מאמר שיטה

החקירה של תלות גנטית באמצעות מבחני תחרות המבוססות על CRISPR-Cas9

DOI:

10.3791/58710

⸱

7 בינואר 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Tumor Initiation and Maintenance Program, Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute, 2Blood Research Institute, Blood Center of Wisconsin, 3Department of Bioengineering, University of California, San Diego

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כתב יד זה מתאר שיטה CRISPR-Cas9 מבוססי מקובצים באופן קבוע Interspaced קצר Palindromic חוזר (CRISPR) לחקירה פשוט ומהיר של התפקיד של גנים מרובים המועמד בהתפשטות תאים לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML) ב במקביל. טכניקה זו היא מדרגית, יכול להיות מיושם במבנים אחרים סרטן התא גם כן.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ג'ין ההפרעות מחקרים שימשו בהרחבה לחקור את התפקיד של גנים בודדים ב- AML פתוגנזה. להשגת שיבוש גנטי מלא, רבים ממחקרים אלה עשו שימוש מודלים נוקאאוט גנטי מורכב. בעוד מחקרים אלה עם עכברים knockout מציעים מערכת במבחן הזמן אלגנטית על חקירת יחסי גנוטיפ-כדי-פנוטיפ, שיטה מהיר ומדרגי להערכת מועמד גנים זה לשחק תפקיד התפשטות תאים AML או הישרדות AML דגמים יעזור לזרז חקירת גנים המועמד מרובים במקביל. ההתקדמות בטכנולוגיות לעריכת הגנום פופולארים באופן דרמטי את היכולת שלנו לבצע לפליטת גנטי בקנה מידה חסר תקדים. מערכת אחת כזאת של הגנום עריכה היא שיטת CRISPR-Cas9 מבוססי יכול לשמש כדי להפוך מהירה וכן שינויים בגנום תא היעד. נוחות ואת המדרגיות של מחיקה ג'ין CRISPR/Cas9-מתווכת ' עושה את זה אחת מהטכניקות האטרקטיבי ביותר עבור החקירה של מספר רב של גנים מבחני פנוטיפי. כאן, אנו מציגים וזמינותו פשוטה באמצעות גנים CRISPR/Cas9 מתווכת-בשילוב עם תפוקה גבוהה לזרום cytometry מבוססת על תחרות מבחני הפרעה לחקור את התפקיד של גנים שעשויים לשחק תפקיד חשוב התפשטות או ההישרדות של האדם, שורות תאים מאתר של AML.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

העשורים האחרונים ראינו מאמצים מחקרים רבים התמקדו בזיהוי התרומה של מסלולים מולקולריים מפתח ב פתוגנזה לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML). באופן מסורתי, ג'ין-הפרעה בתאי AML בוצעה באמצעות עכברים knockout מותנה או סיכת ראש-קצרים RNA (shRNA). בעוד עכברים knockout מציעים מערכת מתוחכמת לשליטה-עתיים של ג'ין-מחיקה, יצירת עכברים knockout ג'ין הוא מהגידולים, גוזלת זמן יקר. יתר על כן, ג'ין-הסתרה באמצעות אסטרטגיות רקומבינציה אינה להרחבה בקלות; אסטרטגיות אלו אינם מתאימים עצמם טוב לחקירה של מספר גנים במקביל. לאחר הגילוי של שיטות התערבות RNA mRNAs אנדוגני דפיקה למטה בעזרת RNA קטנים מפריעות (siRNA) או shRNA, החלו קבוצות רבות באמצעות טכניקות התערבות RNA לחקור את התפקיד של גנים ספציפיים ב- AML. מאז תאים AML מאתר והן אנושי שקשה לחסלם transfect בשיטות תקנים מסורתי המבוסס על שומנים בדם, לרוב מחקרים shRNA מועסקים lentivirally או מקודד retrovirally ללמוד פונקציה גנים בתאים AML. גילוי זה התבצעה מקובצים באשכולות חזרה palindromic קצר באופן קבוע interspaced (CRISPR), nucleases Cas המשויך (CRISPR-Cas9) יש מהפכה פילוח ג'ין טכנולוגיות1,2,3. באמצעות CRISPR-Cas9, גנים ספציפיים או אזורים גנומית ניתן למחוק, לערוך או מתויגים עם יעילות וקלות. CRISPR Cas9-עריכת מבוססי-ג'ין עכשיו מתעוררים כמו שיטת הבחירה עבור חוקרים יחסי גנוטיפ-כדי-פנוטיפ סוגי תאים שונים עקב פשטות, יעילות, ישימות רחבה של טכניקה זו. שיטות המבוססות על CRISPR-Cas9 גם הופכים שיטת הבחירה ב- AML, לא רק עבור חוקרים גנים בודדים, אבל גם כמו דרך היעד גנים מרובים במסכים ערוכים או במאגר הגנטי שמטרתו חוקרים מספר גנים במקביל כפוטנציאל AML-תלות4,5,6.

