מאמר שיטה

הדור של סרטן התא שיבוטים כדי להמחיש Telomeric המכילים חוזר RNA טרה הביע מ טלומר יחיד בתאים חיים

DOI:

10.3791/58790

⸱

17 בינואר 2019

 ,  ,  , 
1Laboratory of Cell Biology and Molecular Genetics, Department of Cellular, Computational and Integrative Biology - CIBIO, University of Trento, 2Department of Life Sciences, University of Trieste

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצירת סרטן התא שיבוטים המכיל תגית רצף MS2 ב subtelomere יחיד. גישה זו, בהסתמך על מערכת MS2-GFP, מאפשרת הדמיה של התרשימים אנדוגני של telomeric המכילים חוזר RNA (TERRA) הביע מ טלומר יחיד בתאים חיים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טלומרים משוקלטים, והוליד telomeric המכילים חוזר זמן noncoding RNAs (TERRA), אשר הוצעו כדי לשחק תפקידים חשובים בביולוגיה טלומר, כולל היווצרות הטרוכרומטין טלומר אורך הומאוסטזיס. הממצאים האחרונים גילה כי מולקולות טרה גם לקיים אינטראקציה עם אזורים פנימיים כרומוזומלית להסדיר ביטוי גנים בתאי גזע עובריים (ES) העכבר. בקנה אחד עם הראיות, קרינה פלואורסצנטית RNA ניתוחים בחיי עיר הכלאה (RNA-דג) הראו כי רק תת-ערכה של טרה תעתיקים לשפה קצותיו כרומוזום. הבנה טובה יותר של הדינמיקה של מולקולות טרה נעזור להגדיר פונקציה ואת מנגנוני הפעולה שלהם. כאן, אנו מתארים שיטה כדי לתייג והמחש יחיד-טלומר תעתיקים טרה בתאי סרטן באמצעות מערכת MS2-GFP. לכוונה זו, אנו מציגים פרוטוקול כדי ליצור שיבוטים יציב, באמצעות AGS שהבטן האנושית סרטן תא קו, המכיל רצפי MS2 משולב ב subtelomere יחיד. תמלול של טרה מ טלומר מתויג MS2 תוצאות הביטוי של מולקולות מתויג MS2 טרה הם דמיינו ידי קרינה פלואורסצנטית לחיות תאים במיקרוסקופ על ביטוי משותף של חלבון מחייב MS2 RNA דבוקה GFP (MS2-GFP). גישה זו מאפשרת לחוקרים ללמוד את הדינמיקה של יחיד-טלומר טרה מולקולות בתאים סרטניים, ניתן להחיל אותה על שורות תאים אחרים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טרה RNA noncoding זמן הוא עיבד מאזור subtelomeric של כרומוזומים, שעתוק שלה ההכנסות לכיוון הקצוות כרומוזום, הפסקת בתוך בדרכי. אני חוזר telomeric1,2. מסיבה זו, טרה תעתיקים מורכב subtelomeric, נגזר רצפים בסוף 5' ולסיים עם telomeric חזרה (UUAGGG גולגולת)3. חשוב תפקידי הוצעו על TERRA, כולל הטרוכרומטין היווצרות-טלומרים4,5, ה-DNA שכפול6, קידום רקומבינציה הומולוגית בין כרומוזום מסתיים7,8 , 9, ויסות טלומר מבנה10ו טלומר אורך הומאוסטזיס2,11,12,13. יתר על כן, טרה תעתיקים אינטראקציה עם אתרים רבים extratelomeric להסדיר ביטוי גנים נרחבת תאי גזע עובריים (ES) העכבר14. בקנה אחד עם אלה ראיות, קרינה פלואורסצנטית RNA בחיי עיר הכלאה ניתוחים (RNA-דג) הראו כי רק תת-ערכה של טרה הפרוטוקולים לשפה טלומרים1,2,15. בנוסף, טרה דווח טופס גרעיני אגרגטים לוקליזציה על הכרומוזומים X ו- Y העכבר תאים2,16. ממצאים אלה מצביעים על TERRA תעתיקים לעבור דינמיקה מורכבת בתוך הגרעין. הבנת הדינמיקה של מולקולות טרה תסייע להגדיר פונקציה ואת מנגנוני הפעולה שלהם.

מערכת MS2-GFP כבר בשימוש נרחב כדי להמחיש מולקולות RNA בתאים חיים של אורגניזמים שונים17,18. מערכת זו שימש בעבר כדי לתייג והמחש יחיד-טלומר מולקולות טרה cerevisiae ס12,19. באמצעות מערכת זו, זה היה לאחרונה הוכיח כי שמרים טרה תעתיקים בתרגום בתוך הציטופלסמה במהלך שלב shift פוסט-diauxic, רומז כי טרה לנצל פונקציות extranuclear20. השתמשנו לאחרונה מערכת MS2-GFP ללמוד יחיד-טלומר תעתיקים טרה סרטן תאים21. לכוונה זו, אנחנו מועסקים CRISPR/Cas9 הגנום כלי עריכה כדי לשלב את רצפי MS2 ב טלומר יחיד (טלומר 15q, להלן Tel15q) וקיבלתי שיבוטים ביטוי מתויג MS2 אנדוגני Tel15q טרה (TERRA-MS2 שיבוטים). ביטוי שיתוף התמזגו-GFP MS2 RNA מחייב חלבון (MS2-GFP) מזהה ומאגד רצפי MS2 RNA מאפשר החזיית יחיד-טלומר טרה תעתיקים חי תאים21. המטרה של פרוטוקול מאויר כאן היא לתאר בפירוט את הפעולות הדרושות עבור הדור של טרה-MS2 שיבוטים.

