכוזים הסופי שלהם בבארות A1 ל G2 של 96-ובכן צלחת (איור 2 א). להוסיף 300 µL assay בינוני באזור H2 היטב.
      הערה: הריכוז הסופי של כל המתחם משמש-הריכוז היעיל ביותר שהצלת הובלת אופסין # רודופסין P23H12,HTS13.
    2. להוסיף µL 100 לכל טוב של 2% דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) ו- 25 מיקרומטר 9 -cis-רשתית כי הם מעורבבת עם המדיום assay לעמודות 11 ו- 12, בהתאמה. להוסיף 9 -cis-רשתית באור עמום.
  3. הוספת µL 10 לכל טוב של 5 x עובד פתרונות לצלחת 384-ובכן תרבותי עם תאי (איור 2B).
    1. להשתמש על פיפטה רב ערוצית אלקטרונית כדי להוסיף תרכובות 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 ו- 15 שורות A, C, E, G, אני, K, M ו- O מעמודות 1 עד 21 (איור 2). להוסיף תרכובות 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 ו- M שורות B, D, F, H, J, L, N ו- P מעמודות 1 עד 21.
    2. להוסיף 10 µL לכל טוב של 2% דימתיל סולפוקסיד עמודות 22 ו-24. להוסיף 10 µL לכל טוב של מיקרומטר 25 9 -cis-רשתית לעמודה 23.
      הערה: דימתיל סולפוקסיד משמש כפקד הרכב כי כל תרכובות הם בתחילה מומס דימתיל סולפוקסיד מניות. טור 22 המכיל תאים דימתיל סולפוקסיד מטופלים לבטא את P23H אופסין # רודופסין משמש את הפקד 0%. 9 -Cis-תאים ברשתית שטופלו לבטא את אופסין # רודופסין P23H משמש את הפקד 100%.
  4. מכסה את הצלחת 384-היטב ברדיד אלומיניום, דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה.

4. Immunostaining ללא קרום Permeabilization כתם אופסין # רודופסין החלבון על פני התא.

הערה: להימנע חומרי ניקוי בתהליך כולו immunostaining לשמור על קרום התא ללא פגע.

  1. להכין 4% paraformaldehyde (PFA) על ידי דילול של 16% מחברים עם PBS על יחס נפח של 1:4 בשכונה fume כימי. העברה של % 4 מחברים מאגר מגיב.
  2. להוציא לצלחת 384-ובכן בחדר חשוך עם האור האדום העמום. שימוש ערוץ 8 ליניקת מחובר בקבוק ואקום אוסף לרוקן בעדינות את המדיום. להשתמש על פיפטה רב-ערוצי אלקטרונית כדי להוסיף µL 20 לכל טוב של טריות 4% PFA לצלחת 384-ובכן כולו דגירה במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. כדי למנוע ניתוק התא, תמיד הצבע קצות העצמות באותו הצד של כל טוב במהלך שאיפות. אל תגעו האזור התחתון האמצעי של כל טוב. בעת לקיחת תמונות, בחר את השדות כדי למנוע את האזור נגע העצמות. עבור incubations יותר מ- 10 דקות, לכסות את הצלחת 384-ובכן עם המכסה שלה כדי למנוע התאיידות.
    הערה: תאים קבועים בחדר חשוך כדי להימנע photobleaching של isorhodopsin regenerated ישפיעו על התוצאה של פקד ה-100%. לאחר קיבוע, ניתן לקחת את הצלחת. ובכן 384 תאורה רגילה.
  3. השתמש העצמות של ערוץ 8 וארוקן את כדורגלן היטב כל ולהשתמש על פיפטה רב ערוצית אלקטרונית כדי להוסיף μL 50 לכל טוב של PBS. חזור עוד פעמיים כדי לבצע שלושה שוטף עם PBS.
    התראה: הפסולת PFA המכיל נוזל נאספים בבקבוק רצ'ט, היא להיות מסולק כפסולת כימיים מסוכנים לאחר הניסוי.
  4. לחסום את התאים על-ידי הוספת µL 20 לכל טוב של סרום עיזים 5% הצלחת 384-ובכן, דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
  5. וארוקן את הנסיוב עיזים 5% ולהוסיף µL 15 לכל טוב של 20 µg מ ל-1 B6-30 נוגדן אנטי אופסין # רודופסין בנסיוב עז 1% שורות A או להוסיף 15 µL לכל טוב של 1% נסיוב עז שורה P עבור קבוצת הביקורת נוגדן בלבד משני.
  6. דגירה את הצלחת 384-ובכן בטמפרטורת החדר במשך 90 דקות או ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. מכסים את הצלחת 384-היטב ברדיד אלומיניום, כדי למנוע photobleaching של fluorophores.
  7. לשטוף את הצלחת 3 פעמים עם 50 µL לכל טוב של PBS.
  8. האחות PBS ולהוסיף µL 15 לכל טוב של 5 µg מ ל-1 עז Cy3 מצומדת אנטי-העכבר IgG נוגדן. מכסה את הצלחת 384-היטב ברדיד אלומיניום, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 1 h או ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  9. לשטוף את הצלחת 3 פעמים עם 50 µL לכל טוב של PBS. הוסף µL 50 לכל טוב של PBS המכיל 1 µg מ ל-1 Hoechst 33342 כתם גרעינים בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
  10. חותם את הצלחת 384-ובכן עם סרט שקוף לפני הדמיה. לכסות את הצלחת 384-היטב ברדיד אלומיניום ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס במשך שבוע, אם תמונות נלקחים באופן מיידי.

