ריבוב ממוקד אולטרסאונד גירוי עם מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית

סיכום

בעוצמה נמוכה פעמו אולטרסאונד גירוי (LIPUS) הוא מודאליות עבור גירוי מכני לא פולשנית של תאים אנדוגני או מהונדסים עם רזולוציה גבוהה של יכולות. מאמר זה מתאר כיצד ליישם את LIPUS כדי במיקרוסקופ epi-זריחה וכיצד למזער את אי התאמה של עכבה אקוסטיים לאורך השביל אולטרסאונד כדי למנוע חפצי מכני לא רצויים.

תקציר

על ידי התמקדות פולסים אולטרה סאונד בעוצמה נמוכה לחדור רקמות רכות, LIPUS מייצג טכנולוגיה ביו מבטיח מרחוק ובבטחה לתפעל ירי עצבית, הפרשת ההורמונים ותאים מחדש מבחינה גנטית. עם זאת, התרגום של טכנולוגיה זו עבור יישומים רפואיים היא כיום הקשו על ידי חוסר של מנגנונים הביו-פיסיקלי שבו ממוקד רקמות הגיוני ולהגיב LIPUS. בגישה מתאימה כדי לזהות מנגנונים אלה יהיה לשימוש אופטי ביולוגיים בשילוב עם LIPUS כדי לקבוע שבבסיס איתות המסלולים. עם זאת, יישום LIPUS כדי מיקרוסקופ פלורסצנטיות יכול להכיר רצויה חפצי מכני בשל נוכחותם של ממשקים פיזיים לשקף, לספוג, מסיטים גלים אקוסטיים. מאמר זה מציג הליך שלב אחר שלב כדי לשלב את LIPUS כדי זמין מסחרית זקוף epi-זריחה מיקרוסקופים תוך מזעור ההשפעה של ממשקים פיזיים לאורך השביל אקוסטית. הליך פשוט מתואר לפעול מתמר אולטרסאונד רכיב אחד וכדי להכניס את אזור מוקד של המתמר מוקד אובייקטיבית. השימוש LIPUS מודגם עם דוגמה של סידן LIPUS-induced שנחשולי בתאים בתרבית גליובלסטומה האדם נמדד באמצעות הדמיית סידן.

מבוא

מחלות רבות דורשות צורה כלשהי של התערבות רפואית פולשנית. הליכים אלה לעיתים יקר, מסוכן, דורשים ותקופות התאוששות, ובכך להוסיף נטל מערכות הבריאות. פולשני שיטות טיפוליות יש פוטנציאל לספק חלופות בטוחות יותר וזול יותר ניתוחים קונבנציונלי. אולם, לגישות פולשני כגון גירוי מגנטי pharmacotherapy או טראנס מוגבלים לעיתים קרובות על ידי הפשרות בין חדירה לרקמות, ייתכן רזולוציה ואפקטים את המטרה לא רצויים. בהקשר זה, אולטרסאונד ממוקד מהווה טכנולוגיה לא פולשנית מבטיחה עם פוטנציאל לתמרן תפקודים ביולוגיים עמוק בתוך רקמות עם רמת דיוק גבוהה ייתכן ואפקטים את המטרה מוגבל.

אולטרסאונד ממוקד גירוי מורכב אספקת אנרגיה אקוסטית-מיקומים מדויקים עמוק בתוך אורגניזמים חיים. בהת....

פרוטוקול

1. גידול תאים על הסרט פוליאסטר שקוף המתקפלות

1. תרגיל בגודל 12 מ"מ חור בתחתית לצלחת תרבות רגיל 35 מ מ באמצעות העיתונות-תרגיל אנכי. את התרגיל לאט לאט, לענוד הגנה העין. הסר את חתיכות הפלסטיק המצורף בתחתית המנה באמצעות סכין כדי ליצור משטח חלק בצד החיצוני (איור 2).
2. למרוח שכבה דקה של ימית-כיתה אפוקסי או דבק על פני השטח החיצוני התחתון של המנה.
3. במקום סרט של פוליאסטר (עובי 2.5 מיקרומטר) נגד מהמשטח התחתון חיצוני של המנה ולחץ בחוזקה כדי לוודא שהאפוקסי/הדבק מתפשט באופן שווה בין הסרט לבין משטח הפלסטיק עבה. משוך בעדינות את הסרט בצורה צנטריפוגלי עם האצבעות כדי ליצור משטח שטוח (איור 2).
4. ....

