מאמר שיטה

זיהוי ליגנד מחייב תחום פעילות Dimerization אלפא קולטן אסטרוגן באמצעות וזמינותו שני-היברידית יונקים

DOI:

10.3791/58758

⸱

19 בדצמבר 2018

 , 
1Reproductive Developmental Biology Laboratory, National Institute of Environmental Health Sciences, National Institutes of Health (NIH)

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים שיטה לניתוח את 4-הידרוקסי-טמוקסיפן-תלוי הקולטן אלפא ליגנד מחייב תחום dimerization פעילות האסטרוגן שימוש בתרבית של שני-היברידית וזמינותו.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אלפא קולטן אסטרוגן (ERα) הוא הרגולטור שעתוק תלויות ליגנד-אסטרוגניים. הרצף של חלבון ERα מאוד כולו בין המינים. זה כבר חשבה כי תפקידו של האדם והעכבר ERαs הוא זהה. נדגים את ההשפעה דיפרנציאלית 4-הידרוקסי-טמוקסיפן (4OHT) על ERα ליגנד מחייב תחום (LBD) dimerization פעילות אנושית שימוש בתרבית של שני-היברידית (M2H) וזמינותו של עכבר. וזמינותו M2H יכולים להדגים את היעילות של פעילות של homodimerization LBD בתרבית של תאים, ניצול של תקנים של חלבון שני ביטוי פלסמידים (דנ א GAL4 מחייב תחום [DBD] פיוז'ן LBD ו- VP16 transactivation תחום [VP16AD] פיוז'ן LBD) ו- a אלמנט מגיב GAL4 (GAL4RE) התמזגו לוציפראז כתב פלסמיד. כאשר GAL4DBD פיוז'ן LBD ופיוז'ן VP16AD LBD להפוך דיימר בתאים, חלבון זה מורכב נקשר GAL4RE ומפעילה, ואז, ביטוי גנים לוציפראז דרך הפעילות תלויה שעתוק VP16AD. הפעלת לוציפראז בתיווך 4OHT הוא גבוה יותר בתאים HepG2 היו transfected עם העכבר ERα LBD פיוז'ן חלבון ביטוי פלסמידים יותר בתאים אנושיים ERα LBD פיוז'ן חלבון ביטוי פלסמיד transfected. תוצאה זו עולה כי יעילותם של העכבר 4OHT תלויי-ERα LBD homodimerization פעילות הוא גבוה יותר מאשר LBD ERα האנושית. באופן כללי, הניצול של וזמינותו M2H אינה אידיאלית עבור הערכת קולטן גרעיני LBD dimerization פעילות, כי היתה ללא-חת ליגנדים לשפר את רמת הבסיס של הפעילות LBD ופוגע זה הגילוי של פעילות dimerization LBD. . מצאנו שאת 4OHT אינו משפר פעילות הבזליים ERα LBD. זה גורם מפתח עבור היכולת לקבוע ולגלות את הפעילות dimerization LBD תלויי-4OHT לשימוש בהצלחה את הבדיקה M2H. ניתן להחיל מבוסס-ERα LBD מבחני M2H ללמוד את הפעילות אגוניסט חלקי של קולטן אסטרוגן סלקטיבי מאפננים (למשל, 4OHT) בסוגים שונים בתרבית של תאים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אלפא קולטן אסטרוגן (ERα) הוא הרגולטור שעתוק תלויות ליגנד-אסטרוגניים. Sequenceof חומצת אמינו ERα מאוד כולו בין המינים. בגלל הומולוגיה גבוה יותר בין בני האדם ואת העכבר ERα, הפונקציה של רצפטורים אלו נחשב כזהה ולאחר הפעילות דיפרנציאלית של חומרים אסטרוגניים (למשל, טמוקסיפן) של מינים אלו נגרמת על ידי ההבדלים המינים שיטות ההזנה כימי ולא על-ידי ההבדלים המבניים של ERα. ERα יש מאוד והתפאורה במבנים תחום נפוצה בקרב superfamily גרעיני קולטן (ע נ), איזור A לתחומים F. התחום E או תחום מחייב ליגנד (LBD) כוללת את הכיס ליגנד מחייב והפונקציה הפעלת גנים ברמת השעתוק 2, בשם AF-2. תחום F הוא מקומי ומייד בסמוך לקבוצת המחשבים E, הוא תחום משתנה ביותר בקרב NRs. גם בין האדם העכבר ERα, הו....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנה של פלסמידים וזמינותו שני-היברידית יונקים