5. הדמיה.

הערה: הליך הדמיה גבוהה-תוכן זה מותאם למערכת הדמיה המופיעים בטבלה של חומר. הליכים יכול להיות שונה אם באמצעות מערכות הדמיה אחרות גבוהה-תוכן.

  1. הסר את המכסה, מכניסים את הצלחת 384-ובכן םלצה גבוהה-תוכן עם A1 ממוקם בפינה השמאלית העליונה של הצלחת.
  2. פתח את התוכנה רכישת התמונה כדי להגדיר את הפרמטרים עבור ייבוא תמונות.
    1. פתח חלון הגדרת רכישת צלחת, ליצור הגדרה חדשה או לטעון את קובץ ההתקנה קיים.
    2. בחר את המטרה 20 x והגדר להגדיר פיקסל binning כ- 2 כך גודל פיקסל מכוילת הוא 0.80 x 0.80 מיקרומטר. הקווים סריקה 2,000, את גודל התמונה (W x H) 1,000 x 1000 פיקסלים (800.00 x 800.00 מיקרומטר) לכל אתר.
    3. בחר את סוג הצלחת לדימות. השתמש במידע המסופקים על ידי היצרן של צלחת 384-טוב כדי למלא את הממדים צלחת.
    4. בחר הבארות לדימות עבור לוח 384-. טוב.
    5. בחר ארבעה אתרים לדימות לכל טוב. למנוע את הצד של נגע היטב על ידי העצות השאיפה.
    6. בחר עירור לייזרים 405, 488, 561 ננומטר. בחר פליטה מסננים עבור ערוצי דאפי, FITC ואדום טקסס. למטב את עוצמת הלייזר, רווחים של כל ערוץ כדי להבטיח את הבהירות של תמונות שנלקחו הבארות בקרה חיובית פחות לסף רוויה.
    7. בחר טוב-כדי-טוב מוקד פוקוס אוטומטי. בחר את הבאר הראשונה לרכוש כ הראשונית טוב למציאת דגימות. הגדר אתר פוקוס אוטומטי לכל האתרים.
    8. בחר 4 ממוצעים לכל שורה לכל ערוץ. למטב את ערך היסט ה-Z לכל ערוץ.
    9. מבחן 2-3 בארות בפינות אלכסוני של צלחת טוב 384 כדי לוודא שהתמונות הן על המוקד עבור כל בארות שנבדקו, תמונות מכל אתרי לכל טוב יש תאים עם יותר מ- 40% הנהרות, ועוצמות קרינה פלואורסצנטית של כל הערוצים כמחצית רוויים 100% לשלוט בארות.
    10. שמור את שיטת רכישת התמונה.
  3. הפעל את הצלחת כולה. Watch םלצה עד שהוא מסיים לכידת תמונות מהעמודה הראשונה של צלחת לבדוק את איכות התמונה לפני שעזב םלצה. להוציא לצלחת 384-ובכן ולאחסן ב 4 ° C לשימוש עתידי.
    הערה: בהתאם למספר אתרים שנבחרו לפי טוב, הערוצים נלקח, אורכת 40 דקות 3 h לסיים הדמיה לוח 384-טוב אחד.