כדי ליצור שיבוטים טרה-MS2, קלטת MS2 משולב בתוך האזור subtelomeric של טלומר 15q, במורד הזרם של טרה יזם האזור ואת שעתוק התחלה האתר. בקלטת MS2 מכילה גן עמידות neomycin ולצדו אתרי סלומון-p, בהיותה אינטגרטיבית-subtelomere 15q מתבצעת באמצעות מערכת CRISPR/Cas922. לאחר תקנים של MS2 קלטת, יחיד שיבוטים שנבחרו subtelomeric שילוב של הקלטת מאומת על ידי ה-PCR, כתם DNA רצף ובדרום. שיבוטים חיובי נגוע אדנו לבטא-Cre למען הסר סמן הבחירה בקלטת, עוזב רק רצפי MS2 ואתר לקס יחיד-p-subtelomere 15q. הביטוי של טרה מתויג MS2 הפרוטוקולים מ Tel15q מאומתת על ידי RT-qPCR. בסופו של דבר, בא לידי ביטוי החלבון פיוז'ן MS2-GFP ב- TERRA-MS2 שיבוטים דרך זיהום retroviral כדי להמחיש תעתיקים MS2-טרה על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ. טרה תעתיקים אפשר לזהות בקלות בעזרת RNA-דג, הדמיה לחיות תאים באמצעות telomeric חוזר ספציפי רגשים1,2,15,23. גישות אלה לספק מידע חשוב על הלוקליזציה של מכלל האוכלוסייה של טרה מולקולות ברזולוציה תא בודד. הדור של שיבוטים המכיל רצפי MS2 ב subtelomere יחיד יאפשר לחוקרים ללמוד את הדינמיקה של יחיד-טלומר תעתיקים טרה בתאים חיים, אשר יסייע להגדיר את תפקוד ואת מנגנוני הפעולה של טרה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הבחירה של שיבוטים Neomycin עמיד

