הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

חילוץ וניתוח של פרופוליס ירוק מטייוואן

8.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/58743

⸱

7 בינואר 2019

 ,  ,  , 
1Department of Biotechnology and Animal Science, National Ilan University

במאמר זה

סיכום

אנו מציגים פרוטוקול להצפנה באמצעות אתנול כמו הממס כדי לחלץ לאפיין פרופוליס ירוק מטייוואן זה מוצגים אנטיבקטריאלי.

תקציר

פרופוליס ירוק מטייוואן עשיר prenylated פלבנואידים ותערוכות במגוון רחב של פעילויות ביולוגיות, כגון נוגדי חמצון, אנטי בקטריאלי, ואת אלה נגד סרטן. Bioactive תרכובות של פרופוליס ירוק מטייוואן הם propolins, כלומר C, D, F ו- G. הריכוז של propolins ב פרופוליס ירוק מטייוואן משתנה בהתאם העונה והמיקום הגיאוגרפי. לפיכך, חיוני להקים הליך סטנדרטי, הדיר לקביעת האיכות של פרופוליס ירוק מטייוואן. כאן, אנו מציגים פרוטוקול העושה האתנול מבוססי החילוץ, כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים, ניתוח פעילות נגד חיידקים לאפיון איכות פרופוליס ירוק מטייוואן. שיטה זו מציינת כי 95% ו- 99.5% אתנול עקירות להשיג את היבול המרבי חומר יבש של פרופוליס ירוק מטייוואן, ובכך מניב הריכוזים הגבוהים ביותר של propolins יש תכונות אנטיבקטריאליות. על פי ממצאים אלה, בפרוטוקול הנוכחי נחשבת הדיר לקביעת האיכות של פרופוליס ירוק מטייוואן ואמין.

מבוא

פרופוליס הוא תערובת שרפי הטבעי המיוצר על ידי דבורה המין בומבוס. פרופוליס כבר בשימוש נרחב מאז ימי קדם בפולק תרופות. מחקר דיווח לאחרונה שכי הפרופוליס הינו מועיל למניעת זיהומים חיידקים, דלקת1. מחקרים רבים הראו כי תרכובות ביו הראשי של פרופוליס הם פלבנואידים, בעל תאים פנוליים אסטרים חומצה, prenylated p-חומצות coumaric ו- diterpenic חומצות2,3. עד כה, זוהו prenylated 10 flavanone נגזרות של פרופוליס ירוק מטייוואן באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים (HPLC)4,5,6,7. הנפוץ ביותר בקרב אלה הם propolins C, D, F ו- G5,7. השפעות ביולוגיות ניכר של פרופוליס ירוק מטייוואן נמצאים בקורלציה עם שלה תכולה גבוהה של propolins8.

הריכוזים של תרכובות ביו בפרופוליס משתנים במידה רבה בהתאם העונה והמיקום הגיאוגרפי שממנו מתקבל פרופוליס. פרופוליס האירופית מכיל בעיקר פלבנואיד אגליקון ו בעל תאים פנוליים חומצות9. תרכובות ביו העיקריים של פרופוליס מברזיל הם prenylated p-חומצות coumaric, כגון artepillin C10. מחקר הוכיח כי העונה הוא גורם קריטי בקביעת התכנים propolin הכולל פרופוליס ירוק מטייוואן11. התוכן propolin הטייוואנית פרופוליס ירוק הוא הגבוה ביותר בחודשי הקיץ (מאי - יולי), הנמוך ביותר חורף11. המאפיין אנטיבקטריאלי של פרופוליס נחשב באופן נרחב כדי להיות מחוון פעילות ביולוגית. בדרך כלל, הדגימות של פרופוליס שנאספו מאזורים שונים שכישוריי אנטיבקטריאלי נכס דומה; לדוגמה, זה בדרך כלל יעילה כנגד כמעט כל חיידקים גראם חיוביים ותערוכות השפעה אנטי-בקטריאלי מוגבלת נגד חיידקים גראם שליליים10,12,13. האינטראקציות סינרגטי בין פלבנואידים ב פרופוליס היו הפגינו יש השפעה אנטי-בקטריאלית של14. באופן דומה, פרופוליס ירוק מטייוואן דווח להשפיע מיקרוביאלית כנגד חיידקים גראם חיוביים15. יתר על כן, מחקר זיהה גם אפקט מיקרוביאלית של פעולת הגומלין בין propolins פרופוליס ירוק מטייוואן8.