6. תמונות ניתוח.

  1. משוך החוצה את נתוני התמונה באמצעות תוכנת ניתוח גבוהה-תוכן התמונה. בחר באחת הבארות 100% שליטה (עמודה 23) כדי להגדיר את הפרמטרים.
  2. בחר את אורך הגל רב תא הבקיע כמו שיטת הניתוח ולהתחיל קביעת התצורה של הגדרות.
    1. הגדר את הגרעינים באמצעות תמונות מערוץ דאפי. הצג בתצוגה מקדימה כדי לוודא גרעין מוגדר הצורות בפריט הנבחר טוב משתלב היטב התמונות גרעינים.
    2. להגדיר את הצורה של התא בערוץ FITC איפה אופסין # רודופסין-ונוס עם תמונה.
    3. הגדרת האזורים הכתם פני שטח התא אופסין # רודופסין בערוץ טקסס אדום.
    4. בדיקת האלגוריתם הנוכחי בבארות 5 כדי לקבוע אם ההגדרות מיטביות. לשמור את ההגדרות ולסגור את החלון תצורה .
  3. הפעל את כל הבארות עם שיטת הניתוח ממוטבת.
  4. לייצא אובייקט מספר הנייד ללא פגע. לייצא את העוצמה הממוצעת של הערוץ FITC עוצמת אופסין # רודופסין-נוגה (ונוס אופסין # רודופסין-INT). לייצא בעוצמה ממוצעת של הערוץ האדום טקסס אופסין # רודופסין בעוצמה על פני התא (INT אופסין # רודופסין על פני התא).
  5. לפתוח את הנתונים המיוצאים תוכנת הגיליון האלקטרוני. מתחלק עוצמת אופסין # רודופסין על פני התא אופסין # רודופסין-ונוס INT כמו יחס MEM-כדי-סיכום. לחשב את Z'-גורמים לכל פרמטר להעריך את איכות וזמינותו. Z′ = 1−3X (STD100% שליטה+סטיית תקן0% שליטה) / | זאת אומרת100% שליטה−Mean0% שליטה|.
    הערה: Z'-מקדם גבוה יותר מאשר 0 מציין assay מתון מספיק עבור מסך גבוהה-תוכן, ו- Z' פקטור בטווח של 0.5 עד 1 מרמז על assay מצטיינים הדרושים עבור תפוקה גבוהה מסך20,21.
  6. להשתמש את תוכנת הגיליון האלקטרוני כדי ליצור מפת החום שני צבעים עבור כל פרמטר. לארגן את השם של שורות תאים בציר ה-x ואת תרכובות בציר ה-y.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