  1. לגדל תאים AGS במדיום F-12_K של חזיר (Kaighn), בתוספת 10% עוברית שור סרום (FBS), 2 מ מגלוטמין פניצילין (0.5 יחידות לכל מיליליטר בינוני), סטרפטומיצין (0.2 µg לכל מיליליטר בינונית)-CO 37 ° C ו-5%2. Transfect התאים ב- 50-60% בשילוב עם sgRNA/Cas9 להביע וקטור, בקלטת MS2 בעשר: 1 יחס טוחנת21.
    הערה: בניסוי מקביל, לאמת תרביות תאים יעילות על ידי transfecting GFP-להביע וקטור (קרי, Cas9-GFP וקטורית). לפחות צריך להיות מושגת יעילות תרביות תאים 60-70%.
  2. למחרת, החלף את המדיום culturing בינוני המכיל neomycin-µg/mL 0.7 הסופי ריכוז (סלקטיבית בינוני).
    הערה: פיצול התאים, זריעה אותם אמצעי סלקטיבי יום אחרי תרביות תאים יזרז את תהליך הבחירה. כל התאים שאינם transfected ימותו מיד. אם תרביות תאים מבוצע ב 6 צלחות טוב, ובמקרה מכל קידוח ב 60% הנהרות יכיל כ 0.7 x 106 תאים, למחרת היום שניתן לפצל את התאים מבאר יחיד למדיום 10 ס מ מאכל המכיל סלקטיבי.
  3. לשמור את התאים במדיום סלקטיבי במשך 7-10 ימים, שינוי בינוני כל אחד או יומיים, עד יחיד שיבוטים גלויים.
  4. איסוף של שיבוטים תא
    1. להכין צלחת טוב 96 המכיל 10 µL של 0.25% טריפסין כל היטב.
      הערה: להכין שני 96 צלחות טוב למקרה שיבוטים יותר מ 96 צפויים להיבחר.
    2. עם השימוש של מיקרוסקופ, לסמן את המיקום של כל המשובטים גלוי בצלחת 10 ס מ על-ידי הפיכת נקודה בחלק התחתון של המנה באמצעות סמן. כל נקודה יתאים למושבת לאסוף אותם.
    3. החלף את המדיום culturing עם מספיק פוספט Buffered מלוחים (PBS) יוצרים סרט דק של נוזל על השיבוטים ולתת לא התאים יבש במהלך האיסוף שיבוט.
    4. לבחור אחת המושבות באמצעות פיפטה של 10 µL. לצרף את הטיפ המכיל 5 µL של טריפסין למושבה ולשחרר לאט טריפסין אשר יישאר מקומי על המושבה. לאפשר טריפסין לנתק את התאים עבור 1 דקות, ואז לגרד את המושבה עם הקצה תתמודד לתוך הקצה.
      הערה: במהלך הליך זה, היפוך המנה קצת בצד אחד אז כדי להקטין את הנפח של PBS סביב המושבה להיבחר יעזור בתהליך איסוף על ידי הימנעות דילול של טריפסין סביב המושבה. באמצעות טבעת גומי עשוי גם לסייע לאסוף שיבוטים יחיד.
    5. מקם את התאים מהמושבה לבאר של צלחת טוב 96 המכיל 10 µL של טריפסין 0.25%.
    6. דגירה 5 דקות בטמפרטורת החדר, ואז למלא את הבאר µL 150 סלקטיבי בינוני (F - 12K של חזיר (Kaighn) בינוני בתוספת 10% FBS, 2 מ מגלוטמין, פניצילין (0.5 יחידות לכל מיליליטר בינוני), סטרפטומיצין (0.2 µg לכל מיליליטר בינוני), המכיל neomycin ב ריכוז של 0.7 µg/mL.
      הערה: במהלך זמן הדגירה שיבוטים אחרים יכולים לבחור בהם. מומלץ לבחור שיבוטים רבים ככל האפשר. עוד שיבוטים נאספות יהיה גבוה יותר הסיכויים לזיהוי אלה חיובית.
    7. ברגע השיכפולים בחרה והעבירו בצלחת טוב 96, מאפשרים לתאים לגדול לכמה ימים סלקטיבי בינוני בינוני F - 12K של חזיר (Kaighn) בתוספת 10% FBS, 2 מ מגלוטמין, פניצילין (0.5 יחידות לכל מיליליטר בינוני), סטרפטומיצין (0.2 µg לכל mL בינוני), המכיל neomycin-ריכוז של µg/mL 0.7-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2, עד שהגיע למפגש 90%.
  5. פיצול של שיבוטים
    1. להכין שלוש צלחות טוב 96 מצופה עם ג'לטין על-ידי הוספת 100 µL של ג'לטין לכל טוב, תקופת דגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן לשטוף פעמיים עם PBS. הצלחות האלה ישמש להפקת DNA (DNA צלחת) ועבור שיבוט קפוא (צלחות ההקפאה).
      הערה: ג'לטין תקדם את הקובץ המצורף של התאים ושל ה-DNA הבארות. בפרט, ציפוי הג'לטין יאפשר את ה-DNA מקל בתחתית הבארות במהלך הפקת דנ א. ולשטוף הליכים (נדון להלן). במהלך ההליך פיצול-שיבוט, מומלץ להשתמש עם פיפטה רב-ערוצי.
    2. ברגע שיבוטים להגיע למפגש 90%, תשאף בינוני מכל קידוח של צלחת טוב 96 לשטוף עם PBS, להוסיף 30 µL של 0.25% טריפסין לכל טוב, תקופת דגירה של 5 דקות ב 37 º C.
      הערה: יגדל בקצב שונה, אשר גם תלוי מספר התאים בחרה לכל שיבוט שיבוטים. לפיכך, צעד זה יבוצעו במהלך מספר ימים כאשר שיבוטים שונות להגיע למפגש 90%.
    3. להוסיף µL 70 סלקטיבי בינוני לכל טוב, לשבש גושים תא על-ידי pipetting למעלה ולמטה בתוך הבארות, ואז להעביר 30 µL של µL 100 הצלחת ה-DNA gelatinized שמולאו מראש עם 120 µL סלקטיבית בינוני לכל µL טוב ו-30 כדי gelatinized מקפיא צלחות שמולאו מראש העד h 50 µL בינונית (ללא בחירה).
    4. מקם את הצלחת ה-DNA בחממה ולאפשר לתאים לגדול ב 37 ° C ו 5% CO2 עד 90% הנהרות.
    5. להוסיף µL 80 של קרח טריות 2 x קפוא בינוני (80% FBS ו-20% דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד)) כל טוב של צלחת קופא, להוסיף מצלמות-מיקרוסקופים (ריסס עם 70% אתנול) על גבי הלוח כדי לאטום כל טוב, למקם את המכסה העליון, לעטוף את הצלחת עם רדיד אלומיניום. המקום הקפאת צלחות ב-80 מעלות צלזיוס.
    6. הוסף µL 90 סלקטיבי בינוני לכל טוב טוב המקורי 96 לצלחת המכילה שיבוטים פוצלו ולהשאיר אותה בתרבות עד ה-PCR הקרנת תוצאות. הצלחת הזו תשמש כמו צלחת גיבוי.

