מבחני עבור קצב צמיחה ספציפיים והיכולת תא-איגוד של בנגיף

וירוסי RNA טופס אוכלוסייה מגוונת מבחינה גנטית, המכונה קווסי-זנים¹, בגלל קצב מוטציה שלהם,² אשר הוא גבוה מזה של אורגניזמים מבוסס DNA. מבנה האוכלוסייה קווסי-זנים מושפע על ידי גורמים גנטיים האוכלוסייה, כולל המוטציה, לחץ לבחירה של סחף גנטי. זנים בתוך שושלת גנטי יחיד עשוי להראות פנוטיפים שונים בגלל המגוון הגנטי. לדוגמה, Rachmadi et al. הראה כי רגישות כלור חופשי היה שונה בין זנים norovirus מאתר כי מקורם זן טהור-פלאק S7-PP3³.

Rotaviruses (סוג בנגיף במשפחה reoviridae) הם וירוסים ds שאינו אפוף RNA ויוצרים קווסי-זנים². בנוסף האוכלוסייה גורמים גנטיים שתוארו לעיל, הגנום reassortment משפיע המגוון הגנטי של בנגיף כי וירוס זה יש הגנום מקוטע 11⁴. Rotaviruses לגרום לשלשולים בעיקר בקרב תינוקות, פטירות בשנת 2013 הוערך על 250,000⁵. שני חיסונים נמצאים בשימוש בכמה מדינות, הוכחו כיעילים בהפחתת הנטל של זיהום בנגיף, אבל יש חוקרים דנים עכשיו הנוכחות של חיסון-לברוח מוטציות^{6,7,8, 9}. אפיון המוטנטים האלה חשוב להבין את מנגנוני החיסון-לברוח.

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים עבור שני מבחני להעריך את קצב צמיחה ספציפיים והיכולת תא-איגוד של בנגיף כדי להבין את ההבדלים פנוטיפי בין זנים/מוטציות. עקומת הגדילה של rotaviruses הוצגו בדוחות קודמים¹⁰, אך הצמיחה פרמטרים כגון קצב צמיחה ספציפיים לא נמדדים בדרך כלל. וזמינותו מחייב תא שנערכו בעבר כרוך טכניקת צביעת immunofluorescent¹¹. אנו מראים כאן קל יותר שיטות של שימוש assay פלאק ו RT-qPCR, אשר מאפשרים לנו לדון באופן כמותי את ההבדל בין פנוטיפים ויראלי. שיטות אלה מתאימות אפיון פנוטיפים בנגיף, יכול לתרום בסופו של דבר לבנייה של חיסונים חדשים יעילים אחרים מרובים.

1. הכנה בינונית

1. כדי להפוך את מדיום התרבות התא (סרום המכיל בינוני), להוסיף 4.7 g של הנשר MEM אבקת 500 מ ל מים מזוקקים. אוטוקלב ב 120 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות ולתת הקריר בינוני לטמפרטורת החדר. להוסיף סרום שור עוברית (הריכוז הסופי: 10%),-גלוטמין (2 מ מ), סטרפטומיצין פניצילין (1%), סודיום ביקרבונט (1.125 g/L). לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס במשך חודש.
2. היכונו המדיום ללא סרום התפשטות וירוס כפי שמתואר בשלב 1.1, אך ללא שור הסרום העובר. לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס במשך חודש.
3. עבור וזמינותו פלאק, לעקר 100 מ של MEM בינוני הנשר (שאינם המכילות פנול אדום) על ידי autoclaving. תן המדיום להתקרר לטמפרטורת החדר, ולאחר מכן להוסיף 2% FBS, 2% פניצילין סטרפטומיצין, 4 מ מגלוטמין, ו 2.25 g/L NaHCO₃. חנות ב 4 º C.
4. עבור וזמינותו פלאק, לעקר 100 מ של 2.5% ג'ל agarose על ידי תא לחץ. הכינו את הג'ל באותו יום שוזמינותו פלאק מתנהל. אחסן את הג'ל ב 47 ° C בתוך אמבט מים.