אנחנו מאופיין התעבורה אופסין # רודופסין עם שלושה פרמטרים: עוצמת אופסין # רודופסין-ונוס התא כולו (INT אופסין # רודופסין-ונוס), את עוצמת immunostaining של אופסין # רודופסין על קרום פלזמה (INT אופסין # רודופסין על פני התא), ואת היחס של אופסין # רודופסין כתם על פני התא כדי אופסין # רודופסין-ונוס בעוצמה התא כולו (MEM-סיכום יחס). תוצאה נציג של אופסין # רודופסין תחבורה וזמינותו מוצג איור 3 ו- 4 איור. באמצעות דימתיל סולפוקסיד ו- 9 -c...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

. הראנו assay הדמיה של high-תוכן המשמש אפיון בנפילות שאותרו מן HTS. אוטומציה היחידה מעורב פרוטוקולים אלה הוא הצלם גבוה-תוכן. Immunostaining ואת פלורסצנטיות הדמיה של אופסין # רודופסין היו בשימוש נפוץ לאפיין הלוקליזציה של אופסין # רודופסין5,14,15,16. עם זאת, כימות של תמונות שצולמו על ידי שיטות הדמיה מוגבל על ידי חוסר של תמונות תא מספיקות לכל מצב, קיבולת נמוכה של תמונות לכל ניסוי, ואת חוסר פרמטר ב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

אנו מודים ד ר מארק אי Schurdak, גילוי תרופות אוניברסיטת פיטסבורג מכון למתן imager גבוהה-תוכן והדרכה ראשונית. ד ר קז'ישטוף Palczewski (Case Western Reserve University) משותף בנדיבות את 4 1D ונוגדנים אנטי אופסין # רודופסין B630. פלסמיד המכיל את cDNA של העכבר אופסין # רודופסין-ונוס לבנות היה משותף על ידי ד ר נבין למברט (אוניברסיטת Augusta). עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי של בריאות גרנט EY024992 שיקו לוי, P30EY008098 של אוניברסיטת פיטסבורג החזון לחקר הליבה גרנט.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תאי U2OS (רודופסין-ונוס)NANA תאים יציבים שנוצרו מתאי U2OS
(T4R-rhodopsin-Venus) NAתאים יציבים שנוצרו מתאי U2OS
(P23H-rhodopsin-Venus) NA תאים יציבים שנוצרו מתאי U2OS (P53R-rhodopsin-Venus)תאים יציבים שנוצרו מתאי U2OS
(P53R-rhodopsin-Venus) NAתאים יציבים שנוצרו מתאי U2OS
תאי U2OS (C110Y-rhodopsin-Venus) NANA תאים יציבים הנוצרים מתאי U2OS
(D190N-rhodopsin-Venus) NAתאים יציבים הנוצרים מתאי U2OS
(P267L-rhodopsin-Venus) תאיםNA תאים יציבים הנוצרים מתאי U2OS
DMEM גלוקוז גבוהGenesee Scientific25-500עם L-גלוטמין, נתרן
סרום בקר עוברי פירובט (FBS)Gibco16140071פלסמוצין מומת בחום
InvivoGenant-mptמגיב חיסול מיקופלזמה