כתב יד זה, אנו מתארים וזמינותו צמיחה תחרותי פשוטה למדידת ההשפעה של ג'ין-הפרעה על הגידול של תאים לוקמיה מיאלואידית חריפה, בהתבסס על יציבה CRISPR Cas9-בתיווך גנים לעריכת ואחריו cytometry זרימה תפוקה גבוהה. שיטה זו היא פשוטה, יעילה, ניתן להרחבה עד בינוני-תפוקה ניסויים עבור חוקרים את התפקיד של מספר גנים במקביל בתאים AML.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ייצור AML תא קו שיבוטים עם ביטוי גבוהה של Cas9 פעילה ויציבה

  1. הפקה של Cas9 lentivirus
    1. יום 0: צלחת 4 x 10 תאים6 293T ב- 10 מ"ל של DMEM עם 10% סרום שור עוברית (FBS) ו פניצילין-גלוטמין בצלחת תרביות רקמה 10 ס מ ב אבטחה ברמה 2 (BSL2) מוסמך הוד התרבות תאים. הכנס את המאכל חממה 37 ° C.
    2. יום 1: התאים מצופה 293T צריך להיות 70 – 80% confluent ביום 1. לבצע את תרביות תאים באמצעות פרוטוקול הבאים בשעות אחר הצהריים.
    3. חממו את בינוני תרביות תאים, תרבות המדיה ואת תרביות תאים ריאגנט לטמפרטורת החדר. להפשיר את כל פלסמידים הנדרשים עבור תרביות תאים.
    4. מיקס 9 µg של psPAX2, 0.9 µg של pMD2.G µg 9 של פלסמידים pLenti-Cas9 עם µL 500 של תרביות תאים במדיום שפופרת 5 מ.
    5. להוסיף 1.7 מ של תרביות תאים בינוני mL 14 סיבוב התחתית התחתונה. הוסף µL 57 של תרביות תאים ריאגנט ישירות לתוך המדיום תרביות תאים בצינור כדי להימנע מלגעת הקיר של הצינור.
    6. בעדינות להוסיף את המיקס כולו פלסמיד תרביות תאים ריאגנט פתרון ומערבבים על-ידי הקשה בעדינות את הצינורית על הצד. דגירה התערובת בטמפרטורת החדר למשך 20-30 דקות. בינתיים, לשנות את המדיום מהצלחת 293T הזריעה.
    7. להוסיף את תערובת תרביות תאים dropwise לצלחת, רוק בעדינות את הצלחת הצידה לערבוב יעיל. מקם את הצלחת חממה 37 ° C.
    8. יום 2: וארוקן את תגובת שיקוע מהצלחת תרביות תאים בעדינות כך התאים לא מופרע או רופף מהצלחת. למחוק את תגובת שיקוע. להוסיף 10 מ של מדיום DMEM 10% טרי באמצעות החלקה למטה בעדינות מצד לצד של הצלחת להימנע הם מוציאים את התאים.
    9. יום 3: לאסוף את הוירוס המכילה תגובת שיקוע מהצלחת תרביות תאים לאט על-ידי ציור זה לתוך מזרק סטרילי 10 ס מ. לאחר תגובת שיקוע נאסף לתוך המזרק, לצרף המזרק מסנן מיקרומטר 0.45 סטרילי, החזק את המזרק ואת מסנן על צינור חרוטי פוליפרופילן טריים, סטרילי 15 מ"ל. מזנקת בעדינות את המזרק כדי לסנן את הווירוס המכיל תגובת שיקוע דרך המסנן מיקרומטר 0.45 לתוך הצינור חרוט פוליפרופילן 15 מ"ל.
    10. לאחסן המדיום הממוזגים ויראלית aliquots של 2 מ ל כל אחד ב- 2 mL cryovials ב-80 מעלות צלזיוס.
  2. התמרה חושית של שורות תאים לוקמיה מיאלואידית חריפה
    1. יום-1: למהול 1 מ"ג/מ"ל fibronectin האנושי רקומביננטי פרגמנט המניה µg/mL 10 עם סליין סטרילי באגירה פוספט (PBS). המעיל רקמות תרבות-שאינם מטופלים 6 טוב צלחת עם 2 מ"ל של הפתרון עובד 10 µg/mL פרגמנט fibronectin האנושי רקומביננטי בשכונה תרבות תא BSL2 אושרה. עוטף את הצלחת לעטוף תיאחז כדי למנוע אובדן על אידוי וחנות בטמפרטורת החדר למשך הלילה.
    2. יום 0: להפשיר את תגובת שיקוע נגיפית המכילה Cas9. האחות הפתרון פרגמנט רקומביננטי fibronectin אנושי לחלוטין מן הלוח מצופה לפני spinfection. להוסיף 2 מ של נגיפי בינוני ממוזגים עם Cas9 לצלחת ולסובב את זה ב x 1300 גרם במשך 90 דקות ב- 35 מעלות צלזיוס. זה עוזר את חלקיקי נגיפי לצרף spinfected טוב.
    3. בינתיים, לספור את התאים כדי להיות transduced ו ספין למטה 2 x 10 תאים6 צינור חרוטי פוליפרופילן 15 מ"ל. וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב 2 מ"ל של מדיה תרבות טריים.
    4. לאחר spinfection, להסיר את תגובת שיקוע ויראלי spinfected טוב וזורקים. חלקיקי retroviral תגובת שיקוע מחוברים בתחתית spinfected טוב. זה להוסיף, התאים6 2 x 10 resuspended ב 2 מ של האמצעי השלבים שלעיל.
    5. לסובב את הצלחת שוב ב 1300 x g מאוד בקצרה (1-2 דקות) מספיק כדי לאפשר את התאים להתיישב בחלק התחתון. מקם את הצלחת בחזרה לתוך החממה, להשאיר למשך הלילה עבור התמרה חושית עם חלקיקי נגיפי spinfected מחובר היטב.