2. הקרנת שיבוטים Neomycin עמיד

  1. מיצוי DNA מהצלחת דנ א טוב 96.
    1. ברגע שיבוטים תרבותי בצלחת דנ א להגיע למפגש 90%, לשטוף 2 פעמים עם PBS, ולאחר מכן lyse עם מאגר פירוק µL 50 (10 מ מ טריס pH 7.5, 10 מ מ EDTA, 10 מ מ NaCl מרחביות 0.5%, 1 מ"ג/מ"ל proteinase K). כיסוי לצלחת עם מצלמות-מיקרוסקופים, איטום אחד טוב, שים את המכסה, לכסות עם הניילון הנצמד, במקום בגיל 37 º C למשך הלילה.
    2. להוסיף 100 µL קר אתנול (Et-OH) / פתרון NaCl (0.75 מ' NaCl ב- 100% אתנול) לכל אחד טוב לזרז במשך 6 שעות או ללילה בטמפרטורת החדר.
      הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן.
    3. להסיר את הפתרון Et-הו/NaCl על-ידי היפוך את הצלחת ולשטוף 3 פעמים עם 200 µL של 70% אתנול לכל טוב.
    4. להוסיף 25 µL של פתרון RNAse A במים מזוקקים, דגירה ב 37 ° C עבור 1 h.
  2. השתמש µL 3 של ה-DNA גנומי PCR הגברה. לבצע PCR הקרנת שיבוטים שנבחרו באמצעות תחל חישול בתוך גן עמידות neomycin, subtelomere 15q. PCR-הגברה מתבצעת באמצעות אנזימים פולימראז רגיל ו- PCR פרוטוקולים21.
    הערה: תנאים PCR MS2 צבעי יסוד (פריימר MS2-subtel15q-פריימר-S ו- MS2 בתור), תחל CTR (CTR ראש S ו- CTR פריימר כמו) הן הבאות: 98 ° C עבור 20 s שלב דנטורציה, ואז 34 מחזורים ב 98 ° C 10 s, 58 מעלות 20 s, s ° 72 ג 15 , באמצעות האנזים פולימראז µL 25 תגובה לערבב (ראה טבלה של חומרים). פריימר רצפים מסומנים בטבלה1.
  3. להפעיל תגובות PCR agarose ג'ל ולחלץ להקות PCR המתקבלים שיבוטים חיובי באמצעות ג'ל רגיל מיצוי הליכים (ראו טבלה של חומרים ג'ל החילוץ ריאגנטים).
  4. לבצע ניתוח רצפי ה-DNA של המוצר PCR ג'ל, חילוץ לאישור נוכחות של רצפי MS221.
    הערה: רצף הבדיקות ניתן לבצע באמצעות תחל את המשמש ההקרנה PCR.
  5. תספיג דנ א ההקרנה של PCR חיובית שיבוטים
    1. לגדול השיבוטים חיובי ב- PCR והקרנה רצף מהצלחת המקורית 96 היטב (את הצלחת גיבוי) כדי 6 צלחות היטב במדיום F - 12K של חזיר (Kaighn), בתוספת 10% FBS, 2 מ מגלוטמין, פניצילין (0.5 יחידות לכל מיליליטר בינוני), סטרפטומיצין (0.2 µg לכל mL בינוני), המכיל neomycin-ריכוז של µg/mL 0.7-37 ° C 5% CO2.
      הערה: לחלופין, אם חלק שיבוטים אלה אבדו, להפשיר אותם באחד הלוחות קפוא (ראה פרוטוקול 2.6).
    2. ברגע השיבוטים נמצאים 90% זרימה בתוך הצלחת טוב 6, לשטוף את התאים עם PBS ולהוסיף µL 250 פירוק מאגר המכיל proteinase µg 0.5 K לכל טוב.
    3. לגרד את התאים באמצעות מגרד תא ולהעביר את lysate צינור 1.5 מ.
    4. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 16 שעות.
    5. להוסיף 1 מ"ל של 100% אתנול, לנער נמרצות, ולאפשר את ה-DNA לזרז לפחות 2 h או למשך הלילה ב-20 ° C.
      הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן.
    6. ספין-13,400 x ג'י ב- 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, למחוק את תגובת שיקוע, לשטוף את כדורי עם 70% אתנול. תנו לאוויר כדורי יבש בטמפרטורת החדר. לחלופין, השתמש concentrator ואקום.
    7. Resuspend את כדורי ה-DNA ב- 50 µL של מים מזוקקים המכילים RNAse A ואת תקופת דגירה של h 1-37 מעלות צלזיוס.
    8. לעכל µg 5-10 של ה-DNA גנומי באמצעות אנזימי הגבלה NcoI ו- BamHI (שני digestions עצמאית) בכרך התגובה µL 100 על ידי המקננת עיכול תגובות ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    9. הרץ 4 µL של העיכול agarose ג'ל (0.8% agarose) לאישור עיכול מלאה.
    10. להוסיף 1/10 נפח של סודיום אצטט פתרון 3 מ' pH 5.2 ו- 2 כרכים של 100% אתנול לתגובות עיכול הגבלה, דגירה לפחות 2 h או למשך הלילה ב-20 ° C, כדי לזרז את הדנ א.
      הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן.
    11. צנטריפוגה ב g x 13,400 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות, למחוק את supernatants, לשטוף את כדורי עם 70% אתנול. לאפשר את כדורי מהאוויר יבש בטמפרטורת החדר. לחלופין, השתמש concentrator ואקום.
    12. Resuspend כדורי ב 20 µL של מים מזוקקים, לטעון את ה-DNA מתעכל על ג'ל agarose 0.8%.
      הערה: עבור רזולוציה טובה יותר של ה-DNA מעוכל, להכין ג'ל לפחות 15 ס"מ זמן ולרוץ בין לילה מתח נמוך (̴30 וולט). צריך להיות מותאם אלקטרופורזה הגדר.
    13. למחרת, מכתים את הג'ל עם סוכן labelling דנ א, כגון אתידיום ברומיד-ריכוז סופי 1 מ"ל µL/10, למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, להצטלם עם סרגל קרוב הג'ל על ג'ל הדמיה כלי נגינה.
    14. הגדר את ההעברה של ה-DNA קרום ניילון ולבצע ממברנה הכלאה גשש רצף ספציפי MS2 באמצעות הליכים סטנדרטיים21.
    15. הפשרת שיבוטים הם חיוביים ב- PCR, DNA רצף ובדרום חשופה מאחד שתי צלחות קפוא (ראה שלב הבא).
  6. הפשרתו של שיבוטים
    1. להכין אחד 15 מ"ל שפופרת המכילה 5 מ"ל F - 12 K של חזיר מראש ומחוממת בינוני (Kaighn) בתוספת 10% FBS, 2 מ מגלוטמין פניצילין (0.5 יחידות לכל מיליליטר בינוני), סטרפטומיצין (0.2 µg לכל מיליליטר בינוני) עבור כל המשובטים להיות הקרת.
    2. הסר באחד הלוחות מקפיא-80 ° ולהוסיף µL 100 F12K מראש ומחוממת בינוני מלא טוב המכיל השיבוט חיובי כדי להיות הקרת.
      הערה: הליך זה צריך להתבצע במהירות, הצלחת היטב 96 להניחה על קרח יבש לאחר כל המשובטים מופשר הוא, על מנת לאפשר שיבוטים אחרים להישאר קפואה. הדבר חשוב במיוחד אם מספר שיבוטים צריך להיות הקרת מ באותה צלחת טוב 96.
    3. העבר את התאים הצינור 15 מ"ל המכיל 5 מיליליטר בינונית, צנטריפוגה ב 800 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    4. האחות של המדיום, resuspend תאי µL 500 מראש ומחוממת בינוני F12K מלאה, להעביר כל המשובטים טוב יחיד של צלחת טוב 12.
  7. חיסול של הגן ההתנגדות neomycin מ בקלטת MS2 משולב ב subtelomere 15q.
    1. לאפשר שיבוטים לגדול מצלחת טוב 12 צלחת 10 ס מ בינוני F12K מלאה.
      הערה: Neomycin לא ייכללו בטווח הבינוני אלא אם צוין אחרת.
    2. להוסיף את הבעת-Cre אדנו התאים בתרבית בקערה 10 ס מ- 70% זרימה של 10 מ"ל של מדיום F12K מלאה.
      הערה: שימוש אדנו לביטוי של Cre-GFP תאפשר הערכה של היעילות של זיהום, אשר צריך לגשת 100%. אדנו שכפול תקינה יאבדו לאחר כמה קטעים בתרבות.
    3. 48 שעות לאחר ההדבקה, לפצל את התאים במנות 10 ס מ 3. שתי מנות ישמש עבור אימות של הסרת ג'ין neomycin לפי בחירה שלילי, גדל התאים המכילים neomycin בינוני (צלחת קודם), ולא על ידי הדרומי כתם (תבשיל השני).
    4. תרבות המנה השלישית המכיל שיבוט תא הקפאה, החילוץ-RNA.