האפיון של תרכובות ביו של פרופוליס קשה בגלל ההרכב הכימי שלה יכולה להשתנות, בהתאם למקורו של המקור. לכן, זה הכרחי ליצור שיטה אפשרית הדיר לקביעת איכות פרופוליס ירוק מטייוואן. עם זאת, אין נוהל הוקם עבור חילוץ פרופוליס ירוק מטייוואן, אנליזה פונקציונלית עוקבות. מספר שיטות החלות ממיסים אורגניים ואנאורגניים בדרכים שונות הוצעו פרופוליס החילוץ16,17,18,19,20. כי הפרופוליס הינו תערובת lipophilic, מחקרים הראו החילוץ אורגני עדיף אורגניים החילוץ8,18,19. ריכוז propolin הכולל פרופוליס ירוק מטייוואן, שלה תכונות אנטיבקטריאליות הם מחווני מפתח של האיכות של פרופוליס ירוק מטייוואן. לפיכך, מטרת מחקר זה היא להציג פרוטוקול להצפנה באמצעות אתנול כמו הממס כדי לחלץ לאפיין את תכונות אנטיבקטריאליות של פרופוליס ירוק מטייוואן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת תרכובות אתנול, חילוץ

  1. שוקלת 10 גרם של קפואים פרופוליס ירוק מטייוואן, אשר נאסף מתוך כוורות בטייוואן ממאי עד יולי, לטחון אותו באמצעות את מטחנת תבלינים. לאשר כי כל פיסות פרופוליס ירוק מטייוואן הם הקרקע לאבקה בסדר בלי שום חלקיקים גדולים.
  2. להוסיף 100 מ של ריכוזים שונים של אתנול (60%, 70%, 80%, 95% ו- 99.5%) ומים נפרדים מבחנות ולערבב כל ריכוז עם 10 גרם פרופוליס הקרקע.
  3. דגירה 25 ° c, לנער את הבקבוק בהישג 250 סל"ד במשך 48 שעות.
  4. לסנן את תמציות אתנול דרך מסנן נייר עם גודל הנקבוביות 25 μm.
  5. לשקם את filtrates כדי שלהם לאמצעי האחסון המקורי (100 מ"ל) עם אתנול 95% באמצעות על סטריליות.
  6. חנות שהאתנול תמציות ב-20 ° C.
    הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן.

2. הכנה של אתנול תמציות HPLC

  1. רכז 10 מ"ל אתנול תמציות בשל התאיידות ואקום ב 40 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
  2. אופים את העניין יבש ב 45 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה.
  3. לשקם את העניין יבש עם 10 מ"ל אתנול 95%.
  4. מסנן 1 מ"ל אתנול תמציות באמצעות מסנן סטרילי מזרק עם גודל הנקבוביות 0.45 מיקרומטר.
  5. לסנן מחדש תמציות אתנול באמצעות מסנן סטרילי מזרק עם גודל הנקבוביות 0.22 מיקרומטר. פילטרט של שנאספו, ניתן ישירות לנתח באמצעות HPLC.