    6. יום 1: בהתאם צפיפות התאים, יש להוסיף בינוני יותר לתאים transduced כדי למנוע גידול יתר.
    7. יום 2: מאז פלסמיד pLenti-Cas9 יש לסמן התנגדות Blasticidin, להוסיף Blasticidin במינון 10 מ ל/µg transduced, untransduced (בקרה) MOLM13 או תאים לוקמיה העכבר MLL-AF9 לבחירת Cas9 לבטא תאים.
      הערה: Blasticidin מבחר של Cas9-transduced MOLM13 או MLL-AF9 בתאי הלוקמיה נחשב מלאה כאשר כל התאים בקרה untransduced חוסלו. עבור שורות תאים חוץ MOLM13 ו- MLL-AF9 לוקמיה, עקומת תגובת המינון חייב להתבצע לפני הניסוי הזה כך יכול להיות מועסק המינון האופטימלי. טיטור של תגובת שיקוע ויראלי יכול להתבצע גם במקרה של המחירים נמוכים-התמרה חושית.
  3. לשכפל את בחירת התאים מבטאים גבוהה-Cas9.
    הערה: שמנו לב כי בעוד כמה שורות תאים לוקמיה מיאלואידית חריפה, לשכפול הבחירה ייתכן שלא יהיה צורך: עיקר האוכלוסייה Cas9-Blasticidin נבחר כבר יש יעילות גבוהה לעריכת הגנום. במקרה זה, ניתן לדלג על שלב 1.3 ולעבור שלב 1.4 כדי להעריך את הביטוי Cas9 בתאים AML בצובר Cas9-blasticidin על-ידי המערב סופג את זה זה עדיין יהיה חשוב להעריך את יעילות לעריכת ג'ין באותם תאים בצובר Cas9-AML (שלב 1.5) לפני שימשיך מבחני תחרות. אנחנו משערת כי הבחירה של שיבוטים גבוהה יחיד-Cas9 מפחית את ההשתנות לעריכת הגנום, אשר חשוב במיוחד בעת בדיקת מספר של מדריך יחיד שונה RNAs (sgRNAs).
    1. מבצעים חד-תא בערך Cas9-Blasticidin נבחר תאים לוקמיה MOLM13 ו- MLL-AF9 מעתה בשם MOLM13-Cas9 ותאים MLL-AF9-Cas9, בהתאמה, שימוש של סדרן FACS הכלול ברדס BSL2 אושרה. ניתן לבצע מיון 5 – 10 עגול התחתון תרביות רקמה שטופלו לוחות טוב 96.
    2. פעם אחת MOLM13-Cas9, שיבוטים MLL-AF9-Cas9 נאספו ולהרחיב בנפרד בשם, 10 – 20 שיבוטים עם 10 µg/mL של Blasticidin תרבות בתקשורת כדי להבטיח שמירה על הביטוי Cas9.
  4. הביטוי לבדוק חלבון Cas9 יציב על-ידי immunoblotting.
    1. להפוך תמציות הגרעין של כל שיבוטים Blasticidin נבחר של לוקמיה MOLM13 ו- MLL-AF9 באמצעות ערכת חילוץ גרעיני לפי הפרוטוקול של היצרן. בדוק Cas9 ביטוי חלבון באמצעות אנטי-דגל M2 נוגדן מאז Cas9 בתוך פלסמיד pLenti-Cas9 קשורה epitope N-מסוף דגל.
    2. לטעון µg 50 של חלבון הכולל של כל תמצית גרעיני על 10% Bis-טריס ג'ל ולהפעיל את הג'ל-120 V עד להקות העליון מופרדים היטב.
    3. לחסום את הקרום עם 5% פתרון חלב TBST מאגר מאובטח.
    4. דגירה הקרום עם 1:1,000 לדילול דגל נגד נוגדן M2-ריכוז הסופי של µg/mL 1-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    5. ביום למחרת, לשטוף את הקרום עם מאגר TBST, דגירה עם HRP מצומדת העכבר אנטי משני נוגדן-לדילול 1:5,000 (הריכוז הסופי של 0.16 µg/mL) בטמפרטורת החדר מאובטח.
    6. לשטוף את הקרום ביסודיות עם TBST ולפתח את האבן החשופה באמצעות ECL המצע.
    7. לבחור שיבוטים 3-4 עם הביטוי החלבון הגבוהה ביותר של Cas9 כפי שנראה סופג המערבי לצורך ניתוח פונקציונאלי נוסף (איור 1).
  5. הבטחת הפעילות Cas9 גבוהה שיבוטים שנבחרו
    1. להכין lentiviral תגובת שיקוע של וקטור קידוד sgRNA עם sgRNAs לעבר האדם או עכבר AAVS1 כספת-הארבור לוקוס כפי שמתואר על 1.1 שלב.
    2. מגלי העליון להביע Cas9 MOLM13 או לוקמיה MLL-AF9 שיבוטים עם אנטי-AAVS1 sgRNA lentiviral תגובת שיקוע בשיטת spinfection שתוארו לעיל. בחר עם 2.5 µg/mL Puromycin ארבעה ימים.
    3. לטהר את הדנ א של שיבוטים לוקמיה MOLM13-Cas9 או MLL-AF9-Cas9 לאחר הבחירה Puromycin יחד עם פקדים פראי-סוג המתאימים באמצעות ערכת חילוץ דנ א גנומי לפי הוראות היצרן. שימוש 50 ng של DNA כתבנית כדי לבצע PCR עם AAVS1_test_primers באמצעות 2 x מיקס מאסטר של אנזימים, התוכנית PCR המפורטים בטבלה1.
    4. להפעיל את המוצר PCR על ג'ל agarose 2%, ג'ל-לטהר את הלהקה זוג בסיסים 268 באמצעות ערכת חילוץ ג'ל לפי הפרוטוקול של היצרן. סאנגר רצף הג'ל טהור PCR מוצר באמצעות פריימר של AAVS1_target-frag_F.
    5. להעריך יעילות העריכה על ידי השוואה של AAVS1 נערך רצפים wildtype באמצעות כלים מבוססי-אינטרנט מקוון (איור 2).