3. אימות של טרה-MS2 ביטוי התעתיק לפי RT-qPCR

  1. עם האימות של הסרת ג'ין neomycin, מבצע החילוץ-RNA הכולל של טרה-MS2 שיבוטים שימוש בממסים אורגניים (פתרון פנול, guanidine isothiocynate)21.
    1. Resuspend את הרנ א מופק צלחת 10 ס מ ב- 100 µL diethyl pyrocarbonate (DEPC) מים.
    2. הרץ 3 µL של RNA denaturating (1% פורמלדהיד המכילות) 1 x 3-(N-Morpholino) propanesulfonic חומצה (MOPS) ג'ל על מנת לוודא ריכוז והתקינות של הרנ א. גם לנתח את ריכוז ה-RNA באמצעות ספקטרופוטומטרים.
    3. לטפל µg 3 של RNA עם DNAse אני משתמש 1 יחידה של DNAse אני האנזים בנפח 60 של התגובה האחרונה µL.
    4. דגירה התגובה עבור h 1-37 מעלות צלזיוס.
  2. הפוך ניתוחים התגובה ואת qPCR שעתוק
    1. הוספת הרכיבים הבאים צינור ללא נוקלאז microcentrifuge: µL 2 מיקרומטר 1 טרה פריימר ספציפי, µL 1 של dNTPs מיקס (10 מ מ כל אחד), µL 6 של RNA התייחסתי DNAse (תואם ל̴300ng RNA). לכוון את עוצמת הקול כדי µL 13 עם 4 µL DEPC מים.
      הערה: עבור כל RNA להיות מנותח, צינור השני המכיל את ריאגנטים אותו אבל פריימר ספציפי הפניה, במקום תחל ספציפי טרה, צריך להיות מוכן.
    2. מחממים את התערובת עד 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, דגירה קרח לפחות 1 דקות.
    3. לאסוף את התוכן של הצינורות על ידי צנטריפוגה קצר ולהוסיף 4 µL של 5 X RT האנזים מאגר, dithiothreitol 0.1 M 1 µL (DTT), µL 1 (4 יחידות) של מעכב RNAse ולאחר µL 1 של רוורס טרנסקריפטאז (ראה טבלה של חומרים).
    4. דגירה בדגימות ב 42 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות, ולאחר מכן להשתמש µL 2 התגובה RT עבור ניתוחים qPCR.
  3. להכין תערובת התגובה qPCR באמצעי אחסון הסופי של 20 µL המורכב µL 10 מיקס מאסטר 2 x qPCR, 2 µL של תבנית cDNA, µL 1 של פריימר לפנים (10 מיקרומטר), µL 1 של פריימר הפוכה (10 מיקרומטר), ו 6 µL של מים.
  4. ביצוע qPCR התגובה thermocycler באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים21.