פניצילין-סטרפטומיצין (100X)Gibco15140122100X תמיסות אנטיביוטיות מרוכזות למניעת זיהום חיידקים של תרביות תאים
Trypsin-EDTAGenesee Scientific25-5100.25%, 1mM EDTA ב-HBSS ללא סידן ומגנזיום
תמיסת פולי-L-ליזיןSigma-AldrichP4707-50MLMol wt 70,000-150,000, 0.01%, מסונן סטרילי, BioReagent, מתאים לתרבית תאים
CellCarrier-384 Ultra MicroplatesPerkinElmer6057300384 בארות מיקרו-פלטות שטופלו בתרבית רקמות עם דפנות באר שחורות ותחתית אולפין מחזורית שקופה אופטית להדמיית תאים בניתוח
תכולה גבוההצלחת סטרילית של 96 בארותEppendorf30730119תרבית רקמות שטופלה בתחתית שטוחה של מכסה, סטרילית, ללא פירוגנים הניתנים לזיהוי, Rnase, DNase ו-DNA. לא ציטוטוקסי
פוספט בופר סאילין (PBS)InvitrogenAM962510 x PBS Buffer, pH 7.4
DMSOSigma-AldrichD4540>99.5%, נבדק תרבית תאים
9-cis-retinalSigma-AldrichR5754
תרכובות נבדקוSelleckchem/Life Chemicals/תרכובות NA מסונתזות בהתאמה אישיתנרכשו מ ספקים שונים או
נוגדן B6-30 אנטי-רודופסיןNovusNBP2-25160מתנה מד"ר קז'ישטוף פלצ'בסקי
Cy3-מצומד עז אנטי-עכבר נוגדן משניImmunoResearch Laboratories, Inc115-165-146
16% פרפורמלדהידתרמו פישר סיינטיפיק28908ללא מתנול
10% תרמו סרום עיזים רגיל Fisher Scientific50062Zמאגר חוסם
Hoechst 33342, TrihydrochInvitrogenH3570תמיסת צביעה גרעינית
הדמיה בעלת תוכן גבוהמכשירים מולקולרייםImageXpressImageXpress® מערכת הדמיה מיקרו קונפוקלית בעלת תוכן גבוה
MetaXpress תוכנה לרכישה וניתוח של תמונות בתוכן גבוהMetaXpressתוכנה לרכישה וניתוח של תמונות בתוכן גבוה
פיפטה רב-ערוצית (0.5-10 ומיקרו; L)Rainin17013802פיפטה ידנית 8 ערוצים, 0.5-10 ומיקרו; L
פיפטה רב ערוצית (0.5-10cRainin17013805פיפטה ידנית 8 ערוצים, 20-200 ומיקרו; L
פיפטה רב-ערוצית אלקטרונית (10-200 μ L)Thermo Scientific14-3879-56BTפיפטה מולטי-צ'אננל אלקטרונית למשימות פיפטינג מיקרופלייט 96 ו-384 בארות
50 מ"ל מאגר ריאגנטיםGenesee Scientific28-125ריאגנט ריאגנט לחלוקת פיפטה רב-ערוצית
ערוצים שואב ABCScientificEV503מתאם נירוסטה 8 ערוצים לשאיבת נוזלים מ-96 או 384 בארות צלחות
Excel תוכנת גיליון אלקטרוניMicrosoftExcel2016תוכנת הגיליון האלקטרוני לניתוח נתונים ויצירת מפות חום
Origin2018 תוכנת ניתוח נתונים מדעיים וגרפיםOriginLabOrigin2018תוכנת ניתוח הנתונים ליצירת עקומות תגובת המינון
מסונתז בהתאמה אישית Jackson 8