2. שיבוט, התמרה חושית של sgRNAs בתאים AML-Cas9

  1. תפוקה בינונית שכפול של sgRNAs
    1. עיצוב sgRNAs 4-6 עבור הגן עניין באמצעות תוכנת עיצוב CRISPR מבוססי-אינטרנט. יש מספר CRISPR עיצוב כלים זמינים באינטרנט כגון http://crispr.mit.edu/ אשר ליצור רצפים sgRNA מבוסס על רצף ה-DNA קלט.
      1. מלא את המידע המתאים בשדות עם כוכביות. לחץ על הגנום היעד עבור עיצוב sgRNA. הדבק את רצף היעד בתיבה רצף ולחץ על לחצן שלח .
    2. לקראת שיבוט ב pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - W sgRNA ביטוי פלסמיד, רצץ של נוקלאוטידים "CACC" חוש oligo, "AAAC" כדי oligo antisense המלווים הפוך לפני שמזמינים. סדר premixed חוש וחוש אנטי oligos בצלחת 96-ובכן מתויג Oligo-מיקס של חברת סינתזה oligonucleotide.
      הערה: אנחנו עשינו שימוש pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - W פלסמיד, שבו יש דרך האתר הגבלת BbsI sgRNA שיבוט. במקרה השני פלסמידים ביטוי sgRNA משמשים, המסוכך על המשמש את oligonucleotides sgRNA צריך להשתנות בהתאם.
    3. לקחת U התחתון 96-ובכן לוח נפרד מתויג חישול צלחת. להפוך את תערובת הבסיס של 1 µL PNK T4, µL 1 של 10 x מאגר מצדו T4 DNA ו 6 µL של מים ליום חישול התגובה.
    4. הוסף 8 µL של המיקס מאסטר כל טוב של צלחת מחזק. להוסיף 1 µL של 100 מיקרומטר, הגיוני, antisense oligo (או 2 µL של מעורבות oligos הגיוני-אנטי-סנס) לתערובת בסיס. פיפטה 2 – 3 פעמים בעדינות לערבב היטב, לסובב את הצלחת בקצרה כדי לקבל את תערובות לתחתית של וולס.
    5. השתמש בתוכנית מחזק הבאים על מכונת ה-PCR: 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס, 2 דקות 30 s ב 95 ° C ואחריו קירור איטי עד 22 ° C בשיעור של 0.1 º C/s. לאחר חישול, לקחת צלחת 96-ובכן טרי מתויג OligoMix מדולל. . על הצלחת הזו, לדלל את oligos phosphorylated ואת annealed מן התגובה לעיל עם מים (1:200) באמצעות פיפטה רב-ערוצי.
    6. µG 5 תקציר של pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - W וקטור עם 1.5 µL של אנזים הגבלה BbsI (10,000 יחידות/mL) באמצעות מאגר המתאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים כדי linearize זה עבור מצדו מאוחר יותר.
    7. לקחת צלחת טוב טרי 96 מתויג מצדו צלחת ולהוסיף 20 ng של BbsI מתעכל pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - W וקטור באר אחת לכל מצדו sgRNA הרצוי. להוסיף 2 µL של oligos phosphorylated, annealed מהצלחת OligoMix מדולל .
    8. מוסיפים 1 µL 10 x T4 ליגאז מאגר µL 1 של האנזים T4 DNA ליגאז. פיפטה עם פיפטה רב-ערוצי ובעדינות דגירה המיקס מצדו בטמפרטורת החדר במשך שעתיים.
      הערה: ניתן לאחסן מצדו mixes ב-20 ° C עבור השלב שינוי מאוחר יותר.
    9. בינתיים, הפשרה 90 µL של כשיר מבחינה כימית e. coli תאים על הקרח 10 דקות לפני סוף השלב מצדו.
    10. באמצעות פיפטה רב-ערוצי, להפוך aliquots 10 µL של התאים המוסמכת כל טוב של צלחת נפרדת טוב 96.