2. תרבית תאים

1. להסיר cryotube המכיל שורות תאים MA104 מהגורם המכיל חנקן נוזלי. מניחים את cryotube באמבט מים בטמפרטורה 37 ° C כדי להפשיר את התאים. להוסיף 1 מ"ל של התליה תא 20 מ"ל של המדיום המכיל סרום בבקבוקון T75. תקופת דגירה. הבקבוק באינקובטור 37 ° C ו- 5% CO₂ של 2-3 ימים.
   הערה: הריכוז הסופי תא ההשעיה היא כ- 10⁶ תאים למ"ל.
2. ברגע טפט התא מגיע 80% confluency, להסיר את תגובת שיקוע ולשטוף את התאים פעמיים עם 5 מ של 1 x של Dulbecco PBS (buffered פוספט תמיסת מלח).
3. להוסיף 4 מ של 0.05% טריפסין-EDTA הבקבוק, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות לנתק את התאים מן הבקבוק. העברת התליה תא צינור 15 מ"ל ו צנטריפוגה ב 190 x g במשך 5 דקות.
4. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend תאי pelleted (10⁶ תאים) 1 מ"ל של סרום המכיל 1.1 מוכן בבינוני. לדלל את התאים resuspended ב 100-fold עם המדיום.
5. להוסיף 3 מ"ל של התליה תא מדולל כל טוב של 6-טוב (של וזמינותו פלאק) או 24-ובכן לוחות (עבור התא-איגוד וזמינותו), בהתאמה. תקופת דגירה הלוחות באינקובטור 37 ° C ו- 5% CO₂ תחת רווי האדים של 2-3 ימים.
   הערה: בקבוקון T75 מתאימה לאסוף דגימות זמן-קורס כי היקף המדגם תגובת שיקוע (1 מ"ל) ניתן להתעלם בהשוואה לאמצעי האחסון supernatant סה כ (30 מ ל). בינתיים, כייל זיהומיות של הנגיף בתוך כל תגובת שיקוע נמדד על ידי וזמינותו פלאק, אשר מתבצע בדרך כלל באמצעות צלחת 6-. טוב. צלחת 24-ובכן מנוצל עבור התא-איגוד וזמינותו.

3. קצב הגידול הספציפי בנגיף

הערה: רזוס בנגיף (RRV, גנוטיפ: G3P[3]) הוא מנוצל ב פרוטוקול זה בגלל RRV יכולים במהירות ובקלות ליצור לוחות עם תאים MA104.