3. ניתוח התוכן Propolin באמצעות HPLC

  1. הקמתה של עקומות סטנדרטית של propolins
    1. להכין 1 ליטר בשלב ניידים של פתרון מתנול: מים 88.8:11.2 (וי/v).
    2. להכין דילולים טורי של propolin ריכוז רגיל (C, D, F ו- G) (15.625 מ"ג/מ"ל, 31.25 מ"ג/מ"ל, 62.5 מ"ג/מ"ל ו- 125 מ"ג/מ"ל, בהתאמה) באמצעות הפתרון שלב ניידים כמו הממס.
    3. מזריקים µL 20 של ריכוזים סטנדרטי propolin לתוך העמודה הפוכה-פאזי, ברצף של ריכוז נמוך לריכוז גבוה.
    4. הגדר את העמודה HPLC של 30 מעלות צלזיוס, קצב הזרימה כדי 1 mL/min.
    5. הגדר אורך הגל של הגלאי UV 280 ננומטר וזמן מקליט את 20 דקות.
    6. לנתח את הסטנדרטים לפחות 3 x.
    7. להתוות את התגובה מדידה (ציר y) נגד הריכוז (ציר x) באמצעות חישוב גיליון תוכנה, וליצור עיקול רגיל עם חמוציות או ערך R בריבוע.
  2. ניתוח של אתנול לחלץ s
    1. מזריקים µL 20 של תמציות אתנול המתקבל שלב 2.5 לתוך העמודה הפוכה-פאזי.
    2. הגדר את העמודה HPLC של 30 מעלות צלזיוס, קצב הזרימה כדי 1 mL/min.
    3. הגדר אורך הגל של הגלאי UV 280 ננומטר וזמן מקליט את 20 דקות.
    4. לנתח את הסטנדרטים לפחות 3 x.
    5. חשב את ריכוז propolin תמצית אתנול, באמצעות המשוואה עבור העקומה הסטנדרטי המתקבל שלב 3.1.7 המשתמשת האזור שיא עבור כל propolin.

4. הריכוז המעכב המינימלי וניתוח ריכוז אחרים מינימום

הערה: השיטה microdilution משמש כדי להעריך את היעילות אנטיבקטריאלי של אתנול, חילוץ propolins של פרופוליס ירוק מטייוואן.

  1. הכנת מבחן אורגניזמים
    1. להפשיר את זני חיידקים, Staphylococcus aureus ו- Escherichia coli, , תרבות אותם tryptic סויה מרק, מרק מזין, בהתאמה, ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה.
    2. המעבר של S. aureus באמצעות ציר סויה tryptic ו- e. coli באמצעות נזיד מזין עבור שני דורות, ואז לחשב את המושבה יוצרי יחידות על ידי ספירת מושבות בודדות על צלחת אגר.
  2. הכנה של אתנול תמציות עבור בדיקות אנטיבקטריאלי
    1. לרכז את תמציות אתנול המתקבל שלב 1.5 על ידי אידוי ואקום ב 40 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
    2. לשקם את העניין יבש עם דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) ולהתאים את הריכוז של התמצית כדי 12.8 מ"ג/מ"ל.
    3. לגרום לדילול טורי (ריכוזים: 5, 10, 20, 40, 80, 160, 320 ו µg 640/mL) של אתנול תמציות באמצעות המרק.
  3. הריכוז המעכב המינימלי בדיקות
    1. להוסיף 10 µL של תמציות אתנול מדולל החל 0.156 וכלה µg 640.0/mL לתוך צלחת 96-ובכן.
    2. באמצעות ציר, לכוונן את עוצמת הקול כדי 100 µL, ולתחזק דימתיל סולפוקסיד 5% על כל דילולים.
    3. לחסן µL 100 התרבות חיידקי (1 x 106/mL) המשקולת 96-ובכן.
    4. תרבות inoculum המכילים ריכוזים שונים של אתנול תמציות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות.
    5. לנתח את התפתחות חיידקים על פי צפיפות אופטית (microplate קורא) עכירות ושימוש ב- 590 nm לקביעת הריכוז המעכב המינימלי (MIC).
  4. ריכוז אחרים מינימום בדיקות
    1. לחסן µL 10 של תרבות נוזלי מכל קידוח של הבדיקה מיקרופון זה הציג אין צמיחה על גבי צלחת אגר.
    2. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה.
    3. לקבוע את פעילות אחרים על-ידי זיהוי הריכוז הנמוך ביותר שגילה אין התפתחות חיידקים גלוי. ריכוז שלגמרי מבטלת צמיחת תאים נחשב ריכוז חיידקי מינימלי (MBC).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