    11. להוסיף את התערובת מצדו מהשלב 2.1.8 תגובה על תוך טוב המכיל תאי המוסמכת, פיפטה מעלה מטה בעדינות, תקופת דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    12. פיפטה 5 µL של חיידקים-DNA לערבב ישירות מן התגובה לעיל לתוך 6. ובכן לוח המכיל LB-אגר עם 100 µg/mL אמפיצילין. חזור על כל התגובות טרנספורמציה.
    13. צלחת כל תגובה טרנספורמציה לתוך בנפרד שכותרתה טוב של צלחת 6-. טוב. מוסיפים כ 5-8 חרוזי זכוכית לכל טוב לנער את הצלחת כל 6-ובכן 8 – 10 פעמים בתנועה סיבובית.
    14. לבחור מושבות יחידה 1-2 מכל קידוח עם טיפ פיפטה µL 20 סטרילית, פסים זה מקום בזהירות עם תוויות ברורות על סטרילי 10 ס מצלחת פטרי עם אגר LB ו- 100 מ"ג/מ"ל אמפיצילין. אחרי שהתרוצץ המשקולת ליברות, פשוט להוציא את הטיפ משמש לשכפול ומבטא לתוך 3 מ ל LB-אמפיצילין המכיל במדיום mL 14 סיבוב התחתית התחתונה מסומן עם מספר שיבוט בקטריאלי המתאים.
    15. שלח את הצלחת חיידקי ישירות סנגר רצף עם פריימר לפנים יזם U6 אנושי.
    16. לאחר אישור רצף של sgRNAs משובטים, לטהר את הדנ א מהצינור 14 מ"ל המתאימים באמצעות ערכת הכנה מיני לפי הוראות היצרן.
    17. מודדים את ריכוז ואיכות כל המיני-preps עם ספקטרופוטומטרים. לנרמל בכל מיני להתכונן לכל ריכוז של 15 ng/µL ו פיפטה לתוך צלחת טוב 96 מתויג sgRNA צלחת שיבוטים.
      הערה: הצלחת הזו יכול להיות מאוחסן ב-20 ° C או להשתמש ישירות עבור הכנת וירוס.
  2. בייצור נגיפי של המבנים sgRNA התמרה חושית
    1. לייצור של חלקיקים lentiviral sgRNA בתבנית 96-ובכן, בצע "shRNA/sgRNA/ORF תפוקה גבוהה ייצור ויראלי (96 טוב)" פרוטוקול של פלטפורמת ההפרעות גנטיות (GPP אינטרנט בפורטל) במכון ברוד (URL: https:// portals.broadinstitute.org/gpp/public/resources/protocols).
    2. µL 200 של תגובת שיקוע ויראלי להעביר צינורות סטרילי ומקפיאים מיד ב-80 מעלות צלזיוס.
    3. יום-1: מעיל בתחתית שטוח רקמות ללא תרבות מטופלים 96 טוב צלחת עם 100 µL של קטע רקומביננטי fibronectin אנושי-ריכוז של µg/mL 10 בשכונה תרבות תא BSL2. לעטוף את הצלחת באמצעות גלישת תיאחז כדי למנוע אידוי אובדן ולהשאיר אותה על הספסל במשך הלילה.
    4. יום 0: להסיר את השבר רקומביננטי fibronectin אנושי מכל קידוח. להפשיר את תגובת שיקוע ויראלי של כל sgRNA בטמפרטורת החדר. להוסיף 50 µL של תגובת שיקוע ויראלי מהצינור כל אחד מצופה היטב של צלחת התמרה חושית. לסובב את הצלחת התמרה חושית ב x 1300 גרם במשך 90 דקות ב- 35 מעלות צלזיוס.
    5. לקראת סוף spinfection, נחשב MOLM13-Cas9 (שיבוט B3) תאים מן הבקבוק תרבות. השתמש 10,000 תאים לכל טוב בכרך µL 100. לספור את התאים על כל התמרה חושית הבארות, נפח מת התחשבות.
    6. לאחר spinfection 90 דקות, הסר את תגובת שיקוע כל הבארות באמצעות פיפטה רב-ערוצי התרגלו 50 µL לאט בהטיית לצלחת. להוסיף כל טוב לאט מחליק במורד משפת 100 µL התרבות של התאים המשובטים B3 MOLM13-Cas9.
    7. לסובב את הצלחת ב x 1,300 g למשך 2 דקות ב- 35 ° C לתת את התאים להתפשר על גבי התחתון. להעביר את הצלחת החממה כיתה של תרביות רקמה 37 º C.
    8. יום 1: הוספת µL 100 של בינוני טריים כל טוב המכיל sgRNA transduced Cas9-MOLM13 או Cas9-MLL-AF9 לוקמיה תאים כך שאמצעי האחסון בינוני הסופי 200 µL.