1. המקום שפופרת המכילה 1 מ"ל של וירוסים ההשעיה (10⁷ pfu/mL) במדיום נטול סרום המאוחסנים ב- 80 ° C באמבט מים בטמפרטורה 37 ° C כדי להפשיר. להוסיף 1 µg/µL טריפסין מן הלבלב חזירי 1 מ"ל של וירוסים ההשעיה (ריכוז טריפסין הסופי הוא 4 µg/mL) ולאחר מכן מערבולת. דגירה ההשעיה וירוס-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ תחת רווי האדים למשך 30 דקות.
   הערה: טריפסין ממקורות אחרים יכול לשמש, אבל ההשפעה על infectivity בנגיף צריך להבדק מראש.
2. לדלל את המתלים וירוס מופעל עם מדיום ללא סרום כדי להתאים את הריבוי של זיהום (MOI) pfu 0.1/תא.
3. הוספת 1 מ"ל של וירוס מדולל השעיה שורות תאים MA104 (80% confluent) בבקבוקון T75 3 ימים לאחר התא ציפוי (2.1), דגירה ב 37 ° C עבור 1 h, לנער בעדינות את הבקבוק כל 15 דקות.
4. לאחר מכן, להוסיף 30 מ של מדיום ללא סרום המכיל µg/mL 0.13 של טריפסין מ לבלב חזירי הבקבוקון. דגירה. הבקבוק-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ תחת רווי האדים.
5. לאסוף 1 מ"ל של תגובת שיקוע של הבקבוק-0, 6, 12, 18, 24, 36 (או 48) h לאחר הפגיעה (מדד מחירי הבתים. של) ולהחליף את תגובת שיקוע צינורות 1.5 mL באמצעות פיפטה.
6. לנהל מדיניות ההקפאה (-80 מעלות צלזיוס), להמיס בתוך אמבט המים-מחזור 37 ° C שלוש פעמים. ואז centrifuge הצינורות ב x 12,600 g 10 דקות ב 4 º C. לאסוף את תגובת שיקוע.
7. לסנן את תגובת שיקוע עם מסנן מזוקקים 0.2 µm כדי להסיר את השבר תאים. לאחסן את supernatant-80 ° C במקרר עד החלתו על וזמינותו פלאק למדידת כייל את הוירוס.
8. מקום הצינורות המכילים את שנאספו תגובת שיקוע (שלב 3.5) באמבט מים בטמפרטורה 37 º c להוסיף 4 µg/mL טריפסין 1 מ ל 10-fold מדגם מדולל, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
9. במהלך 30 דקות ב- 3.8, כדי להתחיל וזמינותו פלאק למדידת כייל את וירוס המתקבל בזמן הקורס דגימות (שלב 3.5), לשטוף את התאים MA104 פעמיים בצלחת 6-ובכן עם 2 מ של 1 x PBS לאחר הסרת המדיום המכיל סרום.
10. באופן סדרתי לדלל את הדגימות incubated עם מדיום ללא סרום, לחסן 1 מ"ל של המדגם מדולל כל טוב. דגירה את הצלחת במשך 90 דקות ב 37 ° C ו- 5% CO₂ תחת רווי האדים, ומנערים בעדינות את הצלחת כל 15 דקות.
11. לאחר דגירה, הסר את inoculum הצלחת 6-. טוב. להוסיף 4 µg/mL טריפסין המדיום המבושלות (שלב 1.3). בעדינות אך מיד להוסיף 3 מ"ל של המדיום מעורבב עם ג'ל agarose (היחס הוא 1:1) כל טוב.
12. לשמור את הצלחת בטמפרטורת החדר במשך יותר מ 10 דקות (עד agarose הג'ל הופך מוצק), תקופת דגירה של 2 ימים ב- 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ תחת רווי האדים.
    הערה: שופכים את המדיום מעורבב עם אגר מהקצה של הבאר.
13. להוסיף 1 מ"ל של 0.015% נייטרלי אדום הפתרון מדולל עם PBS 1 x כדי מכל קידוח, דגירה-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ תחת רווי האדים. הסר לצבוע לאחר 3 שעות ולאחר תקופת דגירה של יום 1-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ תחת רווי האדים.
14. למחרת, לספור את מספר לוחות מכל קידוח ולחשב pfu/mL. בדוק המפגש תא לפני וזמינותו פלאק כדי להבטיח את המספרים פלאק.

4. תא-איגוד וזמינותו

הערה: פרוטוקול זה מבוסס על הדו ח של Gilling¹³.