תוצאות

איור 5 הוא דוגמה של ניסוי LIPUS מרובב עם סידן הדמיה. Glioblastoma תאים (A-172) היו גדל על EMPM מצופה פוליאסטר סרט בינוני תרבות רגיל (בתוספת 10% סרום ו 1% אנטיביוטיקה), מודגרות עם הכתב פלורסנט סידן רגיש Fluo-4 בבוקר. התאים היו עם תמונה באמצעות עדשה טבילה X 10 ומאוירות מקור אור LED לבן, אור זריחה נאסף באמצעות ערכה רגילה של מסנן ה-GFP. LIPUS הונחה על ידי באופן ידני על-ידי סחרור מתמר 4 מגה-הרץ עם צורת גל דופק 158 V משרעת השיא אל שיא, 0.1 ms הדופק משך, תדירות החזר.......

דיון

יתרון הראשי של אולטרסאונד ממוקד היא היכולת שלה לא-פולשנית להעביר אנרגיה מכנית ו/או תרמית דגימות ביולוגיות עם דיוק גבוהה-עתיים. טכניקות אחרות שנועדו מכנית לעורר תאים בדרך כלל מעסיקים רגשים הפיזית פולשני (למשל, תא-מציץ) או דורשת את האינטראקציה של קרני לייזר באנרגיה גבוהה עם חפצים זרים (למשל, מלקחיים אופטיים). חימום מגנטי יכול לחמם מיקומים מרחביים ספציפיים בתוך דגימות ביולוגיות, אך דורשת הנוכחות של חלקיקים מגנטיים זרים. מצד שני, חימום לא פולשנית מדויקת של מדגם קטן (למשל, תרביות תאים) בתקשורת מימית.......

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מיקרוסקופ זקוף עם נפח עבודה גדול	Thorlabs	CERNA
מיקרוסקופ זקוף עם נפח עבודה גדול	Scientifica	SliceScope
רכיבים אופטומכניים	Thorlabs	n/a
הידרופון מחט	ONDA Corporation	סדרת HNP/C/R/A/T + AH/G קדם-מגבר
הידרופון	מחט דיוק אקוסטיקה	n/a
הידרופון סיבים אופטיים	ONDA Corporation	HFO
סדרת הידרופון סיבים אופטיים	אקוסטיקה מדויקת	n/a
אוסילוסקופ	Keysight Technology	DSOX2004A (4 ערוצים 70MHz)
מחולל פונקציות	Keysight Technology	33500B (20MHz ערוץ יחיד)
מגבר כוח RF	תעשיות ניווט אלקטרוניות (ENI)	325LA, 525LA, 240L, 350L, A075, 2100L, 3100LA
מגבר כוח RF	אלקטרוניקה & חדשנות (E& I)
מתמר אולטרסאונד טבילה	משדרי		אולימפוס
מתמר אולטרסאונד טבילה	מכשיר Benthowave	מתמר HiFu מתמר אולטרסאונד טבילה מסדרת
	אקוסטיקה	מדויקת מתמרי פייזו-קרמיקה או HiFu
		מתמרי HiFu המיוצרים לפי הזמנה
בצפיפות גבוהה Matrigel	Corning	VWR 80094-330
סרט מיילר 2.5 מיקרון	Chemplex	CAT.NO:107

טבילה ממוקדים BII-76 מתמר אולטרסאונד טבילה Ultrasonic-S-lab