נציג נתונים חיוביים להפקת אתנול מוצגים בטבלה1. התשואה חומר יבש של פרופוליס ירוק מטייוואן היה קשור באופן חיובי הריכוז של אתנול. תמציות אתנול 95% ו- 99.5% היה החומר היבש הגבוה ביותר תשואה של פרופוליס ירוק מטייוואן. התשואה חומר יבש הנמוכה מפרופוליס ירוק מטייוואן אירעה כאשר המים שימש הממס החילוץ. תוצאות אלו מצביעות על העובדה הממס האורגני, כגון אתנול, מבצעת הטוב לחילוץ פרופוליס ירוק מטייוואן. האות של תקן propolins C, D, F ו- G זוהה, לכמת באמצעות HPLC (איור...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מחקר דיווחו כי השרייה, שאורכה, באמצעות ריכוזים שונים של אתנול, יכול לשמש עבור חילוץ פרופוליס ברזילאי17; עם זאת, התהליך היה זמן רב17. זה לקח לפחות 10 ימים כדי לחלץ את תרכובות ביו, כגון תוכן בעל תאים פנוליים, פרופוליס ברזילאי17. לחלופין, הפקת אתנול בשילוב עם חימום 37 ° C, 50 ° C או 70 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות הוצע לחילוץ פרופוליס ברזילאי19,21,22. נקבע כי תרכו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים יש ריהצהל.

תודות

כתב יד זה נערך על-ידי עריכה אקדמית וואלאס.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אתנולסיגמא-אולדריץ'E7023
נייר סינון מס' 4סיגמא-אולדריץ'WHA1004125
מתנולסיגמא-אולדריץ'34860
שלב הפוך RP-18 עמודהפנומנקס, בע"מ.00G-0234-E0
Staphylococcus aureusATCCBCRC 10780
Escherichia coliATCCBCRC 10675
מרק סויה טריפטיSigma-Aldrich22092
מרק תזונתיSigma-Aldrich70122
מטחנת
WaringWSG60K
קורא מיקרו-פלטותמכשירים מולקולרייםEMAX PLUS
HPLC מערכתאידוי1200
BÜ CHIRotavapor R-215
תבלינים דימתיל סולפוקסיד Sigma-Aldrich D2650 ואקום מסדרת Agilent