1. להוסיף 1 טריפסין µg/µL מ לבלב חזירי 1 מ"ל של וירוסים ההשעיה (ריכוז טריפסין הסופי הוא 4 µg/mL) ולאחר מכן מערבולת (באופן זהה כמו 2.1). לדלל את המתלים וירוס עם מדיום ללא סרום כדי להתאים למשרד הפנים של pfu 1/תא.
2. לאחר מכן, לשטוף את התאים MA104 פעמיים על צלחת 24-ובכן עם 1 מ ל תמיסת באגירה טריס (TBS; 2.53 g/L טריס לבסס, 6.54 g/L NaCl, 0.3 g/L, אשלגן כלורי 0.046 g/l נה₂HPO₄ להגיע 1 ליטר עם מים מזוקקים).
3. לחסן µL 100 של וירוס מדולל השעיה על כל טוב של צלחת 24-ובכן עם תאים, דגירה ב 4 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות, עם עדין רועדות מדי 15 דקות.
4. להסיר את inoculum וירוס. ולשטוף את התאים פעמיים עם 1 מ"ל של TBS. כדי לחלץ את הכפול גדילי (ds) RNA של בנגיף, להוסיף µL 140 1 x PBS ו µL 560 המאגר החילוץ RNA (ראה טבלה של חומרים) כדי מכל קידוח. מערבבים בצורה הולמת עם פיפטה (על 10 x או עד ערפל או מזהם של תאים במאגר לא ראיתי).
5. לאחר שהתאושש RNA נטושים כפול (dsRNA) על פי הפרוטוקול של היצרן, מקום הצינורות 1.5 mL בתמצית dsRNA על גוש חום ב 95 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות כדי denature את dsRNA, ואז מיד במקום הצינורות על קרח, תקופת דגירה של יותר מ 2 min.
6. לסנתז את cDNA באמצעות תיעוד הפוכה קיט (ראה טבלה של חומרים). להוסיף 4 µL של שפגע בסימני פתרון ה-RNA נגיפי צינור PCR המכיל 16 µl של תערובת (טבלה 1) ולערבב בזהירות עם פיפטה כדי לא ליצור בועות. ספין לטמיון.
7. לבצע את שעתוק במהופך עם הצנטרפוגה תרמי תחת התנאי שמוצג בטבלה 2. אם cDNA אינו בשימוש מיד, אחסן את הצינור PCR המכיל את cDNA ב-20 ° C עד 1 שנה.
8. לשימוש תחל את ה-PCR כמותי (קדמי; 5'-ACCATCTACACATGACCCTC-3', הפוך; 5'-GGTCACATAACGCCCC-3')¹⁴ ובדיקה הוספה של כ'חטיף (qPCR הגששים; 5'- / אחי/ATGAGCACA/כ'חטיף/ATAGTTAAAAGCTAACACTGTCAA/טמרה/3 "), מיקוד 963 – 1049 אזור של NSP3 קטע הגנום של בנגיף (ST3 זן, GenBank: X81436).
   הערה: כ'חטיף מוכנס לתוך המכשיר עוצב על ידי Zeng ואח¹⁴
9. לדלל את פלסמיד רגיל באופן סדרתי (10¹ עד 10⁶ עותקים/mL) עם ה-PCR כיתה מים לתערובת qPCR (טבלה 3) ולהפוך את תערובת הבסיס (20 µL לדוגמה) עבור qPCR בעקבות בטבלה 4.
10. להוסיף 20 µL של המיקס אב אל הבאר של צלחת PCR 96-ובכן, ואז לערבב µL 5 דוגמאות cDNA או µL 5 של פלסמיד סטנדרטי על ידי pipetting 10 פעמים. להתחיל את התגובה של המערכת qPCR בהתאם לתנאים המוצגים בטבלה4.
11. כדי לחשב את הגנום בנגיף שמאוגד אל פני השטח תא MA104, לבצע רגרסיה ליניארית בין ערכים Ct מספר הגנום הידועים פלסמיד רגיל ולאחר הערכת מספר הגנום של המדגם. ואז לחשב את היחס שבין איגוד virion מספרים על תאים (G_t) לאלו inoculum הראשונית (G₀).

סקירה כללית של שני פרוטוקולים עבור קצב צמיחה ספציפיים ותא-איגוד וזמינותו של פלאק-מטוהר RRV זנים מוצג איור 1A ו- 2A, בהתאמה.

ב וזמינותו עבור שיעור צמיחה ספציפיים, כייל וירוס הסופי מגיע ליותר מ-107 pfu/mL בעת הפצת על הבקבוק T75. אם הריכוז המרבי הוא נמוך יותר מאשר pfu7 10/mL, התא MA104 לא הפכה confluent או RRV לא הופעלה על ידי טריפסין. דגמים גדילה זמינים עבור הערכת קצב צמיחה ספציפיים באמצעות הנתונים יחידת זיהומיות. ב פרוטוקול זה, ששונה Gompertz דגם12 הוא מועסק בתור דוגמה;