4. הייצור של רטרווירוס לבטא MS2-GFP

  1. כדי להפיק הרטרווירוס לביטוי MS2-GFP, transfect 80% confluent פיניקס אריזה תאים עם חלבון פיוז'ן MS2-GFP לבטא הרטרווירוס וקטור (pBabe-MS2-GFP PURO) וג'ין env להביע וקטור (כגון pCMV-VSVG) באמצעות יחס טוחנת 4:1 של שני וקטורים.
  2. למחרת, החלף המדיום culturing (DMEM בתוספת 10% FBS, 2 מ מגלוטמין ו עט/דלקת) טרי בינוני המכיל 10 מ מ נתרן butyrate.
  3. תקופת דגירה של 8 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, ולאחר מכן להחליף את המדיום טרי בינוני culturing שממנו ייאספו הוירוס.
  4. לאחר 48 שעות, הסר המדיום המכיל הרטרווירוס התאים פיניקס. בינוני ניתן להשתמש ישירות על זיהום של טרה-MS2 שיבוטים, ובמקרה לסנן המדיום דרך מסנן מיקרומטר 0.45, להוסיף polybrene (30 ריכוז סופי µg/mL) ולהוסיף אותו התאים (במקרה זה הפרוטוקול ממשיך בשלב 5). לחלופין, הרטרו וירוס יכול להיות זירז בשפופרת בז 50 מ על-ידי הוספת 1/5ה נפח של 50% פג-8000/900 מ מ פתרון NaCl המקננת בן לילה ב 4 ° C על גלגל מסובב.
  5. למחרת, גלולה חלקיקים הרטרווירוס על ידי צנטריפוגה ב g x 2,000 למשך 30 דקות, הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend בגדר F12K בינוני ללא סרום.
    הערה: יכול להיות resuspended חלקיקי וירוס ב- 1/100th של אמצעי האחסון supernatant המקורי. בדיקת זיהום יש לבצעו על מנת לוודא נפח מינימלי של רטרווירוס נדרשים ביעילות להדביק את התאים.

5. ויזואליזציה של טרה-MS2 תעתיקים בתאים חיים

  1. צלחת טרה-MS2 שיבוטים ותאים WT AGS במנות עם תחתית זכוכית. ביום של זיהום, להוסיף polybrene את המדיום (30 ריכוז סופי µg/mL) ולהבין את הרטרווירוס לביטוי MS2-GFP.
  2. לאחר 24 שעות, למחוק את המדיום המכיל וירוס ולהוסיף בינוני טריים ללא פנול אדום.
  3. לנתח את התאים במיקרוסקופ הפוך הגדרה זו מיקרוסקופ המתאים. תמונה של התאים עם 100 X או המטרה X 60 עם מפתח נומרי גדול (1.4 X), בעזרת מצלמה רגישה (EMCCD). השתמש מערכת בקרת איכות הסביבה כדי לשמור את הדוגמאות-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 במהלך דימות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור 1 מייצג סקירה כללית של האסטרטגיה ניסיוני. השלבים העיקריים של הפרוטוקול, ציר מעיד לדור של טרה-MS2 שיבוטים בתאים AGS מוצגים (איור 1א'). יום 1, בארות מרובים של צלחת טוב 6 הם transfected עם קלטת MS2, sgRNA/Cas9 לבטא וקטורים (המוצג באיור 1B). שני רצפים ספציפיים 15q מדריך RNA subtelomere שונים הם משובטים בלהביע Cas9 nickase-pX335 וקטורית, יצירת שני וקטור...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במאמר זה אנו מציגים שיטה לייצר שיבוטים תאים סרטניים אנושיים המכיל רצפי MS2 משולב בתוך subtelomere 15q. באמצעות שיבוטים אלה, מולקולות טרה מתויג MS2 עיבד מ subtelomere 15q מזוהים על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ על ידי ביטוי משותף של חלבון פיוז'ן MS2-GFP. גישה זו מאפשרת לחוקרים ללמוד את הדינמיקה של טרה הביע אחד טלומר חי תאים21. ב פרוטוקול זה, טרה-MS2 שיבוטים שנבחרו בשורה תא AGS, אשר מייצג מערכת מודל מעניין ללמוד טרה, שכן הביטוי טרה הוא upregulated דגימות סרטן הקיבה אנושי24...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים אין אינטרסים כלכליים מתחרים