3. תחרותי צמיחה Assay

  1. יום 3: 72 h (יום 3) לכתוב התמרה חושית, לבדוק את אחוז sgRNA המכיל תאים חיוביים BFP כל היטב על ידי cytometry זרימה (FACS). השתמש צבע הכדאיות תא כדי לסמן או לא לכלול תאים מתים מניתוח.
  2. המשך מחדש יופיצ שיעור של התאים לתוך בארות חדשות בינונית טרייה לאחר כל ניתוח FACS למנוע יתר במהלך וזמינותו.
  3. חזור על הניתוח FACS כל 2-3 ימים כדי לבדוק את חלקם היחסי של BFP חיובי (BFP + ve) תאים בהשוואה BFP עמיתיהם (BFP-ve) שלילי (איור 3). לנתח את אחוז BFP תאים חיוביים עבור כל נקודת זמן (באמצעות FlowJo או תוכנה דומה של ניתוח FACS).
    1. גרור קבצים Fcs עבור כל דגימה תוכנה FlowJo. לחץ פעמיים על כל קובץ דוגמא אחת, מגרש אבן חשופה נקודה של פיזור קדמי (FSC) לעומת הצד פיזור (האס) עם FSC על ציר והאס על ציר Y. שער כל התאים.
    2. לחץ פעמיים על התאים מגודרת, מניחים אותם על הכתם הכדאיות (על ציר Y) לעומת FSC גובה (H) או אזור (א) נקודה חשופה. שער הכדאיות כתם שלילי תאים (חיים).
    3. לחץ פעמיים על תאים חיים מגודרת, להתוות BFP (לאורך ציר Y) לעומת FSC (א) על ציר X. שער BFP + ve תאים. חלות כל השערים הללו כל הדגימות על-ידי גרירת המדגם הנבחר כל דוגמאות תחת לשונית קבוצה .
    4. לחץ על שולחן עורך לעשות טבלת ניתוח של כל הדגימות. גרור ספירת BFP + ve דוגמא אחת בטבלה ולחץ על לחצן תצוגה ב- שולחן עורך כדי ליצור דוח אצווה של כל הדגימות עם שולחן מציג את אחוז תאים BFP + ve . שמור את הטבלה xls.
  4. לחשב את העלייה פרופורציונליים או ירידה % BFP תאים חיוביים בתוך האוכלוסייה תא חי לאורך זמן והשווה יחס זה ביחס של תאים חיוביים BFP sgRNAs שליטה (כגון לוציפראז, ביצים מקושקשות או GFP sgRNA).
  5. להתוות את היחס שבין BFP תאים חיוביים עבור sgRNAs שונות כולל את gene (s) של הריבית וכן פקדי משתמש יום 3 כקו הבסיס.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במחקר שלנו, אנחנו קודם transduced את MOLM13 האנושית AML שורת התאים הנושאת רוברטסונית MLL-AF9 עם כייל גבוה וירוס קידוד פלסמיד lentiviral את Cas9-blasticidin. בידיים שלנו, בצובר ממוינת תאי MOLM13-Cas9 תציג את הביטוי Cas9 ברמה גבוהה על ידי סופג המערבי ואת גם לא לבצע היטב כאשר לבדיקה עבור ג'ין יעיל עריכה-באמצעות השיטה שתוארה לעיל7. לכן, התקדמנו כדי ליצור שיבוטים תא בודד ולבחור רק השיבוטים עם רמות גבוהות של Cas9 כפי שנראה המערבי סופג (איור 1

