כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצירת סרטן התא שיבוטים המכיל תגית רצף MS2 ב subtelomere יחיד. גישה זו, בהסתמך על מערכת MS2-GFP, מאפשרת הדמיה של התרשימים אנדוגני של telomeric המכילים חוזר RNA (TERRA) הביע מ טלומר יחיד בתאים חיים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הדור של סרטן התא שיבוטים כדי להמחיש Telomeric המכילים חוזר RNA טרה הביע מ טלומר יחיד בתאים חיים
במאמר זה
סיכום
תקציר
טלומרים משוקלטים, והוליד telomeric המכילים חוזר זמן noncoding RNAs (TERRA), אשר הוצעו כדי לשחק תפקידים חשובים בביולוגיה טלומר, כולל היווצרות הטרוכרומטין טלומר אורך הומאוסטזיס. הממצאים האחרונים גילה כי מולקולות טרה גם לקיים אינטראקציה עם אזורים פנימיים כרומוזומלית להסדיר ביטוי גנים בתאי גזע עובריים (ES) העכבר. בקנה אחד עם הראיות, קרינה פלואורסצנטית RNA ניתוחים בחיי עיר הכלאה (RNA-דג) הראו כי רק תת-ערכה של טרה תעתיקים לשפה קצותיו כרומוזום. הבנה טובה יותר של הדינמיקה של מולקולות טרה נעזור להגדיר פונקציה ואת מנגנוני הפעולה שלהם. כאן, אנו מתארים שיטה כדי לתייג והמחש יחיד-טלומר תעתיקים טרה בתאי סרטן באמצעות מערכת MS2-GFP. לכוונה זו, אנו מציגים פרוטוקול כדי ליצור שיבוטים יציב, באמצעות AGS שהבטן האנושית סרטן תא קו, המכיל רצפי MS2 משולב ב subtelomere יחיד. תמלול של טרה מ טלומר מתויג MS2 תוצאות הביטוי של מולקולות מתויג MS2 טרה הם דמיינו ידי קרינה פלואורסצנטית לחיות תאים במיקרוסקופ על ביטוי משותף של חלבון מחייב MS2 RNA דבוקה GFP (MS2-GFP). גישה זו מאפשרת לחוקרים ללמוד את הדינמיקה של יחיד-טלומר טרה מולקולות בתאים סרטניים, ניתן להחיל אותה על שורות תאים אחרים.
מבוא
טרה RNA noncoding זמן הוא עיבד מאזור subtelomeric של כרומוזומים, שעתוק שלה ההכנסות לכיוון הקצוות כרומוזום, הפסקת בתוך בדרכי. אני חוזר telomeric1,2. מסיבה זו, טרה תעתיקים מורכב subtelomeric, נגזר רצפים בסוף 5' ולסיים עם telomeric חזרה (UUAGGG גולגולת)3. חשוב תפקידי הוצעו על TERRA, כולל הטרוכרומטין היווצרות-טלומרים4,5, ה-DNA שכפול6, קידום רקומבינציה הומולוגית בין כרומוזום מסתיים7,8 , 9, ויסות טלומר מבנה
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הבחירה של שיבוטים Neomycin עמיד
- לגדל תאים AGS במדיום F-12_K של חזיר (Kaighn), בתוספת 10% עוברית שור סרום (FBS), 2 מ מגלוטמין פניצילין (0.5 יחידות לכל מיליליטר בינוני), סטרפטומיצין (0.2 µg לכל מיליליטר בינונית)-CO 37 ° C ו-5%2. Transfect התאים ב- 50-60% בשילוב עם sgRNA/Cas9 להביע וקטור, בקלטת MS2 בעשר: 1 יחס טוחנת21.