איפה N0 (104 pfu/mL במחקר זה) ו- Nt (104 כדי8 10 pfu/mL) הן וירוסים זיהומיות כייל נוגדנים (pfu/mL)-0 ו- t (דוגמה: 0, 6, 12, 18, 24, 36) מדד מחירי הבתים של, בהתאמה, A הוא הערך אסימפטוטית [יומן (N∞/N0 )] (לדוגמה: 3-4) ממוצע הצמיחה מסוים [1/h], e הוא קבוע נפייר, λ הוא תקופת השהיה [h]. מודל פרמטרים מתקבלים על-ידי הפונקציה solver של תוכנת ניתוח, אשר מצמצם את הסכום של ריבועים של ההפרש בין הערכים שנמדדו ו מעוצבת. בדוגמה איור 1B, קצב צמיחה ספציפיים (ממוצע) מוערך 0.197 [1/h] ואת תקופת השהיה (λ) היא 6.61 [h] על-ידי החלת שיטת לפחות מרובע דגם Gompertz שונה, כייל את וירוס היחסי בשלב נייח כדי (כייל הראשונית סולם לוגריתמי) (א) הוא 3.15 [יומן (N∞/N0)]. בדקנו 6 שיבוטים בנגיף סה כ, הערכים המשוערים של קצב צמיחה ספציפיים נע מ 0.19 אל 0.27 [1/h]. אלה מעריכים ערכים אמינים כי המקדם של קביעת הערכים מודל ההתאמה היא יותר 0.98.

Virions RRV מחייב את התא משטחים היו כ- 103 עותקים/mL (מחייב יעילות היה בסביבות 1%) בעת השימוש צלחת 24-טוב עבור התא-איגוד וזמינותו (איור 2B). וזמינותו מתנהל בדרך כלל שלוש פעמים עבור כל דגימה, אם שונות גדולה במספר עותק נצפית במדגם, עלולות להתרחש בעיות כגון שטיפת יתר על המידה ובלתי מספקת הפעלה של RRV על ידי טריפסין. הערך Ct qPCR העולה על דעתך 36.0 לא עדיפה, נחשב להיות מתחת למגבלה זיהוי במצב שלנו qPCR.

טבלה 1: מאסטר מערבבים הרכב של cDNA סינתזה של הגנום בנגיף.

טבלה 2: תגובת מצב של סינתזה cDNA של הגנום בנגיף.

טבלה 3: מאסטר מערבבים הרכב עבור ה-PCR כמותי של בנגיף הגנום.

טבלה 4: תגובת מצב עבור ה-PCR כמותי של בנגיף הגנום.

איור 1: סקירה סכמטי של הערכת צמיחת בנגיף, עקומת הגדילה של בנגיף. (א) יחידת זיהומיות בנגיף נמדד עם רובד וזמינותו. (B) העיקול (קו כחול) הייתה לקרב את ערכיהן על ידי מודל Gompertz שונה על סמך נתונים שנצפו במעבדה שלנו (עיגול לבן). קצב הגידול הספציפי [?]; 0.197 [h-1], השהיה נקודה (λ); 6.61 [h], כייל וירוס היחסי בשלב נייח כדי כייל נוגדנים הראשונית (יומן סולם) (א); 3.15 [יומן (N∞/N0)]. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2: סקירה סכמטית והתוצאה נציג של התא-איגוד וזמינותו של חמישה זנים RRV מכל שלטי במעבדה שלנו. (א) A-תא-תרבות-הצלחת מחוסן עם בנגיף מודגרת ב 4 ° C עבור מעכבות את הפלישה וירוס לתוך תאים. לאחר דגירה, הסרת את חלקיקי נגיפי לא מאוגד לתאים, לכמת את המספר של הגנום שמקורם נגיפים מאוגד השטח תא עם RT-qPCR. (B) התוצאה של האיגוד התא assay היה להציג מחייב יעילות (%), אשר היה היחס של נגיפים מאוגדים אלה נוכח inoculum. נועז בר: חציון, סוף תיבות: סטיית הרביעון, הסופית: מינימלי ומקסימלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

המחברים אין לחשוף.