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כתב יד זה, אנו מתארים פרוטוקול מפורט לביצוע של צמיחה תחרותי המבוססות על CRISPR-Cas9 assay לחקור את התפקיד של המועמד גנים ב- AML שורות תאים באמצעות cytometry זרימה ב- AML האדם/מאתר תאים (איור 5). מטרת וזמינותו היא לזהות את ההשפעה של ג'ין מחיקה על תחזוקה של התפשטות תאים AML מעל שבועיים עד שלושה שבועות בקנה-מידה בינוני-תפוקה. כמה צעדים קריטיים שצריך להיות אחריו בקפידה כדי להקל על שינוי קנה מידה הפרוטוקול המתואר. בייצור של Cas9 lentivirus, זה הכרחי לסנן את המדיום וירוס ממוזגים דרך מסנן מיקרומטר ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A.J.D הוא יועץ A2A תרופות (ניו ג'רזי), ותרופות Salgomed (קרית אתא). מחברים אחרים יש אין התנגשויות להכריז.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פלסמיד pCW-Cas9 הייתה מתנת אריק לנדר & דוד סבאטיני (Addgene פלסמיד # 50661), pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - W פלסמיד מהמעבדה יוסה (Addgene פלסמיד #67974. ברצוננו להודות הליבה Cytometry זרימה במכון דיסקברי רפואי SBP לעזרה בזמן עם ניתוח תזרים ומיון. נשמח להכיר את התמיכה של הקרן לזכר טטה הגברת כדי לספירה נשמח להכיר גם את התמיכה של מקורות המימון הבאים: NIH/NCI P30 CA030199 סרטן מרכז בחסות גרנט, V-הקרן ומרכזים את סן דייגו NCI סרטן (C3) #PTC2017to A.J.D.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
FLAG-M2 נוגדןסיגמא-אולדריץ' F3165, פריט # SLBS3530V
נוגדן נגד עכברInvitrogen31446, פריט # TA2514341
SuperSignal West Femto מצע רגישות מקסימליתThermo Fisher34095
מערכת הדמיה ChemiDoc BIORAD17001401
Sorvall Legend RT צנטריפוגהThermo Scientific
BlasticidinThermo FisherR21001
SYTOX אדוםתרמו פישרS34859
Opti-MEMתרמו פישר31985062
DMEMתרמו פישר11965-092
RPMIתרמו פישר11875-093
פניצילין-סטרפטומיציןתרמו פישר15140122
L-גלוטמין (200 מ"מ)Thermo Fisher25030081
סרום בקר עוברי (FBS)SAFC12303C
וקטור gRNA יחידAddgene #67974pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W
ערכת מיצוי גרעיני CelLyticsigma-alorichNXTRACT
XtremeGENE 9sigma-alorich6365787001
RetronectinTakaraT100B
ציטומטר זרימהBD Biosciences
T4 PNKNEBioLabsM0201S
T4 מאגר קשירת DNANEBioLabsB0202S
T4 DNA ליגאז אנזיםNEBioLabsM0202S
AmpicillinFisher ScientificBP1760-25
LB agarפישר מדעיBP9724-500
LB מרקפישר מדעיBP9731-500
ערכת מיני הכנה Qiagen27104
ספקטרופוטומטר NanoDropתרמו פישרNanoDrop
IL-3Peprotech213-13
עכבר רקומביננטי IL-6Peprotech216-16
עכברים רקומביננטיים M-CSFPeprotech315-02
תאים מוכשרים יציביםNEBiolabsC3040I
10 ס"מ צלחות תרבית רקמותפישר Scientific353003
תמיסת ליזה של תאיםQiagen158906
תמיסת משקעי חלבוןQiagen158910
תמיסת הידרציה של DNAQiagen158914
QIAquick ערכת מיצוי ג'לQiagen28704
BbSIניו אינגלנד BioLabsR0539S
APEX 2.0x Taq Red Master Mix KitGenessee Scientific42-138
PuromycinFisher ScientificBP2956100
צינורות חרוטיים מפוליפרופילן 50 מ"לפישר מדעי1495949A
15 מ"ל צינורות חרוטיים מפוליפרופילןפישר מדעי1495970C
עכבר רקומביננטי אחד