הערה: בניסוי מקביל, לאמת תרביות תאים יעילות על ידי transfecting GFP-להביע וקטור (קרי, Cas9-GFP וקטורית). לפחות צריך להיות מושגת יעילות תרביות תאים 60-70%. - למחרת, החלף את המדיום culturing בינוני המכיל neomycin-µg/mL 0.7 הסופי ריכוז (סלקטיבית בינוני).
הערה: פיצול התאים, זריעה אותם אמצעי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
איור 1 מייצג סקירה כללית של האסטרטגיה ניסיוני. השלבים העיקריים של הפרוטוקול, ציר מעיד לדור של טרה-MS2 שיבוטים בתאים AGS מוצגים (איור 1א'). יום 1, בארות מרובים של צלחת טוב 6 הם transfected עם קלטת MS2, sgRNA/Cas9 לבטא וקטורים (המוצג באיור 1B). שני רצפים ספציפיים 15q מדריך RNA subtelomere שונים הם משובטים בלהביע Cas9 nickase-pX335 וקטורית, יצירת שני וקטור.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
במאמר זה אנו מציגים שיטה לייצר שיבוטים תאים סרטניים אנושיים המכיל רצפי MS2 משולב בתוך subtelomere 15q. באמצעות שיבוטים אלה, מולקולות טרה מתויג MS2 עיבד מ subtelomere 15q מזוהים על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ על ידי ביטוי משותף של חלבון פיוז'ן MS2-GFP. גישה זו מאפשרת לחוקרים ללמוד את הדינמיקה של טרה הביע אחד טלומר חי תאים21. ב פרוטוקול זה, טרה-MS2 שיבוטים שנבחרו בשורה תא AGS, אשר מייצג מערכת מודל מעניין ללמוד טרה, שכן הביטוי טרה הוא upregulated דגימות סרטן הקיבה אנושי24.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים אין אינטרסים כלכליים מתחרים
תודות
. אנחנו אסירי תודה על הסגל של המתקן הדמיה מתקדמות של CIBIO ב אוניברסיטה של טרנטו (trento), המתקן מיקרוסקופ אור BioOptics-מעבדות פרוץ פ מקס (MFPL) בווינה. המחקר שהוביל את התוצאות הללו קיבלה מימון מן Stiftung Mahlke-Obermann של תכנית המסגרת השביעית של האיחוד האירופי למחקר, פיתוח טכנולוגי, הפגנה תחת גרנט הסכם אין 609431 כדי לכלכלת EC נתמך על ידי מלגת ריטה לוי Montalcini איטלקית משרד החינוך ואוניברסיטת המחקר (MIUR).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| תאי AGS | - | מתנה מכריסטיאן ברון (Université de Montré al). | |
| תערובת אגוזים F12K 1X | GIBCO | 21127022 | מדיום תרבית לתאי AGS |
| L-גלוטמין | CORNING | MT25005CI | רכיב של מדיום גידול תאים |
| תמיסת סטרפטומיצין פניצילין | CORNING | 30-002-CI | רכיב של מדיום תרבית |
| תאים סרום בקר עוברי | סיגמא אולדריץ' | F2442 | רכיב של מדיום תרבית תאים |
| DMEM 1X | GIBCO | 21068028 | מדיום תרבית לתאי עוף החול |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016 | משמש בטרנספקציה של תאי עוף החול |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | בשימוש בטרנספקציה של תאי פניקס (תמיסת HBS) |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | בשימוש בטרנספקציה של תאי פניקס (תמיסת HBS) |
| דקסטרוז | סיגמא אולדריץ' | D9434 | בשימוש בטרנספקציה של תאי עוף החול (תמיסת HBS) |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | משמש בטרנספקציה של תאי עוף החול (תמיסת HBS) ומשקעי רטרו-וירוס |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | S3264 | בשימוש בטרנספקציה של תאי פניקס (תמיסת HBS) |