מקורות

  1. Zabaiou, N., et al. Biological properties of propolis extracts: Something new from an ancient product. Chemistry and Physics of Lipids. 207 (Pt B), 214-222 (2017).
  2. Bankova, V. B., De Castro, S. L., Marcucci, M. C. Propolis: Recent advances in chemistry and plant origin. Apidologie. 31 (1), 3-15 (2000).
  3. Park, Y. K., Alencar, S. M., Aguiar, C. L. Botanical origin and chemical composition of Brazilian propolis. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 50 (9), 2502-2506 (2002).
  4. Chen, C. N., Wu, C. L., Shy, H. S., Lin, J. K. Cytotoxic prenylflavanones from Taiwanese propolis. Journal of Natural Products. 66 (4), 503-506 (2003).
  5. Chen, C. N., Weng, M. S., Wu, C. L., Lin, J. K. Comparison of radical scavenging activity, cytotoxic effects and apoptosis induction in human melanoma cells by Taiwanese propolis from different sources. Evidence-Based Complementary and Alternative. 1 (2), 175-185 (2004).
  6. Chen, C. N., Wu, C. L., Lin, J. K. Apoptosis of human melanoma cells induced by the novel compounds propolin A and propolin B from Taiwanese propolis. Cancer Letters. 24 (1-2), 218-231 (2007).
  7. Huang, W. J., et al. Propolin G, a prenylflavanone, isolated from Taiwanese propolis, induces caspase-dependent apoptosis in brain cancer cells. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 55 (18), 7366-7376 (2007).
  8. Chen, Y. W., Ye, S. R., Ting, C., Yu, Y. H. Antibacterial activity of propolins from Taiwanese green propolis. Journal of Food and Drug Analysis. 26 (2), 761-768 (2018).
  9. Hegazi, A. G., Abd El Hady, F. K., Abd Allah, F. A. M. Chemical composition and antimicrobial activity of European propolis. Zeitschrift für Naturforschung. 55 (1-2), 70-75 (2000).
  10. Sforcin, J. M., Fernandes, A., Lopes, C. A. M., Bankova, V., Funari, S. R. C. Seasonal effect on Brazilian propolis antibacterial activity. Journal of Ethnopharmacology. 73 (1-2), 243-249 (2000).
  11. Chen, Y. W., et al. Characterization of Taiwanese propolis collected from different locations and seasons. Journal of the Science of Food and Agriculture. 88 (3), 412-419 (2008).
  12. Grange, J. M., Davey, R. W. Antibacterial properties of propolis (bee glue). Journal of the Royal Society of Medicine. 83 (3), 159-160 (1990).
  13. Kujumgiev, A., et al. Antibacterial, antifungal and antiviral activity of propolis from different geographic origins. Journal of Ethnopharmacology. 64 (3), 235-240 (1999).
  14. Krol, W., Scheller, S., Shani, J., Pietsz, G., Czuba, Z. Synergistic effect of ethanol extract of propolis and antibiotics in the growth of Staphylococcus aureus. Drug Research. 43 (5), 607-609 (1993).
  15. Lu, L. C., Chen, Y. W., Chou, C. C. Antibacterial and DPPH free radical-scavenging activities of the ethanol extract of propolis collected in Taiwan. Journal of Food and Drug Analysis. 11 (4), 277-282 (2003).
  16. Tosi, B., Donini, A., Romagnoli, C., Bruni, A. Antimicrobial activity of some commercial extracts of propolis prepared with different solvents. Phytotherapy Research. 10 (4), 335-336 (1996).
  17. Cunha, I. B. S., et al. Factors that influence the yield and composition of Brazilian propolis extracts. Journal of the Brazilian Chemical Society. 15 (6), 964-970 (2004).
  18. Woo, S. O., Hong, I. P., Han, S. M. Extraction properties of propolis with ethanol concentration. Journal of Apicultural Research. 30 (3), 211-216 (2015).
  19. Park, Y. K., Ikegaki, M. Preparation of water and ethanolic extracts of propolis and evaluation of the preparations. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 62 (11), 2230-2232 (1998).
  20. Ramanauskienė, K., Inkėnienė, A. M. Propolis oil extract: quality analysis and evaluation of its antimicrobial activity. Natural Product Research. 25 (15), 1463-1468 (2011).
  21. Machado, B. A., et al. Chemical composition and biological activity of extracts obtained by supercritical extraction and ethanolic extraction of brown, green and red propolis derived from different geographic regions in brazil. PLoS One. 11 (1), e0145954(2016).
  22. Monroy, Y. M., et al. Brazilian green propolis extracts obtained by conventional processes and by processes at high pressure with supercritical carbon dioxide, ethanol and water. The Journal of Supercritical Fluids. 130, 189-197 (2017).
  23. Popova, M., Chen, C. N., Chen, P. Y., Huang, C. Y., Bankova, V. A validated spectrophotometric method for quantification of prenylated flavanones in pacific propolis from Taiwan. Phytochemical Analysis. 21 (2), 186-191 (2010).
  24. Chen, L. H., et al. Taiwanese green propolis ethanol extract delays the progression of type 2 diabetes mellitus in rats treated with streptozotocin/high-fat diet. Nutrients. 10 (4), e503(2018).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מיצוי באתנולכרומטוגרפיה נוזלית בעתק גבוהניתוח פעילות אנטיבקטריאליתריכוז פרופוליןתנובת חומר יבשריכוז עיכוב מינימליHPLC פאזה הפוכהגלאי UV ב-280 ננומטרבדיקת דילול מיקרו-מדיה
חילוץ וניתוח של פרופוליס ירוק מטייוואן
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.