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. Cas9 as a versatile tool for engineering biology. Nature Method. 10 (10), 957-963 (2013).
  2. Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096(2014).
  3. Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).
  4. Shi, J., et al. Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains. Nature Biotechnology. 33 (6), 661-667 (2015).
  5. Kuhn, M. W., et al. Targeting Chromatin Regulators Inhibits Leukemogenic Gene Expression in NPM1 Mutant Leukemia. Cancer Discovery. 6 (10), 1166-1181 (2016).
  6. Erb, M. A., et al. Transcription control by the ENL YEATS domain in acute leukaemia. Nature. 543 (7644), 270-274 (2017).
  7. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  8. Brinkman, E. K., et al. Easy quantification of template-directed CRISPR/Cas9 editing. Nucleic Acids Research. 46 (10), 58(2018).
  9. Nguyen, A. T., Zhang, Y. The diverse functions of Dot1 and H3K79 methylation. Genes & Development. 25 (13), 1345-1358 (2011).
  10. Vlaming, H., van Leeuwen, F. The upstreams and downstreams of H3K79 methylation by DOT1L. Chromosoma. 125 (4), 593-605 (2016).
  11. Bernt, K. M., et al. MLL-rearranged leukemia is dependent on aberrant H3K79 methylation by DOT1L. Cancer Cell. 20 (1), 66-78 (2011).
  12. Daigle, S. R., et al. Selective killing of mixed lineage leukemia cells by a potent small-molecule DOT1L inhibitor. Cancer Cell. 20 (1), 53-65 (2011).
  13. Jo, S. Y., Granowicz, E. M., Maillard, I., Thomas, D., Hess, J. L. Requirement for Dot1l in murine postnatal hematopoiesis and leukemogenesis by MLL translocation. Blood. 117 (18), 4759-4768 (2011).
  14. Nguyen, A. T., Taranova, O., He, J., Zhang, Y. DOT1L, the H3K79 methyltransferase, is required for MLL-AF9-mediated leukemogenesis. Blood. 117 (25), 6912-6922 (2011).
  15. Zuber, J., et al. Toolkit for evaluating genes required for proliferation and survival using tetracycline-regulated RNAi. Nature Biotechnology. 29 (1), 79-83 (2011).
  16. Wang, T., et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).
  17. Li, M. J., Rossi, J. J. Lentivirus transduction of hematopoietic cells. CSH Protocols. 2007, pdb prot4755 (2007).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Flow CytometryCompetition AssayGene KnockoutAML Cell LinesSingle Guide RNALentiviral TransductionBFP Positive CellsFlow Cytometry Analysis

מאמרים קשורים