  1. להשתמש את פלסמידים הבאים: pG5-לוק ', ' pBIND-ERαEF, ברית-ERαEF.
    הערה: פלסמידים הינם זמינים מן המחברים על פי בקשה, נשלחים על נייר סינון. pG5-לוק הוא פלסמיד כתב המכיל חמש חזרה של GAL4 אלמנטים מגיב התמזגו עם יחידת ביטוי לוציפראז (איור 1א'). pBIND-ERαEF הוא פלסמיד ביטוי חלבון LBD ERα GAL4DBD התמזגו חלבונים. pBIND-ERαEF מכיל יחידה ביטוי לוציפראז Renilla עבור נרמול היעילות תרביות תאים (איור 1B). ברית-ERαEF הוא פלסמיד ביטוי חלבון של החלבונים עם נתיך VP16AD LBD ERα (איור 1C). ....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור 3 מציגה את הערכה של תגובות אפשריות שילוב (i), שילוב (ii) פלסמיד transfected תאים. תוצאות הניסוי מוצגות באיור4. הפעילות של שילוב (i) (pG5-לוק + pBIND-mERαEF + ברית) מציג גירוי ב-10 ננומטר E2 (איור 4א'), כי LBD ERα מכיל קבוצת המחשבים פונקציונלי transactivation תלויי-ליגנד, AF-2. אגוניסט (למשל, E2) המאגד LBD ERα מגייס שעתוק coactivator(s) לתחום AF-2. אירוע זה גורם הפעלת גנ.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במסמך זה, אנחנו תיאר את פרוטוקול וזמינותו M2H, התמקדות התנאים assay לגילוי הפעילות homodimerization של ERα LBD כדוגמה. באופן כללי, וזמינותו M2H הוא לא פופולרי להערכה של תלויות ליגנד-ERα LBD dimerization פעילות. זאת בשל LBD ERα הפו פונקציה הפעלת גנים ברמת השעתוק; הפעילות אשר מפריע, במקרים מסוימים, תוצאות וזמינותו M2H. עם זאת, כפי שאנו מדגימים כאן, וזמינותו M2H יכול לשמש לניתוח הפעילות dimerization LBD של חומרים מסוימים אשר לא אבצע את תפקוד transactivation AF-2 LBD (למשל, 4OHT, SERMs). כדי להפחית את הפעילות הפנימי.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים יש ריהצהל.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים ד"ר Sueyoshi ו וואנג-נבחרת המכון למדעי בריאות הסביבה (NIEHS) שלהם לקריאה ביקורתית של כתב היד, וכן טאנר ג'פרסון על ביצוע הליכים על הוידאו. עבודה זו נתמכה על ידי מוסדות לאומיים של בריאות גרנט 1ZIAES070065 (ל K.S.K.) מן החלוקה של מגזר בחקר NIEHS.

....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
pG5-LucPromegaE249Aרכיב של מערכת דו-היברידית של יונקים
CheckMate pBINDPromegaE245Aרכיב של מערכת דו-היברידית של יונקים CheckMate
pACTPromegaE246Aרכיב של מערכת דו-היברידית של יונקים
CheckMate One Shot TOP10 מוכשר כימית E. coliInvitrogenC404010
צנטריפוגה רוטורSORVALL75006445
דליי נדנדהSORVALL
(CRA)PromegaA7112
תמיסת ליזה של תאים (CLA)PromegaA7122
תמיסת נטרול (NSA)PromegaA7131
תמיסת שטיפת עמודים (CWB)PromegaA8102
אשף Midipreps שרף לטיהור DNAPromegaA7701
אשף MidicolumnsPromegaA7651
MEM, ללא גלוטמין, ללא פנול אדוםGibco51200038
L-גלוטמין (200 מ"מ)GibcoA2916801
0.5% טריפסין-EDTA (10x)Gibco15400054
פניצילין-סטרפטומיצין (100x)סיגמא-אולדריץ'P0781
ספסל סימן סרום בקר עוברי (FBS)Gemini-Bio100-106מומת בחום
:דקסטרן הפשטת סרום בקר עובריGemini-Bio100-119מומת בחום
, גלוקוז גבוה, ללא גלוטמין, ללא פנול אדוםGibco31053028לטרנספקציה ליפופקטמין
2000Invitrogen11668027
פסיבי ליזה 5X מאגרPromegaE1941
כפול-לוציפראז מדווח מערכת בדיקהPromegaE1980
SpectraMax L microplate קוראמכשירים מולקולריים SoftMax
Pro תוכנהמכשירים
תמיסת השעיה מחדש של תאים 75006441 פחם DMEM מולקולריים

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Arao, Y., Korach, K. S. The F domain of estrogen receptor α is involved in species-specific, tamoxifen-mediated transactivation. Journal of Biological Chemistry. 293 (22), 8495-8507 (2018).
  2. Brzozowski, A. M., et al. Mo....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

4 Hydroxy TamoxifenDNA GAL4VP16HepG2

מאמרים קשורים