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. אנחנו אסירי תודה על הסגל של המתקן הדמיה מתקדמות של CIBIO ב אוניברסיטה של טרנטו (trento), המתקן מיקרוסקופ אור BioOptics-מעבדות פרוץ פ מקס (MFPL) בווינה. המחקר שהוביל את התוצאות הללו קיבלה מימון מן Stiftung Mahlke-Obermann של תכנית המסגרת השביעית של האיחוד האירופי למחקר, פיתוח טכנולוגי, הפגנה תחת גרנט הסכם אין 609431 כדי לכלכלת EC נתמך על ידי מלגת ריטה לוי Montalcini איטלקית משרד החינוך ואוניברסיטת המחקר (MIUR).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תאי AGS-מתנה מכריסטיאן ברון (Université de Montré al).
תערובת אגוזים F12K 1XGIBCO21127022מדיום תרבית לתאי AGS
L-גלוטמין CORNINGMT25005CIרכיב של מדיום גידול תאים
תמיסת סטרפטומיצין פניציליןCORNING30-002-CIרכיב של מדיום תרבית
תאים סרום בקר עובריסיגמא אולדריץ'F2442רכיב של מדיום תרבית תאים
DMEM 1XGIBCO21068028מדיום תרבית לתאי עוף החול
CaCl2Sigma AldrichC1016משמש בטרנספקציה של תאי עוף החול
HEPESSigma AldrichH3375בשימוש בטרנספקציה של תאי פניקס (תמיסת HBS)
KClSigma AldrichP9333בשימוש בטרנספקציה של תאי פניקס (תמיסת HBS)
דקסטרוזסיגמא אולדריץ'D9434בשימוש בטרנספקציה של תאי עוף החול (תמיסת HBS)
NaClSigma AldrichS7653משמש בטרנספקציה של תאי עוף החול (תמיסת HBS) ומשקעי רטרו-וירוס
Na2HPO4Sigma AldrichS3264בשימוש בטרנספקציה של תאי פניקס (תמיסת HBS)
תמיסת TRYPSIN EDTA 1XCORNING59430Cהמשמשת בפיצול
תאים DPBS 1XGIBCO14190250פוספט חוצץ
מלח DMSOSigma AldrichD8418של Dulbeccoרכיב של מדיום הקפאת תאים (80% FBB ו-20% DMSO)
G-418 דיסולפטFormediumתרופת בחירה G4185עבור 
תמיסת ג'לטין BioreagentSigma AldrichG1393cotaing של צלחת DNA 96 באר וצלחת הקפאה
Tris-baseFisher BioReagents10376743רכיב של מאגר ליזה תאים למיצוי DNA גנומי
EDTASigma AldrichE6758רכיב של מאגר ליזה תאים למיצוי DNA גנומי
SDSSigma Aldrich71729רכיב של מאגר ליזה תאים למיצוי DNA גנומי
Proteinase KThermo FisherAM2546רכיב של מאגר ליזה של תאים למיצוי DNA גנומי
RNAse AThermo Fisher12091021פירוק RNA במהלך מיצוי DNA
AgaroseSigma AldrichA5304הכנת ג'ל DNA
Atlas ClearSightBioatlasBH40501מגיב כתמים המשמש לזיהוי דגימות DNA ו-RNA בג'ל אגרוז
אתנולפישר ביו-ריאגנטיםBP28184משקעי DNA
נתרן אצטט סיגמא אולדריץ'71196משמש למשקעי DNA בריכוז 3M pH5.2
אשף SV ג'ל ומערכת ניקוי PCRPromegaA9282מיצוי שברי PCR מג'ל אגרוז במהלך בדיקת PCR של שיבוטים חיוביים לניאומיצין
TrizolAMBION15596018ממס אורגני המשמש למיצוי RNA
Dnase ITHERMO SCIENTIFIC89836פירוק DNA גנומי מ-RNA 
dNTPs מערבביםInvitrogen10297018המשמש בתגובות RT ו-PCR
DTTInvitrogen707265MLהמשמש בתגובות RT
דיאתיל פירוקרבונטSigma AldrichD5758המשמש לנטרול RNAs במים (דילול 1:1000)
RibolockThermo FisherEO0381מעכב RNase
MOPSSigma AldrichM9381הכנת ג'ל RNA
ParaformaldehydeElectron Microscopy Sciences15710הכנת ג'ל RNA דנטורציה (1% PFA ב-1x MOPS)
Superscript III Reverse transcriptaseInvitrogen18080-093תגובת רטרו-שעתוק
Pfu DNA פולימראז (רקומביננטי)Thermo ScientificEP0501תגובת PCR
2X qPCRBIO SyGreen Mix Separate-ROXPCR תגובת BIOSYSTEMSPB 20.14qPCR
Cre-GFP adenovirushttps://medicine.uiowa.edu/vectorcore1174-HTמשמש להדבקת שיבוטי TERRA-MS2 על מנת להסיר את הגן neomycn
נתרן בוטיראטסיגמא אולדריץ'B5887המשמש לקידום ייצור חלקיקי רטרו-וירוס בתאי עוף החול
PEG8000סיגמא אולדריץ'89510משקעים של חלקי רטרו-וירוס
35µ-Dish Glass BottomIbidi81158משמש בניתוחי הדמיית תאים חיים של שיבוטי TERRA-MS2