| תמיסת TRYPSIN EDTA 1X | CORNING | 59430C | המשמשת בפיצול |
| תאים DPBS 1X | GIBCO | 14190250 | פוספט חוצץ |
| מלח DMSO | Sigma Aldrich | D8418 | של Dulbeccoרכיב של מדיום הקפאת תאים (80% FBB ו-20% DMSO) |
| G-418 דיסולפט | Formedium | תרופת בחירה G4185 | עבור |
| תמיסת ג'לטין Bioreagent | Sigma Aldrich | G1393 | cotaing של צלחת DNA 96 באר וצלחת הקפאה |
| Tris-base | Fisher BioReagents | 10376743 | רכיב של מאגר ליזה תאים למיצוי DNA גנומי |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6758 | רכיב של מאגר ליזה תאים למיצוי DNA גנומי |
| SDS | Sigma Aldrich | 71729 | רכיב של מאגר ליזה תאים למיצוי DNA גנומי |
| Proteinase K | Thermo Fisher | AM2546 | רכיב של מאגר ליזה של תאים למיצוי DNA גנומי |
| RNAse A | Thermo Fisher | 12091021 | פירוק RNA במהלך מיצוי DNA |
| Agarose | Sigma Aldrich | A5304 | הכנת ג'ל DNA |
| Atlas ClearSight | Bioatlas | BH40501 | מגיב כתמים המשמש לזיהוי דגימות DNA ו-RNA בג'ל אגרוז |
| אתנול | פישר ביו-ריאגנטים | BP28184 | משקעי DNA |
| נתרן אצטט | סיגמא אולדריץ' | 71196 | משמש למשקעי DNA בריכוז 3M pH5.2 |
| אשף SV ג'ל ומערכת ניקוי PCR | Promega | A9282 | מיצוי שברי PCR מג'ל אגרוז במהלך בדיקת PCR של שיבוטים חיוביים לניאומיצין |
| Trizol | AMBION | 15596018 | ממס אורגני המשמש למיצוי RNA |
| Dnase I | THERMO SCIENTIFIC | 89836 | פירוק DNA גנומי מ-RNA |
| dNTPs מערבבים | Invitrogen | 10297018 | המשמש בתגובות RT ו-PCR |
| DTT | Invitrogen | 707265ML | המשמש בתגובות RT |
| דיאתיל פירוקרבונט | Sigma Aldrich | D5758 | המשמש לנטרול RNAs במים (דילול 1:1000) |
| Ribolock | Thermo Fisher | EO0381 | מעכב RNase |
| MOPS | Sigma Aldrich | M9381 | הכנת ג'ל RNA |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | הכנת ג'ל RNA דנטורציה (1% PFA ב-1x MOPS) |
| Superscript III Reverse transcriptase | Invitrogen | 18080-093 | תגובת רטרו-שעתוק |
| Pfu DNA פולימראז (רקומביננטי) | Thermo Scientific | EP0501 | תגובת PCR |
| 2X qPCRBIO SyGreen Mix Separate-ROX | PCR תגובת BIOSYSTEMS | PB 20.14 | qPCR |
| Cre-GFP adenovirus | https://medicine.uiowa.edu/vectorcore | 1174-HT | משמש להדבקת שיבוטי TERRA-MS2 על מנת להסיר את הגן neomycn |
| נתרן בוטיראט | סיגמא אולדריץ' | B5887 | המשמש לקידום ייצור חלקיקי רטרו-וירוס בתאי עוף החול |
| PEG8000 | סיגמא אולדריץ' | 89510 | משקעים של חלקי רטרו-וירוס |
| 35µ-Dish Glass Bottom | Ibidi | 81158 | משמש בניתוחי הדמיית תאים חיים של שיבוטי TERRA-MS2 |
מקורות
- Azzalin, C. M., Reichenbach, P., Khoriauli, L., Giulotto, E., Lingner, J. Telomeric repeat containing RNA and RNA surveillance factors at mammalian chromosome ends. Science. 318 (5851), 798-801 (2007).
- Schoeftner, S., Blasco, M. A.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