מקורות

  1. Gregersen, N., Bross, P., Vang, S., Christensen, J. H. Protein misfolding and human disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 7, 103-124 (2006).
  2. Daiger, S. P., Bowne, S. J., Sullivan, L. S. Perspective on genes and mutations causing retinitis pigmentosa. Archives of Ophthalmology. 125 (2), 151-158 (2007).
  3. Daiger, S. P., Sullivan, L. S., Bowne, S. J. Genes and mutations causing retinitis pigmentosa. Clinical Genetics. 84 (2), 132-141 (2013).
  4. Stenson, P. D., et al. The Human Gene Mutation Database: towards a comprehensive repository of inherited mutation data for medical research, genetic diagnosis and next-generation sequencing studies. Human Genetics. 136 (6), 665-677 (2017).
  5. Sung, C. H., Schneider, B. G., Agarwal, N., Papermaster, D. S., Nathans, J. Functional heterogeneity of mutant rhodopsins responsible for autosomal dominant retinitis pigmentosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (19), 8840-8844 (1991).
  6. Athanasiou, D., et al. The molecular and cellular basis of rhodopsin retinitis pigmentosa reveals potential strategies for therapy. Progress in Retinal and Eye Research. 62, 1-23 (2018).
  7. Chiang, W. C., et al. Robust Endoplasmic Reticulum-Associated Degradation of Rhodopsin Precedes Retinal Degeneration. Molecular Neurobiology. 52 (1), 679-695 (2015).
  8. Sakami, S., et al. Probing mechanisms of photoreceptor degeneration in a new mouse model of the common form of autosomal dominant retinitis pigmentosa due to P23H opsin mutations. Journal of Biological Chemistry. 286 (12), 10551-10567 (2011).
  9. Dryja, T. P., et al. Mutations within the rhodopsin gene in patients with autosomal dominant retinitis pigmentosa. New England Journal of Medicine. 323 (19), 1302-1307 (1990).
  10. Sohocki, M. M., et al. Prevalence of mutations causing retinitis pigmentosa and other inherited retinopathies. Human Mutation. 17 (1), 42-51 (2001).
  11. Chen, Y., et al. A novel small molecule chaperone of rod opsin and its potential therapy for retinal degeneration. Nature Communications. 9 (1), 1976 (2018).
  12. Chen, Y., Tang, H. High-throughput screening assays to identify small molecules preventing photoreceptor degeneration caused by the rhodopsin P23H mutation. Methods in Molecular Biology. 1271, 369-390 (2015).
  13. Chen, Y., et al. A High-Throughput Drug Screening Strategy for Detecting Rhodopsin P23H Mutant Rescue and Degradation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (4), 2553-2567 (2015).
  14. Noorwez, S. M., et al. Pharmacological chaperone-mediated in vivo folding and stabilization of the P23H-opsin mutant associated with autosomal dominant retinitis pigmentosa. Journal of Biological Chemistry. 278 (16), 14442-14450 (2003).
  15. Saliba, R. S., Munro, P. M., Luthert, P. J., Cheetham, M. E. The cellular fate of mutant rhodopsin: quality control, degradation and aggresome formation. Journal of Cell Science. 115, 2907-2918 (2002).
  16. Kaushal, S., Khorana, H. G. Structure and function in rhodopsin. 7. Point mutations associated with autosomal dominant retinitis pigmentosa. Biochemistry. 33 (20), 6121-6128 (1994).
  17. Chen, Y., Brooks, M. J., Gieser, L., Swaroop, A., Palczewski, K. Transcriptome profiling of NIH3T3 cell lines expressing opsin and the P23H opsin mutant identifies candidate drugs for the treatment of retinitis pigmentosa. Pharmacological Research. 115, 1-13 (2016).
  18. Adamus, G., et al. Anti-rhodopsin monoclonal antibodies of defined specificity: characterization and application. Vision Research. 31 (1), 17-31 (1991).
  19. Goodson, H. V., Dzurisin, J. S., Wadsworth, P. Generation of stable cell lines expressing GFP-tubulin and photoactivatable-GFP-tubulin and characterization of clones. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (9), pdb prot5480 (2010).
  20. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  21. Bray, M. A., Carpenter, A., et al. Advanced Assay Development Guidelines for Image-Based High Content Screening and Analysis. Assay Guidance Manual. Sittampalam, G. S., et al. , Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. Bethesda (MD). (2004).
  22. Sung, C. H., Davenport, C. M., Nathans, J. Rhodopsin mutations responsible for autosomal dominant retinitis pigmentosa. Clustering of functional classes along the polypeptide chain. Journal of Biological Chemistry. 268 (35), 26645-26649 (1993).
  23. Krebs, M. P., et al. Molecular mechanisms of rhodopsin retinitis pigmentosa and the efficacy of pharmacological rescue. Journal of Molecular Biology. 395 (5), 1063-1078 (2010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

P23H
וזמינותו תחבורה אופסין # רודופסין על ידי ניתוח גבוהה-תוכן הדמיה
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.