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Azzalin, C. M., Reichenbach, P., Khoriauli, L., Giulotto, E., Lingner, J. Telomeric repeat containing RNA and RNA surveillance factors at mammalian chromosome ends. Science. 318 (5851), 798-801 (2007).
  2. Schoeftner, S., Blasco, M. A. Developmentally regulated transcription of mammalian telomeres by DNA-dependent RNA polymerase II. Nature Cell Biology. 10 (2), 228-236 (2008).
  3. Diman, A., Decottignies, A. Genomic origin and nuclear localization of TERRA telomeric repeat-containing RNA: from Darkness to Dawn. FEBS Journal. , (2017).
  4. Arnoult, N., Van Beneden, A., Decottignies, A. Telomere length regulates TERRA levels through increased trimethylation of telomeric H3K9 and HP1alpha. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (9), 948-956 (2012).
  5. Montero, J. J., et al. TERRA recruitment of polycomb to telomeres is essential for histone trymethylation marks at telomeric heterochromatin. Nature Communications. 9 (1), 1548(2018).
  6. Beishline, K., et al. CTCF driven TERRA transcription facilitates completion of telomere DNA replication. Nature Communications. 8 (1), 2114(2017).
  7. Arora, R., et al. RNaseH1 regulates TERRA-telomeric DNA hybrids and telomere maintenance in ALT tumour cells. Nature Communications. 5, 5220(2014).
  8. Balk, B., et al. Telomeric RNA-DNA hybrids affect telomere-length dynamics and senescence. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (10), 1199-1205 (2013).
  9. Graf, M., et al. Telomere Length Determines TERRA and R-Loop Regulation through the Cell Cycle. Cell. 170 (1), 72-85 (2017).
  10. Lee, Y. W., Arora, R., Wischnewski, H., Azzalin, C. M. TRF1 participates in chromosome end protection by averting TRF2-dependent telomeric R loops. Nature Structural & Molecular Biology. , (2018).
  11. Moravec, M., et al. TERRA promotes telomerase-mediated telomere elongation in Schizosaccharomyces pombe. EMBO Reports. 17 (7), 999-1012 (2016).
  12. Cusanelli, E., Romero, C. A., Chartrand, P. Telomeric noncoding RNA TERRA is induced by telomere shortening to nucleate telomerase molecules at short telomeres. Molecular Cell. 51 (6), 780-791 (2013).
  13. Moradi-Fard, S., et al. Smc5/6 Is a Telomere-Associated Complex that Regulates Sir4 Binding and TPE. PLoS Genetics. 12 (8), e1006268(2016).
  14. Chu, H. P., et al. TERRA RNA Antagonizes ATRX and Protects Telomeres. Cell. 170 (1), 86-101 (2017).
  15. Lai, L. T., Lee, P. J., Zhang, L. F. Immunofluorescence protects RNA signals in simultaneous RNA-DNA FISH. Experimental Cell Research. 319 (3), 46-55 (2013).
  16. Zhang, L. F., et al. Telomeric RNAs mark sex chromosomes in stem cells. Genetics. 182 (3), 685-698 (2009).
  17. Gallardo, F., Chartrand, P. Visualizing mRNAs in fixed and living yeast cells. Methods in Molecular Biology. 714, 203-219 (2011).
  18. Querido, E., Chartrand, P. Using fluorescent proteins to study mRNA trafficking in living cells. Methods in Cell Biology. 85, 273-292 (2008).
  19. Cusanelli, E., Chartrand, P. Telomeric noncoding RNA: telomeric repeat-containing RNA in telomere biology. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 5 (3), 407-419 (2014).
  20. Perez-Romero, C. A., Lalonde, M., Chartrand, P., Cusanelli, E. Induction and relocalization of telomeric repeat-containing RNAs during diauxic shift in budding yeast. Current Genetics. , (2018).
  21. Avogaro, L., et al. Live-cell imaging reveals the dynamics and function of single-telomere TERRA molecules in cancer cells. RNA Biology. , 1-10 (2018).
  22. Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).
  23. Yamada, T., et al. Spatiotemporal analysis with a genetically encoded fluorescent RNA probe reveals TERRA function around telomeres. Scientific Reports. 6, 38910(2016).
  24. Deng, Z., et al. Formation of telomeric repeat-containing RNA (TERRA) foci in highly proliferating mouse cerebellar neuronal progenitors and medulloblastoma. Journal of Cell Science. 125 (Pt 18), 4383-4394 (2012).
  25. Casini, A., et al. A highly specific SpCas9 variant is identified by in vivo screening in yeast. Nature Biotechnology. 36 (3), 265-271 (2018).
  26. Nergadze, S. G., et al. CpG-island promoters drive transcription of human telomeres. RNA. 15 (12), 2186-2194 (2009).
  27. Porro, A., et al. Functional characterization of the TERRA transcriptome at damaged telomeres. Nature Communications. 5, 5379(2014).
  28. Farnung, B. O., Brun, C. M., Arora, R., Lorenzi, L. E., Azzalin, C. M. Telomerase efficiently elongates highly transcribing telomeres in human cancer cells. PLoS One. 7 (4), e35714(2012).
  29. Flynn, R. L., et al. Alternative lengthening of telomeres renders cancer cells hypersensitive to ATR inhibitors. Science. 347 (6219), 273-277 (2015).
  30. Scheibe, M., et al. Quantitative interaction screen of telomeric repeat-containing RNA reveals novel TERRA regulators. Genome Research. 23 (12), 2149-2157 (2013).
  31. Bolland, D. J., King, M. R., Reik, W., Corcoran, A. E., Krueger, C. Robust 3D DNA FISH using directly labeled probes. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
  32. Masui, O., et al. Live-cell chromosome dynamics and outcome of X chromosome pairing events during ES cell differentiation. Cell. 145 (3), 447-458 (2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

TERRAMS2 GFPRNA FISHTRF2 mCherry

מאמרים קשורים